自噬。2013年3月1日；9(3): 361–373.
非协调51样激酶1和2对营养素敏感自噬的调节
，1 ，2 ，1，*和2，*
菲奥娜·麦克阿尔宾
1伦敦研究所；英国癌症研究中心；分泌通路实验室；英国伦敦
莱昂·威廉姆森
2斯特拉斯克莱德药学和生物医学研究所；RICAS集团；斯特拉斯克莱德大学；苏格兰格拉斯哥
莎伦·A·图兹
1伦敦研究所；英国癌症研究中心；分泌通路实验室；英国伦敦
Edmond Y.W.Chan先生
2斯特拉斯克莱德药学和生物医学科学研究所；RICAS集团；斯特拉斯克莱德大学；苏格兰格拉斯哥
1伦敦研究所；英国癌症研究中心；分泌通路实验室；英国伦敦
2斯特拉斯克莱德药学和生物医学研究所；RICAS集团；斯特拉斯克莱德大学；苏格兰格拉斯哥
- 补充资料
其他材料。
GUID:ED092418-BA1A-4852-B67A-997367757137
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摘要
大自噬，通常被称为自噬（autophagy），是一种蛋白质降解途径，在细胞中组成性发生，但也可能由营养缺乏或蛋白质聚集等应激因素诱导。自噬与多种疾病机制有关，包括神经变性和癌症，具有抑癌和致癌作用。非协调51样激酶1（Uncoordinated 51 like kinase 1，ULK1）是一种重要的自噬蛋白，位于层级调控通路的顶点附近，接收来自主营养传感器MTOR和AMP-activated protein kinase（AMPK）的信号。在哺乳动物中，ULK1有一个密切的同源物ULK2，尽管它们的功能区别尚不清楚。在这里，我们表明ULK1和ULK2都支持营养素饥饿后的自噬激活。只有当小鼠胚胎成纤维细胞中ULK1和ULK2同时缺失时，氨基酸或葡萄糖饥饿后自噬增加才会被破坏。在氨基酸饥饿后，PtdIns3P的产生和WIPI2或ZFYVE1/DFCP1向吞噬体的募集通过联合阻断乌尔克1/2两次击倒。葡萄糖饥饿后的自噬激活并不涉及WIPI1或WIPI2的募集以形成自噬体。与PtdIns3P非依赖性机制一致，葡萄糖依赖性自噬对沃特曼蛋白具有耐药性。我们的研究结果支持ULK1和ULK2在营养依赖性自噬激活方面的功能冗余，并进一步强调了对氨基酸和葡萄糖缺乏反应的差异途径。
关键词：ULK1、ULK2、WIPI1、WIPI2、敲除、MEF、营养缺乏
介绍
大细胞自噬（以下简称自噬）是一种结构性的细胞内务处理过程，可由各种应激源诱导。一种独特的双层细胞器，即自噬体，形成并吞噬细胞质的一部分，包括细胞器、长寿命蛋白质和蛋白质聚集体。自噬体随后与溶酶体融合，以降解其载物。从酵母到哺乳动物，这个过程都是保守的，与癌症和神经退行性疾病有关，最近已被广泛综述。1-三
ULK1，一种哺乳动物的同源物秀丽隐杆线虫未配位的51丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，4，5首先通过激酶siRNA筛选确定为自噬的关键调节器。6在哺乳动物中，但不是低等生物中，ULK1有一个近亲ULK2，在激酶结构域和C末端结构域具有高度同源性。7，8在参与自噬之前，ULK1和ULK2被证明对神经元发育起关键作用。9-11ULK1和ULK2与酵母Atg13的哺乳动物同源物和200 kDa的黏着斑激酶家族相互作用蛋白（RB1CC1/FIP200）形成复合物，该蛋白是酵母Atg17的哺乳动物功能同源物。7，12，13这种复合物已在各种细胞环境中显示，激活自噬需要与其他调节因子（如C12orf44/ATG101）结合。14-16氨基酸提取后，ULK复合物转移到PAS（吞噬细胞组装位点）或形成自噬体的其他位点。6，17，18
