材料和方法
抗体和抑制剂
抗PC-1抗体已在前面描述(7). 抗-P-Ser-Akt、P-Thr-Akt、Akt，P-FKHR、FKHRs、P-PTEN和PTEN来自Cell Signaling Technologies（丹弗斯，马萨诸塞州）。抗p110α、抗p110β、抗p101γ和抗磷酸酪氨酸（PY20）抗体来自Santa Cruz Biotechnology（cat.nos.sc-7174、sc-602、sc-7177和sc-508；Santa Cru，CA）。两种独立的抗pan-p85多克隆抗体来自Upstate Biotechnology（目录号06-195和06-496；弗吉尼亚州夏洛茨维尔）。高亲和力抗血凝素（HA）抗体来自Roche（1867423；意大利蒙扎）。
LY294002（LY）购自Cell Signaling Technology。对于使用LY抑制剂的研究，细胞最初在10%的FCS/DMEM中生长，然后切换到含有0.5%FCS和LY（FCS-/LY+）的DMEM中3至5小时，以减少背景。然后，介质被替换为FCS-/LY-或FCS-/LY+。
Wortmannin来自Sigma（目录号W1628；密苏里州圣路易斯）；染料木素、herbimycin和百日咳毒素（PTX）来自Calbiochem（分类号分别为345834和375670；加利福尼亚州圣地亚哥）；雷帕霉素来自细胞信号技术。所有抑制剂均按照指示制备，并按规定的最终浓度使用。
瞬时和稳定转染、免疫沉淀和免疫印迹
人类的全长和截短型PKD1系列如前所述(7,11). 使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，San Giuliano Milanese，意大利）瞬时转染HepG2和MDCK细胞。用绿色荧光蛋白共转染MDCK细胞，并在分析前使用流式细胞仪进行分选。如前所述生成HepG2稳定转染体(22)使用前面描述的pCI-β-PKD1-Flag载体(7)并使用Zeocin作为可选标记。使用以下引物通过逆转录-PCR筛选阳性克隆：正向gdst5 5’-CTGCTCAGCATTTTGAC-3’，反向gdst3 5’-CGTTCCCTTG-TAGTCAG-3’。对于免疫沉淀（IP）研究，细胞被溶解（250 mM蔗糖、20 mM咪唑和1 mM EDTA【pH 7.4】，以及0.5%Triton-X 100），并添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Amersham，Cologno Monzese，意大利）和磷酸酶抑制剂（1 mM甘油磷酸钠、原钒酸钠和氟化钠的终末）。将总计1μg/μl抗体添加到上清液中，将混合物在4°C下摇动2 h。添加预清洗的g-Sepharose珠，将样品再摇动2小时，离心，并广泛清洗。添加1×final的Laemmli缓冲液用于SDS-PAGE和免疫印迹研究。
PI3-K分析
IP后，在锂缓冲液（LiB；0.5 M LiCl和100 mM Tris-HCl[PH7.4]）中清洗样品三次，在EDTA缓冲液（EB；1 mM EDTA，100 mM NaCl和10 mM Tris-HCl[pH 7.4]）内清洗样品三倍，在激酶缓冲液（KB；40 mM Tris-HCl[PH7.6]，150 mM NaCl和20 mM MgCl）中清洗试样三次。然后，在最终浓度为25 nM的加入或不加入沃特曼的情况下，在KB+1 mM二硫苏糖醇中重新悬浮珠子。我-α-磷脂酰肌醇用作底物（Sigma；目录号8443），并在HEPES（pH 7.6）、1 mM EDTA和0.5%脱氧胆酸盐中以1μg/μl的浓度再次悬浮。向每个反应中添加总计2μg脂质，以及20 mM冷ATP和20μCi高比活性γ32ATP（2000 Ci/mmol；Amersham目录号AA0018）。在最终体积为100μl的条件下，在室温下进行反应10分钟，然后使用25μl 4 N HCl停止反应。使用200μl氯仿/甲醇（1:1）提取脂质，并用100μl氯甲烷：1 N HCl（1:1。然后将有机相干燥，再悬浮在氯仿中，并在硅胶-60板上进行斑点。样品在薄层色谱室中使用氯仿：甲醇：水：羟胺（9:7:2:1）进行分解。将平板干燥，然后使用磷光成像仪SI（分子动力学，尤金，OR）捕捉信号。ImageQuant用于量化反应。
细胞凋亡检测
使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染细胞。之前描述了编码不同形式Akt的向量(24,25).
