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.2003年8月；77(16):8957-61.
doi:10.1128/jvi.77.16.8957-8951.2003。

细胞基因的条件抑制：慢病毒载体介导的药物诱导RNA干扰

马西耶·维兹内罗维奇 1, 迪迪埃·特罗诺
附属公司

细胞基因的条件抑制：慢病毒载体介导的药物诱导RNA干扰

马西耶·维兹内罗维奇等。 J维罗尔. 2003年8月.

摘要

RNA干扰已成为一种强有力的技术，可以下调细胞和动物中特定基因的表达，从而在发育遗传学和分子治疗学等领域开辟了新的前景。在这里，我们描述了一种通过允许哺乳动物细胞中基因的条件抑制来显著扩大RNA干扰潜力的方法。在慢病毒载体背景下，我们使聚合酶III启动子依赖性产生的小干扰RNA受到多西环素可控的转录抑制。由此产生的系统可以实现高效和完全药物诱导的细胞基因敲除。由于慢病毒载体可以在体内外稳定地转导多种靶点，并可用于生成转基因动物，因此本系统应具有广泛的应用前景。

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数字

图1。
图1。
（左面板）一种基于慢病毒载体的系统，用于DOX诱导的siRNA的条件基因抑制。（A） 本研究中使用的慢病毒载体质粒示意图。由H1启动子组成的盒，上游无（LV-H）或有（pLV-TH）四氧化二铁序列，H1-siRNA（LV-Hsi），以及四氧化二铁-在pWPXL的3′U3区克隆了H1-siRNA（LV-THsi）(http://www.tronolab.unige.ch网站/). 所有载体都包含一个受EF-1α启动子转录控制的内部标记cDNA。（B） siRNA慢病毒载体的双拷贝设计。在反转录过程中，5′LTR的U3区是以其3′同系物为模板合成的，这导致整合在转基因细胞基因组中的前病毒中siRNA盒的复制。
图2。
图2。
（右面板）DOX可控反式阻遏物的作用模式。（A） 在没有DOX的情况下，tTR-KRAB与四氧化二铁并抑制H1介导的siRNA转录，从而使细胞目标基因正常表达（on）。（B） 在DOX存在的情况下，tTR-KRAB无法绑定到四氧化二铁因此产生siRNAs，导致其靶点下调（关闭）。siRNA载体中包含的内部标记提供了一个反向监测装置，因为它在DOX存在时开启，在DOX不存在时关闭。
图3。
图3。
通过使用DOX诱导的siRNA调节GFP表达。（A）携带从EF-1α启动子表达GFP的慢病毒载体（HeLa-GFP）的单一拷贝的HeLa细胞通过控制慢病毒载体或以组成（LV-Hsi）或调节（LV-THsi）方式产生GFP特异性siRNA的载体进行转导，具有或不具有LV tTR KRAB（缺乏内部核糖体进入位点dsRed盒）和/或DOX。截短形式的NGFR（ΔNGFR）在siRNA载体中充当内部报告子。（B） 内部标记基因的条件表达。在用NGFR胞外结构域特异性单克隆抗体进行FACS分析之前，将用LV-THsi/GFP和LV-tTR-KRAB双重转导的HeLa-GFP细胞在DOX存在或不存在的情况下保存。
图4。
图4。
使用DOX诱导的siRNAs调节内源性基因。左侧面板，下调p53。用材料和方法中描述的指示慢病毒载体感染MCF-7细胞。用抗p53、GFP或肌动蛋白的单克隆抗体进行免疫印迹（作为对照）。右面板，下调层粘连A/C。使用层粘连特异性siRNA载体和抗体对HeLa细胞进行与左面板相同的实验。
图5。
图5。
DOX诱导RNA干扰的动力学和剂量反应性。（A） 如材料和方法所述，用LV-THsi/p53和LV-tTR-KRAB共同转染MCF-7细胞。五天后，以5μg/ml的浓度添加DOX。细胞在DOX处理前（0道）采集，然后在指定的时间点采集。wt，非转导细胞。用p53特异性抗体进行Western blotting分析全细胞提取物。（B） 如面板A所述，在转导后5天，将细胞置于含有以下DOX浓度（微克每毫升）的培养基中：0（车道1）、0.0005（车道2）、0.001（车道3）、0.002（车道4）、0.004（车道5）、0.008（车道6）、0.016（车道7）、0.063（车道8）、0.25（车道9）、1（车道10）和5（车道11）。wt，非转导细胞。再过5天，对全细胞提取物进行Western blot分析。
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