ULK1/2活性由激酶MTOR调节，该激酶构成主营养传感器MTOR复合物1（MTORC1）的一部分。在细胞氨基酸饥饿时，MTORC1被抑制，释放ULK1/2并促进ULK-ATG13-RB1CC1复合物的最大激活。13，15有证据表明，MTORC1的部分调节涉及ULK1的直接磷酸化，这进一步调节AMP-activated protein kinase（AMPK）介导的ULK1磷酸化。19-22有趣的是，ULK1还可以抑制MTORC1，23将其置于营养素信号级联的上游和下游，以在系统内提供反馈机制。ULK1自噬功能可以通过其他修饰进行调节，例如通过糖原合成酶3-KAT5/TIP60途径进行乙酰化。24
与体内生理作用相关，ULK1和ULK2显示出非常相似的组织表达谱4，5，8尽管已经描述了一些异构体特有的功能。乌尔克1-缺陷小鼠天生没有明显的表型，从这些小鼠衍生的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）表现出正常的一般自噬，暗示ULK1/2体内冗余。25
Ulk2公司-空小鼠出生时也没有表型，相应的MEF显示正常的自噬。26然而，乌尔克1敲除小鼠在红细胞发育过程中和原代肝细胞中确实表现出线粒体自噬缺陷。25，27与ULK1特异性体内作用的概念一致，ULK1是通过低钾介导的初级小脑颗粒神经元膜去极化诱导自噬所需的关键亚型。26在HEK293细胞中，我们已经证明，siRNA介导的ULK1（而非ULK2）的缺失足以抑制自噬，这进一步支持了特定的ULK亚型在某些细胞环境中的主导作用。6
在本研究中，我们旨在更明确地定义ULK1和ULK2的作用。我们产生了两种基因靶向的MEF乌尔克1和Ulk2公司并研究了它们在基础和饥饿诱导的自噬中的各自作用。为了评估对自噬的影响，我们使用了相对较晚的标记，如LC3的脂质化、酵母Atg8的特征良好的同源序列、微管相关蛋白1轻链3（LC3）。为了进一步了解，我们通过检测含有磷脂酰肌醇3-磷酸（PtdIns3P）结合蛋白WIPI2的膜来研究早期自噬起始的分子标记。28我们以前的研究表明，WIPI2存在于与内质网相关的PAS或吞噬细胞起始膜上，并在那里转移到新生的自噬体。在这里，我们发现ULK1和ULK2是通过氨基酸和葡萄糖戒断共同诱导自噬所必需的。只有在ULK1和ULK2联合缺失的情况下，含有PtdIns3P的自噬膜和LC3脂质化的营养依赖性形成才会受到强烈抑制。有趣的是，我们发现，葡萄糖饥饿可以激活LC3脂质氧化，而不会产生PtdIns3P，而PtdIns3P以前被认为是自噬的关键。29
结果
ULK1和2都是氨基酸饥饿诱导自噬所必需的
小鼠自噬基因缺陷附件5、附件7和附件9a在出生后饥饿期间表现出新生儿死亡。30-32相反，之前推导的乌尔克1-缺陷小鼠存活且可繁殖，具有整体功能性自噬，在红细胞发育过程中仅延迟网织红细胞的自噬线粒体清除。25我们假设，ULK1诱导的依赖性自噬是通过其密切相关的同源物ULK2、，8此前根据细胞系的工作，人们认为在自噬中只起到很小的作用。6我们生成了乌尔克1-使用在小鼠的大内含子区内携带剪接受体基因陷阱的胚胎干细胞的缺陷小鼠乌尔克1破坏其N末端附近蛋白质的位点（详情见图S1). 如预期，纯合子乌尔克1基因陷阱敲除小鼠（ULK1KO）是活的、可繁殖的，在生长或存活方面与野生型（WT）没有差异。Ulk2公司-缺陷小鼠也被证明是活的、可繁殖的和有自噬能力的。26我们从ULK1KO、ULK2KO和WT胚胎中获得MEF，并分析了原始和SV40 T抗原永生化亚系中的自噬特性。通过LC3脂质氧化评估，永生ULK1KO MEF显示调节氨基酸饥饿诱导的自噬能力降低()（短期氨基酸饥饿期间也没有血清）。与WT MEF相比，在全营养和氨基酸保护条件下，ULK1KO MEF的LC3-II/LC3-I比率显著低于WT MEFs，尽管ULK1KO-细胞表现出一定的残余能力来增加LC3-II以应对氨基酸饥饿。相反，在全营养和氨基酸保护条件下，ULK2KO MEF表现出LC3-II/LC3-I异常升高的替代表型。在空泡质子ATP酶抑制剂巴非霉素A存在下，在氨基酸饥饿后进一步测定LC3的脂化1（BafA1）评估溶酶体功能受到抑制时的自噬通量。WT MEF显示，在氨基酸饥饿+BafA1条件下，LC3-II蓄积强劲，符合预期。与氨基酸饥饿的影响一致，ULK1KO MEF显示饥饿+BafA1后LC3-II积累减少约50%。相反，当细胞饥饿而阻断溶酶体活性时，ULK2KO MEF显示LC3-II积累增加。这些数据表明，ULK1KO细胞中氨基酸依赖性自噬部分被破坏，但随后出现了另一种细胞表型Ulk2公司敲除可能涉及代偿机制，导致自噬适度升高。