转染细胞，在完全培养基中培养24 h，然后用重组hTNF-α/TNFSF1A（210-TA）25 nM和环己酰亚胺35μM或在30或60 J/cm的紫外光下处理过夜2然后固定细胞，用0.5%Triton X-100渗透，封闭，然后用一级抗体和二级抗体孵育。然后，按照制造商的说明，使用凋亡检测系统（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）对细胞进行转移酶介导的dUTP镍标记（TUNEL）。Hoechst 33342（双苯甲酰亚胺）购自Sigma（bb2261），最终浓度为1μg/ml。使用Prolong Antifade Kit（Invitrogen）安装所有样品，并使用Axiophot Zeiss显微镜进行观察。使用unparied进行统计分析t吨测试。
肾小管生成分析
对于小管生成分析，细胞生长到汇合处，进行胰蛋白酶化，然后在I型胶原混合物中培养，如前所述(22). 如有规定，用15μM LY294002或25 nM沃特曼处理培养物，每天更换。如前所述进行定量分析(22).
结果
PC-1诱导Akt活化
我们以前报道过PC-1在MDCK II型细胞（MDCK）中的稳定表达PKD1Zeo公司)保护它们免受血清饥饿诱导的细胞凋亡(22). 我们还观察到对紫外线或TNF-α诱导的凋亡的耐受性，但对失巢凋亡无耐受性（补充图1、3和4）。因为许多先前的研究表明Akt可以在其他细胞培养系统中调节这些效应(24,26)，我们询问我们的系统中是否可能涉及相同的途径。Akt通过两种不同的激酶在两个残基（Ser473和Thr308）上磷酸化而被激活：PDK1，其在Thr308处磷酸化(27)以及最近确定的雷帕霉素（mTOR）/Rictor雷帕霉素不敏感复合哺乳动物靶点(28)磷酸化Ser473。这两种磷酸化事件都是实现完全激活所必需的，并且可以使用表位特异性抗体进行检测(24,26). 因此，我们测试了由三个独立的MDCK对照细胞系和三个PKD1系列+MDCK细胞系（MDCKPKD1Zeo公司)在短时间的血清饥饿脉冲后，降低血清诱导的磷酸化的基础水平。如所示在三种MDCK中，phospo-Akt（Ser 473和Thr 308）水平均增加PKD1Zeo公司细胞系与对照组比较(). 用抗总Akt抗体剥离和重制相同的膜后发现，每个样品中的蛋白质水平几乎相等，排除了负载或Akt表达差异可能导致这种影响的可能性(). 然后，我们测试PC-1是否能够激活MDCK细胞中的Akt，而不存在克隆选择的可能混淆效应。我们通过瞬时转染野生型（wt）和一系列PC-1截短突变体表达()在MDCK细胞中发现wt而非突变PC-1能够诱导Akt的磷酸化(). 同意Akt积极参与MDCKPKD1Zeo公司我们发现，在三种MDCK中的每一种细胞中，激活Akt的下游靶点Forkhead转录因子FKHR-1的磷酸化水平增加PKD1Zeo公司细胞系(，顶部）。与此相一致，MDCK在血清饥饿时FKHR易位到细胞核的情况大大减少PKD1Zeo公司与阴性对照相比(，底部）(25). 然后我们测试PC-1的表达是否导致其他细胞类型中Akt的激活。我们通过瞬时转染全长正常和突变表达PKD1系列cDNA()在肝细胞系HepG2中，再次发现只有wt基因导致Akt磷酸化().