图1。在氨基酸饥饿后，ULK1和ULK2的缺失会抑制自噬。(A类)野生型（WT），乌尔克1击倒（ULK1KO），Ulk2公司击倒（ULK2KO）和两个独立推导的乌尔克1/Ulk2公司用含50nM巴非霉素A的全营养培养基（F）、EBSS（-AA）或EBSS处理双敲除（DKO）MEF株系1（Baf）2 h。用针对ULK1、肌动蛋白和LC3（纳米工具5F10单克隆）的抗体对溶解的细胞裂解物进行免疫印迹。“*”表示ULK1免疫印迹上的非特异性条带。用SV40T抗原使MEF系永生化。下图：LC3-II/LC3-I信号用2种不同的y轴标度绘制为平均值±SEM（n=4）。在相同条件下，对WT MEF值进行双尾配对t检验：*p<0.04**p<0.005；一p=0.14；b条p=0.056；c（c）p=0.12。(B类)从MEF株系中提取总RNA，如(A类)并分析了乌尔克1和Ulk2公司转录水平使用定量RT-PCR。绘图显示乌尔克1或Ulk2公司标准化为的级别肌动蛋白转录水平（平均±SEM，（n=3），与WT细胞相关的值）。(C类)WT和DKO MEF线被视为(A类)用磷酸化-（Ser79）乙酰辅酶A羧化酶（P-ACC）、磷酸化-核糖体蛋白S6（P-RPS6）抗体对溶解的细胞裂解物进行免疫印迹；肌动蛋白和LC3（5F10单克隆抗体）。(D类)在裂解和免疫印迹分析之前，将MEF系置于全营养培养基（F）或葡萄糖饥饿（−Glc）中16 h，如(C类). (E类)MEF系用C14-缬氨酸稳定标记过夜，追踪24小时，并分析氨基酸饥饿2小时后的蛋白质降解情况。图中显示了平均±SEM（n=3）。对WT MEF进行双尾配对t检验：*p<0.02**p<0.01。(F类)WT和乌尔克DKO#1 MEF被视为(A类)固定2h，进行LC3免疫染色。所示为−AA和−AA+Baf条件的典型共焦图像。比例尺：10μm。图中显示了平均点/细胞±SEM（每列：两个实验中每种条件下的n=22至39个细胞）。在相同条件下与WT MEF比较时的双尾配对t检验：***p<0.0003*p<0.02。(G公司)初级WT和DKO MEF处于饥饿状态，如(A类)并裂解用于SQSTM1和肌动蛋白的免疫印迹分析。右：绘图密度测定法[SQSTM1水平归一化为肌动蛋白，显示为平均值±SEM（n=4）]。在相同条件下与WT MEF进行比较时，双尾配对t检验：*p<0.04，**p<0.01。
考虑到在小鼠存活率中观察到的功能补偿乌尔克1或Ulk2公司淘汰赛，我们进行了调查Ulk1/2号机组双重缺陷。我们将ULK1KO和ULK2KO小鼠进行杂交，并从发育第E13天收集的DKO胚胎中获得MEF。DKO-MEF表现出更显著的自噬损伤，氨基酸饥饿后LC3-II/LC3-I降低（如在2个独立的DKO-MEF细胞系中观察到的）。在饥饿+BafA1条件下，两个DKO-MEF系的LC3-II积累也显著减少。LC3/actin水平的分析进一步证实了在BafA1存在下，氨基酸饥饿处理的DKO MEF中LC3-II的积累受到抑制(图S2A). 我们还在主要MEF中确认乌尔克DKO表现出氨基酸依赖性LC3脂质化的最明显损伤(图S2B). 综上所述，这些结果与以下氨基酸饥饿依赖性自噬的部分阻断相一致乌尔克1损失，在综合损失乌尔克1和Ulk2公司值得注意的是，在单次或双次丧失Ulk1/2号机组成员，与以下效果形成对比附件5对照实验中观察到的击倒(图S2B和S2C). 作为进一步的控制，我们确定了适当的目标乌尔克1和Ulk2公司这些MEF系中的mRNA().