多囊藻毒素-1（PC-1）的表达导致Akt的激活。（a） 三种MDCK免疫沉淀（IP）产物中PC-1表达的免疫印迹（IB）分析PKD1Zeo公司（C8/68[68]、G7/36[36]和G3）和对照细胞系（MDCKtTA[Mt]、F6和F2）。抗PC-1 C-项（α-CT）抗体用于IP和IB(7). 打开的箭头表示PC-1（顶部面板）。（底部）用抗磷酸-Ser473-Akt或抗Thr-308抗体测试细胞裂解物的Akt活化。为了控制总Akt的装载量，对膜进行剥离和重制。（b） 前面描述的几个截断构造（顶部）(11)瞬时转染HepG2细胞表达。野生型（WT）：pCI-β-PKD1标志(7); C端裂解产物（CTF）：AF66；REJ-CTF:HBF160；PK-REJ-CTF:BF110(11). （c） MDCK细胞与b中所示的结构体和绿色荧光蛋白瞬时共转染，使用流式细胞仪进行分类，并使用抗磷酸化Ser473-Akt抗体进行分析。然后用抗Akt抗体剥离并重新制备相同的膜。（d） 使用抗磷蛋白-Ser256-FKHR抗体免疫印迹两个对照细胞系（F6和F2）和三个PC-1表达细胞系（C8/68、G7/36和G3）的总裂解物。同样的凝胶被剥离，并用抗FKHR抗体重新配制，以控制负载。（底部）血清饥饿24小时后，使用抗FKHR抗体进行免疫荧光染色，显示FKHRs在F6细胞核中的重新定位，与C8/68相比。（e） 免疫印迹（IB）分析转染不同基因的HepG2细胞中PC-1的表达PKD1系列使用b.M2珠中的构建物从等量的总细胞裂解液中纯化FLAG-标记的PC-1变体，并使用5%聚丙烯酰胺凝胶中的α-CT分析亲和纯化产物。黑色箭头表示由WT和突变PC-1在GPS位置的裂解产生的CTF(11). REJ-CTF公司(*未分离形式）以显著降低的速度被劈开，这解释了相应车道中存在的相对较少的CTF(11). 相反，IgG-REJ-CTF（°未分离形式）和WT的裂解比例较高。为了更好地显示全长PC-1（开放箭头），将来自IgG-REJ-PKD1（°right blot）和wt-PKD1的样品加载到两条通道中的4%聚丙烯酰胺凝胶中，并使用α-CT进行分析。然后用抗Akt抗体剥离并重新制备相同的膜。
Akt是PC-1介导的细胞凋亡抵抗所必需的
在MDCK细胞中表达组成活性形式的Akt足以诱导对凋亡的抵抗(29). 为了测试Akt是否在我们的MDCK细胞培养系统中介导PC-1的抗凋亡作用，我们瞬时转染了激酶标记形式的Akt（DN-Akt，K179M）和HA-tagged wt-Akt(25)进入MDCK控件（MDCKZeo公司)和MDCKPKD1Zeo公司然后用TNF-α处理细胞，并使用TUNEL测定法评估mock、WT Akt和DN Akt转染的细胞的凋亡率，如前所述(22). 如所示与MDCK相比，MDCK对照细胞的凋亡率较高（F6模拟，19.66±4.00%）PKD1Zeo公司（C8/68模拟，4.33±2.88%），证实这些细胞对凋亡有抵抗力(P（P）= 0.0059). C8/68中WT-Akt的表达并没有损害这些细胞在凋亡刺激下的生存能力()，而DN Akt转染显著增加了这些细胞的凋亡率()尽管蛋白质印迹分析显示两种形式的表达水平相等(). 凋亡率的量化()证实转染DN-Akt的C8/68细胞的凋亡率（14.66±1.15%）明显高于模拟转染的（4.33±2.88%）；P（P）=0.0045）或转染WT（4.66±4.16%；P（P）=0.016）个电池。这些结果代表了三个不同的实验，一式三份。使用两个不同的克隆F2和G7/36观察到类似的结果（数据未显示）。以类似的方式，我们发现HepG2中的凋亡率较高Zeo公司（E19）与HepG2相比PKD1Zeo公司（A15）TNF或UV光诱导细胞凋亡时的稳定转染剂（补充图4b）。凋亡率的量化()证实当紫外线诱导细胞凋亡时，E19的细胞凋亡率显著高于A15（20.3±3.9与5.2 ± 1.5%;P（P）= 0.0001;). 此外，与模拟转染（5.2±1.5%；P（P）<0.0001）或转染WT（7.1±2.00%；P（P）<0.0001）电池。所示结果代表了三次不同的实验。因此，我们从这些数据得出结论，活性Akt是PC-1介导的细胞凋亡抵抗的必要成分。
Akt是PC-1介导的细胞凋亡抵抗所必需的。（a） MDCK控制（F6）和MDCKPKD1Zeo公司（C8/68）通过模拟、WT（WT-Akt）或显性阴性（DN_Akt）Akt结构瞬时转染。使用TNF-α诱导细胞凋亡（见材料和方法），用抗血凝素（HA）抗体（红色）染色细胞以鉴定转染的细胞，用转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）测定（绿色）观察凋亡细胞，并用Hoechst 33342（蓝色细胞核）复染可视化现场的所有细胞。模拟转染的C8/68细胞中几乎没有凋亡细胞，而在相同条件下处理的F6细胞中可以看到相当数量的凋亡细胞。在这两种细胞系中转染WT-Akt构建物时观察到类似的结果，而在这些细胞中转染DN-Akt后，在C8/68中可以看到较高的HA-阳性/TUNEL阳性细胞率。（b） 与a中的实验设计相同，但细胞裂解物是从瞬时转染的F6和C8/68细胞制备的，并使用抗HA和抗肌动蛋白抗体的混合物作为负荷对照进行Western blot分析。所有细胞系中的所有结构均达到了相同的表达水平。（c） a.在模拟转染细胞中，凋亡的百分比计算为TUNEL阳性细胞数与现场出现的总细胞数之比。在WT和DN Akt转染的细胞中，凋亡的百分比表示为TUNEL阳性细胞的数量相对于HA阳性细胞的数量。方差分析检验用于进行统计分析。每次两两比较的结果都达到了统计显著性（详见正文）。（d） 与在HepG2细胞中进行的a至c实验相同。细胞凋亡百分比和统计分析均按c。
PC-1-介导的Akt激活需要活性PI3-K
接下来，我们试图确定PC-1导致Akt激活的机制。鉴于Akt是PI3-K通路的一个既定靶点，我们使用三种MDCK对照和MDCK重复了血清饥饿实验PKD1Zeo公司存在或不存在高度特异性PI3-K抑制剂LY294002（15μM）的细胞系。我们发现该抑制剂能够阻止MDCK中的Akt磷酸化()和HepG2()表达全长PC-1的细胞。因为据报道LY294002也抑制Ser/Thr激酶mTOR的激酶活性，所以我们在另一种PI3-K抑制剂（沃特曼，12nM）和一种有效的mTOR抑制剂（雷帕霉素，25nM）的存在下处理细胞。我们发现前者（而非后者）能够阻止我们系统中的Akt磷酸化（数据未显示），证明PI3-K是该途径中的必要成分。
PC-1相关的Akt激活依赖于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K），PI3-Kβ增加了MDCK的活性PKD1Zeo公司细胞系。（a） 来自MDCK对照（1，MDCKtTA；2，F6；3，F2）和MDCK的裂解物PKD1Zeo公司细胞系（4，C8/68；5，G7/36；6，G3）在有（LY+）或无（LY-）LY29400（最终15μM）的情况下进行血清饥饿处理，使用磷酸化-Ser473-Akt特异性抗体进行免疫印迹（顶部）。使用抗Akt抗体剥离并重新制备相同的膜（底部）。（b） 与a中的实验设计相同，但裂解物是由转染了PKD1系列（WT）和转染载体（Mock）以及未转染对照。