由于饥饿依赖性自噬在以下方面受到强烈影响乌尔克DKO，我们研究了MTORC1的氨基酸信号机制是否被破坏。氨基酸饥饿后，MTORC1被强烈灭活，正如预期的那样，使用磷酸化核糖体蛋白RPS6的水平作为标记(). 氨基酸饥饿后MTORC1失活在两个DKO系中相似。2小时的氨基酸饥饿没有激活AMPK途径（使用乙酰辅酶a羧化酶（ACC）磷酸化作为标记）。在本研究的后期，我们将葡萄糖饥饿作为激活自噬的手段，我们还分析了当细胞处于葡萄糖缺乏状态时AMPK的激活(). 葡萄糖饥饿后，WT MEF显示ACC磷酸化（磷酸化-ACC/actin，标准化为全营养状态）增加3.35倍（±1.8 SEM，n=3）。ACC磷酸化也在乌尔克葡萄糖饥饿后的DKO MEF，但程度较小（例如，DKO生产线#2的1.6倍（±0.8 SEM，n=3））。在任何类型的细胞中，长期的葡萄糖饥饿都不会导致MTORC1失活(图S2D). 这些数据表明，即使在乌尔克DKO蜂窝环境。此外，长期的葡萄糖饥饿可以激活AMPK乌尔克DKO细胞，尽管这种反应部分受损。
我们调查了乌尔克DKO细胞使用额外的自噬分析。放射性标记细胞是量化自噬降解的经典生化方法，与WT细胞相比，两种DKO MEF细胞系的长期蛋白质降解水平均受损约50%(). 我们还使用LC3点状结构表征了WT和DKO MEF中自噬结构的形成(). 氨基酸饥饿增加了WT MEF中定量LC3阳性结构的数量。在饥饿培养基中添加BafA1后，结构的数量和尺寸进一步急剧增加。氨基酸饥饿不会刺激DKO细胞中LC3阳性膜的形成。与野生型MEF相比，在BafA1存在下饥饿后，DKO中LC3阳性膜的积累也显著降低。作为评估自噬能力的另一种方法，我们测量了SQSTM1/p62自噬衔接蛋白的稳态水平(). 正如预期的那样，氨基酸饥饿增加了WT细胞中SQSTM1的降解，并且在氨基酸饥饿期间加入BafA1阻止了SQSTM2的降解。在氨基酸充足和耗尽的条件下，乌尔克DKO细胞表现出SQSTM1相对于WT细胞的普遍积累，这进一步表明SQSTMI的整体自噬降解受到了损害。
由于LC3脂质过氧化是自噬中相对较晚的事件，18我们检测了ULK1和ULK2的缺失是否影响早期自噬体形成标记物，如WIPI2。WIPI2作为PtdIns3P效应蛋白发挥作用，定位于早期吞噬细胞结构，WIPI2点状结构可以监测BECN1-class III磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3K）通路的活性。28在全营养条件下维持的静止MEF没有显示任何可检测到的WIPI2-阳性点状结构。当缺乏氨基酸时，ULK1KO和ULK2KO细胞仍然能够形成WIPI2阳性点状细胞。然而，乌尔克DKO细胞在此途径中被完全阻断(). 这些结果表明，在对氨基酸饥饿的自噬反应期间，WIPI2的补充依赖于ULK1和ULK2，这可以通过MEF中自噬调节的层次分析给出WIPI1的位置来推断。18虽然WIPI2-阳性结构不是在乌尔克DKO细胞，我们可以确认WIPI2（及其相关家族成员WIPI1）在所有MEF类型中的表达相似，与ULK1/2的表达无关(). 作为另一种策略，我们研究了稳定表达GFP标记锌指的MEF株，FYVE结构域包含1/双FYVE-包含蛋白1（ZFYVE1/DFCP1），该蛋白是PtdIns3P相关的ω小体膜在自噬激活时形成的标记().33氨基酸饥饿促进WT MEF中GFP-ZFYVE1阳性膜的形成增加4倍。相比之下，DKO MEF仅显示少量基础GFP-ZFYVE1阳性结构，但这些结构的形成不受氨基酸饥饿的刺激。这些数据表明，含PtdIns3P的自噬膜的氨基酸依赖性形成在Ulk1/2号机组丹麦克朗。