（c） 相同的MDCK控件和MDCKPKD1Zeo公司a中描述的细胞系将血清饥饿24小时，然后使用抗磷酸化-Ser380-PTEN抗体和抗PTEN抗体对细胞裂解产物进行分析。（d） PI3-K活性分析。MDCK控制F6和MDCKPKD1Zeo公司C8/68细胞系被剥夺血清36小时，然后裂解。使用合适的抗体对每一种I类p110亚单位进行免疫沉淀，然后在没有（-）或存在（+）沃特曼（最终25 nM）的情况下测量其PI3-K活性，如材料和方法所述。只有p110βIP产物的活性增加。使用其他阴性对照MDCK（Mt和F2）和MDCK也获得了类似的结果PKD1Zeo公司（G3和G7/36）细胞系（数据未显示）。（e） 量化在体外使用所有三个阴性对照MDCK的裂解物进行PI3-K分析(□) 和三个MDCKPKD1Zeo公司细胞系(■). 对照组中观察到的活性水平设置为1，而MDCK中观察到PKD1Zeo公司细胞表达为与对照组的比率。p110β活性的检测在六个独立的实验中进行，而p110α和p110γ的检测重复了三次。结果表示为平均值±SEM。*统计学显著差异(P（P）= 0.0019;t吨测试未成对）。（f） 同一MDCK对照（Mt、F6和F2）和MDCK中PI3-K p110亚基的表达水平PKD1Zeo公司b中使用的（C8/68、G7/36、G3）细胞系。对产物进行免疫沉淀，并使用相同的亚单位特异性抗体进行免疫印迹分析。
PI3-K/Akt活性的明显增加与PKD1系列表达可能是由于磷酸酶活性降低导致的，这些磷酸酶可以降解参与Akt活化的效应分子磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），也可以增强PI3-K的活化。PTEN是一种主要的磷酸酶，可以去磷酸化PIP3的关键D3位置，所以我们检查了如何PKD1系列表达式改变了PTEN的属性(30). 我们发现MDCK中PTEN总量或其磷酸化形式的水平没有差异PKD1Zeo公司细胞系与对照组的比较(). 这些数据表明，通过PC-1表达观察到的Akt激活是由于PI3-K活性增强所致。
PC-1诱导PI3-K活化β（第85页/第110页β)
已经描述了三类PI3-K。I类PI3-K是PIP3的主要产生者，因此主要与Akt激活有关。这类酶的成员是由一个调节亚基和一个催化亚基组成的异二聚体，这些亚基由低剂量的抑制剂如沃特曼和LY294002组成并被其抑制(31,32). 较大的亚类（IA类）由不同的调节亚基（p85α，β和p55α，γ）和催化亚基（p110α，β，δ）的各种组合形成。IB类PI3-K只有一个成员，由110kD催化亚基（p110γ）和101kD调节亚基（p101）组成。大多数IA类PI3-K通过与酪氨酸磷酸化受体（通常为酪氨酸激酶受体）结合而被激活(31,32). 例外情况包括p110β（也可被GPCR激活）和p110α（可被细胞因子受体激活）通过Janus活化激酶2（JAK2）(31-34). IB类PI3-K仅由GPCR激活，通过Gβγ亚基的直接结合(31,32).
我们测试了表达PC-1的裂解物中的I类激酶活性与对照细胞系。我们免疫沉淀了来自MDCK对照和MDCK的p110α、β、γ催化亚基PKD1Zeo公司细胞系和执行在体外激酶分析。如所示，只有表达PC-1的细胞的p110βIP产物催化了32P标记的PIP与控制。几个独立实验的量化显示，与p110β免疫沉淀物相关的活性低但持续增加（1.29±0.07；n个=6）来自MDCKPKD1Zeo公司 与控制但不使用p110α或p110γ(). 这些数据表明，PC-1的表达增加了p110β催化活性。与这一解释相一致的是，两种细胞系之间的p110β的总水平和用于激酶反应的IP产物的量都没有差异().
PC-1激活PI3-K需要酪氨酸激酶活性和异三聚体G蛋白
I类PI3-K通常通过其SH2结构域向酪氨酸磷酸化受体或适配器招募调节亚单位p85而激活(31,32). 我们通过比较在体外MDCK抗磷酸酪氨酸免疫沉淀的激酶活性PKD1Zeo公司 与对照裂解物。令人惊讶的是，没有观察到差异(). 在对照研究中，我们发现两组细胞对肝细胞生长因子（HGF）和EGF的治疗反应正常，抗磷酸酪氨酸免疫沉淀物中的激酶活性显著增加(). 这些结果排除了在PKD1系列-表达细胞或技术问题是我们发现的可能解释。
活化的PI3-Kβ与磷酸酪氨酸无关，并被百日咳毒素（PTX）抑制。（a） 来自MDCK对照或MDCK的抗磷酸酪氨酸（PY20）免疫沉淀物的PI3-K活性分析PKD1Zeo公司使用与在如图所示，一些培养物在细胞收获前用肝细胞生长因子（HGF）或EGF处理5分钟，作为阳性对照。PIP标识32P标记的磷脂酰肌醇。（b） ●●●●。使用抗p85抗体对a中使用的每种免疫沉淀物的等分样品进行免疫印迹分析（参见材料和方法）。经HGF或EGF治疗后，抗磷酸酪氨酸抗体可免疫沉淀p85水平的升高，但在未经治疗的细胞中没有。（c） 在存在或不存在0、50、100或500 ng/ml PTX的情况下，对照细胞系F6和表达PC-1的克隆C8/68被血清饥饿24小时。使用抗磷酸-Ser473-Akt抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。将膜剥离并使用抗Akt抗体进行再处理。（d） 实验设计与c中使用的类似，但金雀异黄素的使用剂量（mm）除外。
先前的研究表明，p110β可以被酪氨酸激酶和异源三聚体G蛋白依赖性途径激活(33,34). 因此，我们使用PTX（Gi亚家族异源三聚体G蛋白的高度特异性抑制剂）测试异源三聚氰胺G蛋白是否参与这一过程。事实上，我们观察到PTX对磷酸化Akt的抑制具有剂量依赖性()在C8/68亚克隆中和在对照F6中的最小基础抑制。这些数据表明，异源三聚体G蛋白在PC-1表达导致的PI3-Kβ活化中发挥作用。鉴于Kurosu等。(33)之前有报道称，Gβγ对p110β的激活通过添加磷酸酪氨酸肽而显著增强，我们质疑我们观察到的过程是否完全独立于酪氨酸磷酸化。我们通过检测酪氨酸磷酸化通用抑制剂对PC-1激活Akt的影响来解决这个问题。如所示，我们发现染料木素和herbimycin（数据未显示）都大大降低了PC-1诱导的Akt激活水平。其他PKD1+细胞系也获得了类似的结果（数据未显示）。这些结果表明，我们的系统中存在双重激活机制，尽管其水平太低，无法通过抗磷酸酪氨酸免疫沉淀物的激酶分析检测到。
PI3-K介导PC-1诱导的形态发生
PI3-K还与HGF/SF-MDCK模型中的运动和小管生成特性有关(35); 因此，我们测试了LY294002或沃特曼是否可以阻止MDCK的形态发生特性PKD1Zeo公司细胞。如所示在三维胶原凝胶分析中，LY294002和沃特曼都阻止了PC-1诱导的试管启动，这强烈表明PI3-K在多囊蛋白-1介导的形态发生中起着核心作用。在不同的时间点去除抑制剂会导致结构的进一步生长，这表明在如此短的时间内使用抑制剂不会导致细胞死亡（数据未显示）。