图2。ULK1和ULK2都是在氨基酸饥饿后形成WIPI2斑点所必需的。(A类)WT、ULK1KO、ULK2KO和DKO原发性MEF在固定前用全营养培养基（F）或EBSS（−AA）处理2 h。然后用WIPI2抗体对细胞进行染色。(B类)在每种情况下的10个字段中（两个独立实验），对Hoechst染色的细胞核（细胞数）和WIPI2点进行量化（WIPI2点状/细胞±SEM）（n=20个字段）。F和−AA之间的差异通过使用Bonferroni事后检验的单向ANOVA表示为*****p<0.0001，无显著性差异。(C类)主要MEF系按(A类). 对细胞裂解物进行ULK1、WIPI1、WIPI2和肌动蛋白的免疫印迹。(D类)将稳定表达GFP-ZFYVE1的WT和DKO#1永生化细胞置于全营养培养基（F）或EBSS（−AA）中培养2h，然后固定。(A和D)比例尺：10μm。曲线图显示点状细胞/细胞（两个实验中每个条件下n=29至37个细胞的平均值±SEM）。在相同条件下，与WT MEF相比的双尾配对t检验：***p<0.0001。
ATG13缺陷细胞的氨基酸反应与DKO细胞相似
在哺乳动物细胞中，ATG13是ULK1/2的专性结合伙伴，与RB1CC1和C12orf44一起构成含ULK1的自噬诱导复合物的重要组成部分。7，13-16ATG13结合ULK1和ULK2的C末端结构域，并可被这些激酶磷酸化。7由于ATG13对自噬至关重要，并且可以与ULK1和ULK2形成复合物，因此我们推断，ATG13耗竭应该与ULK1和ULK1的综合损失具有类似的影响。我们耗尽了附件13在WT和DKO MEF中使用siRNAs并进一步使细胞遭受氨基酸饥饿(). 虽然ATG13在WT和DKO MEF中表现出类似的稳态表达水平，但瞬时siRNA转染明显降低了ATG13水平。ATG13敲除抑制了氨基酸饥饿促进WT细胞LC3脂质化的能力。正如预期的那样，乌尔克DKO MEF（用对照siRNA处理）已经显示，在BafA1存在下饥饿时，氨基酸饥饿诱导的LC3脂质化受损，LC3-II积累量降低。进一步敲除DKO MEF中的ATG13不会产生更高水平的抑制。
图3。ATG13击倒现象乌尔克1/Ulk2公司氨基酸饥饿后LC3脂质代谢途径的双重敲除。(A类)用RISC-Free对照或小鼠转染WT和DKO原代MEF附件13-靶向siRNA。敲除后，用全营养培养基（F）、EBSS（−AA）或含有巴非霉素A的EBSS处理细胞1（−AA+Baf）（100 nM）2 h。用针对ULK1、ATG13、肌动蛋白和LC3（Abcam多克隆）的抗体对溶解的细胞裂解物进行免疫印迹。(B类)平均LC3-II/肌动蛋白密度测定±SEM（n=4）。在相同条件下，对WT-RISC-Free siRNA MEF进行双尾配对t检验：一p=0.067；b条p=0.068；c（c）p＝0.089。
进一步比较ATG13耗竭与乌尔克DKO，我们检测了WIPI2点的形成对氨基酸提取的反应。与LC3数据一致，ATG13敲除抑制了WT中饥饿诱导的WIPI2点形成，乌尔克1和Ulk2公司KO电池。乌尔克DKO MEF没有显示氨基酸饥饿诱导的WIPI2点，ATG13缺失没有进一步影响(). 对照实验证实，siRNA处理不会影响不同MEF品系中WIPI2的水平(图S3). 综上所述，这些数据表明ATG13耗竭和乌尔克DKO对氨基酸提取诱导的自噬有类似的抑制作用。由于ATG13击倒在乌尔克DKO背景下，我们的数据表明ATG13主要通过调节ULK1/2复合物在自噬中发挥作用。