PI3-K抑制可防止PC-1诱导的小管生成。（a至q）PC-1诱导的小管生成被PI3-K抑制抑制。MDCK和MDCKPKD1Zeo公司如前所述，细胞系悬浮在胶原凝胶中生长(22)在缺乏（-）或存在（+）15μM LY294002或25 nM Wortmannin的情况下持续2天（a到d和I到M）、4天（e到h）或8天（n到q）。控制细胞系（a、b、e、f、i、l、n和o）和MDCK的代表性示例PKD1Zeo公司显示了细胞系（c、d、g、h、k、m、p和q）。照片以×40的放大倍数拍摄；a至m进一步放大×4。（r） 如前所述，对a中所述的实验进行了量化(22). 对每个克隆的三到五个孔中观察到的结构进行了计数。在15μM LY294002或25 nM Wortmann的存在下进行治疗，虽然没有完全抑制，但MDCK中观察到的小管总数显著减少PKD1Zeo公司文化。
讨论
据报道，ADPKD患者囊性肾脏的增殖增加(36,37). 然而，这种疾病在患者的一生中进展非常缓慢，如果增殖增加是唯一或主要的缺陷，这一特征很难解释(1). 据报道，在人类囊性肾脏中，细胞凋亡率也有所增加，因此有人提出，囊肿上皮细胞增殖和死亡之间的平衡受到干扰(37). 我们之前的研究表明，PC-1在肾上皮细胞中的表达会导致生长速度降低、对凋亡的抵抗以及将囊性表型转化为分支小管之一(22). 然后我们发现，PC-1/PC-2激活JAK-STAT信号系统是导致该模型中所见生长效应的原因(23). 在这项工作中，我们将PC-1连接到一条信号通路，该通路已知同时具有抗凋亡和促蛋白原性(24,31,32,35). 我们已经证明，PC-1的表达导致PI3-Kβ（p85/p110β）、Akt和效应分子（如FKHR）的激活，并且这些被极低剂量的高度特异性PI3-K抑制剂抑制。重要的是，在本研究中，我们表明Akt的激活对于PC-1诱导的凋亡抵抗是必要的在体外，因为MDCKPKD1Zeo公司以及HepG2PKD1Zeo公司表达该激酶显性阴性形式的细胞对凋亡不再有抵抗力。
我们注意到，我们的结果与山口最近的发现一致等。(17). 这些作者和其他人以前曾报道过cAMP对来自ADPKD囊肿的上皮细胞具有促有丝分裂作用，但抑制正常肾上皮细胞的增殖(38,39). 在试图确定这一现象背后的机制时，他们发现，他们可以通过改变细胞内钙水平和抑制PI3-K/Akt通路在正常细胞中复制表型，而PI3-K/Akt通路反过来又会导致细胞外信号调节激酶（ERK）的激活。他们还发现，通过在M1肾集合管细胞系中表达PC-1的短C末端而破坏内源性PC-1功能，导致ERK通路的类似上调和对cAMP的有丝分裂反应。作者提出了一种模型，即PC-1功能的丧失可能导致ADPKD囊肿中细胞内钙的变化、PI3-K-Akt活性的下调和ERK的激活。
有趣的是，马最近的一份报告等。(40)表明，在需要PI3-K活性的过程中，EGF可以增强多囊蛋白-2（PC-2）通道活性。人们可能会假设PC-1诱导的PI3-K活动也可能与调节PKD2通道有关，尽管需要直接研究来验证这一假设。
我们的发现有几个不寻常的方面需要评论。第一个令人惊讶的观察结果是，我们没有发现PI3-K活性与酪氨酸磷酸化蛋白库相关。这与大多数诱导IA PI3-K类激活的受体的报道相反。在大多数已知的例子中，p85调节亚基的SH2结构域被招募到位于特征序列YXXM、受体本身或适配器分子上的磷酸化酪氨酸。因此，PI3-K活性通常与磷酸酪氨酸下拉相关。需要注意的是，当p110β被激活以响应GPCR时，PI3-K的磷酸酪氨酸非依赖性激活是有先例的(41). 由于PC-1被报道与异源三聚体G蛋白亚群相关并激活，我们推测类似的机制可能是我们观察到的结果的原因(12-14). 然而，与我们的研究相反，Murga等。(41)据报道，金雀异黄素预处理未能阻止GPCR激动剂在其细胞培养系统中激活Akt。我们的酪氨酸激酶抑制剂研究表明，Akt的激活可能是由两种途径之间的协同合作引起的，这与动力学研究一致在体外关于p110β(33,34).