图4。ATG13击倒现象乌尔克1/Ulk2公司氨基酸饥饿后WIPI2-阳性自噬体膜形成的双重敲除。WT、ULK1KO、ULK2KO和DKO主要MEF通过RISC-Free对照或小鼠转染附件13-靶向siRNA。敲除后，细胞在固定前用全营养培养基（F）或EBSS（−AA）处理2小时。用WIPI2抗体对细胞进行染色。比例尺：10μm。
葡萄糖饥饿后的自噬依赖于ULK1/2而非PtdIns3P
除了氨基酸依赖性调节外，当细胞通过涉及AMPK激活和代谢中间氨生成增加的途径缺乏葡萄糖时，还会诱导自噬。21，34，35我们着手确定ULK1/2复合物是否在长时间停糖后调节自噬。WT显示，由于葡萄糖饥饿，脂质LC3-II（归一化为肌动蛋白）水平增加(). 相反，葡萄糖饥饿不会刺激DKO MEF中LC3的脂质化。正如预期的那样，在长时间的葡萄糖饥饿期间，当加入BafA1时，LC3-II积累量很高，并且这种影响在WT和DKO MEF中也同样强大。
图5。组合乌尔克1和Ulk2公司敲除降低LC3对葡萄糖饥饿的脂质代谢反应。(A类)WT或DKO原代MEFs接受全营养培养基（F）、无葡萄糖条件（−Glc）或无葡萄糖培养基+巴非霉素A处理1（−Glc+Baf）（100 nM）持续24小时。用抗ULK1、肌动蛋白和LC3的抗体（Abcam多克隆）对溶解的细胞裂解物进行免疫印迹。“*”表示非特异性带。(B类)用密度计定量LC3-II和肌动蛋白信号。结果显示为平均值±SEM（n=4）。在相同治疗下，对WT MEF进行双尾配对t检验：*p<0.02。
为了验证停糖后缺乏诱导LC3-脂质化的作用，我们检测了WIPI2点的形成。令人惊讶的是，在缺乏葡萄糖的WT MEF中，WIPI2-定位结构未能清晰形成(). 单或双MEF乌尔克同样，在葡萄糖饥饿后，敲除也没有显示WIPI2-阳性点状。根据这些数据，我们假设葡萄糖诱导的自噬并不严格依赖于PtdIns3P的强大积累，PtdIns3P是一种以前被认为对自噬至关重要的脂质信号。29为了研究这个概念，我们测试了PtdIns3K抑制剂沃特曼宁对氨基酸和葡萄糖依赖性自噬的影响。正如预期的那样，在氨基酸饥饿后，沃特曼显著抑制WT-MEF中LC3脂质化的诱导，降低到完全喂养的细胞中观察到的基本水平(). 相比之下，在葡萄糖饥饿期间添加沃特曼可以轻度增加LC3的脂质化。
图6。葡萄糖饥饿不会刺激含有WIPI2的膜的生成。WT、ULK1KO、ULK2KO和DKO初级MEF用全营养培养基（Fed）或无葡萄糖培养基（葡萄糖饥饿）处理24 h，然后固定。用WIPI2抗体对细胞进行染色。比例尺：10μm。
图7。葡萄糖饥饿后LC3脂质化和自噬体形成是PtdIns3P非依赖性的。(A类)将WT初级MEF用含有100 nM沃特曼（−AA+Wm）的全营养培养基（F）、EBSS（−AA）或EBSS处理2 h。或者，将细胞在无葡萄糖培养基（−Glc）或含有100 nM沃特曼的无葡萄糖培养液中培养24 h。用LC3（Abcam多克隆）和肌动蛋白抗体对分解的细胞裂解物进行免疫印迹。结果显示为平均LC3-II/actin±SEM（n=4）。在不含沃特曼的等效治疗条件下进行双尾配对t检验：*p<0.04。(B类)用全营养培养基（F）或EBSS（−AA）处理WT（永生化）MEF 2 h。或者，将细胞在无葡萄糖培养基（−Glc）中培养16 h。如有指示，培养包括100 nM沃特曼（+Wm）。细胞经LC3免疫染色处理后固定。所示为−AA和−Glc条件±沃特曼的典型共焦图像。比例尺：10μm。图中显示了每个条件的点状/单元分布。每列代表一个细胞的定量（40-60个细胞/条件取自两个实验）。所示为每组中包含15个（或更多）点/单元格的单元格百分比。