我们如何将这些发现与我们无法显示与抗磷酸酪氨酸免疫沉淀物相关的PI3-K活性相协调？我们认为这很可能是由于我们使用的模型系统的性质。IA类PI3-K的酪氨酸依赖性激活通常是一个非常快速的开关过程，在暴露于激动剂后5至10分钟内，磷酸酪氨酸相关的PI3-K活性完全丧失(42). 由于缺乏已知的PC-1配体，因此不可能研究我们系统中PI3-K激活的早期阶段。因此，我们可能会错过依赖于酪氨酸磷酸化的初始激活峰值。也有可能存在低于检测阈值的低但持续的酪氨酸磷酸化水平。
从我们的数据来看，我们无法确定PC-1是否直接参与PI3-K的激活。因为在PC-1的C末端或推测的细胞内环路中没有发现YXXM序列，似乎不太可能发生激活通过p85 SH2结构域与PC-1直接结合，但通过中间分子。其中一个这样的分子可能是JAK2，因为我们之前已经证明它被激活并与PC-1结合(23,43,44). 另一种可能性是14-3-3衔接蛋白可能介导IL-3受体的相互作用(45). 在本实施例中，IL-3受体中的蛋白激酶a依赖性磷酸化位点与14-3-3衔接蛋白结合，后者介导p85的结合和激活。在我们的系统中，一种类似的机制可能作为一种潜在的蛋白激酶出现。PC-1 C末端已鉴定出磷酸化位点(18,19).
各种在体外研究结果与PC-1功能相关体内尚待确定。西洋等。(46)最近报道了一种用于第1页+/+和第1页-/-形成肾囊性疾病的细胞。在该模型系统中，正常和囊性上皮细胞中的Akt磷酸化似乎都增加了，但两者的凋亡率都不相关。这些结果似乎与该分子在迄今为止研究的大多数系统中公认的抗凋亡作用相反(24). 然而，作者没有具体说明他们研究的磷酸化位点，最重要的是，他们没有显示Akt下游效应器的磷酸化增加。因为Ser473和Thr308的磷酸化对Akt的激活是必要的(24,25,27,28)，根据目前可用的数据，不可能知道Akt在其系统中是否也具有催化活性。因此，目前我们的调查结果与他们的调查结果之间不可能有直接关联。然而，有人可以推测，在这种情况下，Akt的磷酸化可能代表细胞试图（可能失败）对抗强烈的凋亡刺激，或者可能仅仅是由于EGF受体信号的上调(46). 此外，西雄等。(46)证明囊肿形成体内似乎需要一系列逐步发生的“转变”事件。在囊肿形成的不同阶段仔细检查Akt的磷酸化状态，可能确实会发现在缺乏第1页在这些阶段中的某些阶段，但不是其他阶段。Akt灭活后不同时间状态的系统评估第1页将需要解决此问题。
最后一个可能的解释是在体外和体内研究发现，PC-1缺失导致PI3-K/Akt途径下调体内并不是囊性上皮细胞凋亡增加的原因，而是可能与囊性上皮中观察到的其他一些表型有关第1页-/-老鼠。这一假设与我们的发现一致，即PI3-K的特异性抑制剂能够阻断PC-1诱导的分支小管生成，以及越来越多的文献描述了这种激酶在调节HGF诱导的MDCK细胞小管生成中的中心作用(35,47). 因此，我们提出了一种模型，其中PC-1激活PI3-K作为一个中心分子，能够诱导对凋亡和小管生成的抵抗。未来的研究将确定PC-1激活该过程的确切机制，以及该途径在PC-1功能中的生理相关性。