为了进一步明确PtdIns3P在营养依赖性自噬中的作用，我们研究了抑制PtdIns3K对自噬体膜形成的影响。长期葡萄糖饥饿刺激野生型MEFs中LC3标记的自噬体的形成(). 葡萄糖饥饿后形成的LC3阳性结构通常大于氨基酸饥饿后发现的结构。沃特曼素对PtdIns3K的抑制对氨基酸饥饿依赖性自噬结构产生了更强的抑制作用。氨基酸饥饿后，36%的细胞每细胞出现15个或更多的点状突起，当饥饿期间添加沃特曼时，点状突触减少到5%。相比之下，在葡萄糖饥饿后，24%的细胞显示每个细胞有15个或更多的点状突起，当葡萄糖饥饿期间加入沃特曼时，15%的细胞仍然显示每个细胞15个或多个点状突触。这些发现进一步支持了这样一种观点，即葡萄糖饥饿会诱导先前未经特征化的LC3脂质氧化途径，该途径可以独立于PtdIns3P的生成而发挥作用。
WIPI1是WIPI2的紧密同源物，28GFP标记已被用作含PtdIns3P的早期自噬体膜的标记物。18，36我们已经表明，在含有WIPI1和WIPI2的细胞系中，例如G361细胞，内源性蛋白质有大量重叠。28为了进一步研究WT MEF中葡萄糖饥饿后WIPI2定位膜的缺失，我们比较了添加和不添加沃特曼素的氨基酸或葡萄糖饥饿后内源性WIPI1和WIPI2的定位(). WIPI1和WIPI2水平不受含和不含沃特曼宁的葡萄糖饥饿的影响(图S4). 正如预期的那样，WIPI1和WIPI2点状物是在MEF的氨基酸饥饿后形成的，具有相近但不相同的染色模式。在氨基酸饥饿后，WIPI1-和WIPI2-标记结构的形成均被沃特曼抑制。使用WIPI2与上述结果一致()长时间的葡萄糖饥饿不会刺激含有WIPI1或WIPI2的膜的产生。这些意想不到的发现进一步证实了在缺乏葡萄糖的MEF中，当自噬被激活时，PtdIns3P没有生成。
图8。葡萄糖饥饿后无WIPI1-和WIPI2-阳性自噬体膜。WT初级MEF在全营养培养基（Fed）、EBSS（−AA）或含有100 nM沃特曼（−AA+Wm）的EBSS中培养2小时。或者，在固定之前，细胞在没有或含有100 nM沃特曼宁（−Glc，−Glc+Wm。用WIPI2（红色）和WIPI1（绿色）抗体对细胞进行染色。比例尺：10μm。放大的插图显示了氨基酸饥饿后的WIPI2和WIPI1共定位（箭头：强共定位；箭头：部分）。
讨论
Ulk1和Ulk2的功能冗余
哺乳动物的ULK家族是酵母激酶Atg1的直系同源物，Atg1是第一个被鉴定为自噬所需的蛋白质酿酒酵母.37ULK蛋白在自噬调节途径中起着关键作用。38根据目前的共识，ULK1和ULK2等家族成员与ATG13、RB1CC1和C12orf44一起构成核心自噬调控复合体。该核心ULK复合物被提议整合来自MTORC1和AMPK的营养依赖信号，以调节自噬的激活。
哺乳动物ULK家族包含多达五个成员（ULK1-4和STK36），尽管只有ULK1和ULK2在整个蛋白质长度上显示出广泛的序列同源性。39ULK1/2功能性体内冗余的最明确证据是单个小鼠的正常生存能力乌尔克1或Ulk2公司基因敲除小鼠与其他重要自噬基因敲除导致的明显新生儿或出生后死亡形成对比。25，26，30-32当我们穿越乌尔克1和Ulk2公司KO鼠标线以生成Ulk1/2号机组在DKO模型中，我们观察到第13.5天双敲除胚胎和围生儿死亡率降低（Tooze SA，未发表）。34我们的相应数据乌尔克-MEF培养的缺陷使ULK1/2细胞功能冗余更加清晰。ULK1缺失导致部分自噬阻滞，但仍具有营养反应性。另一方面，ULK2的缺失导致细胞自噬标记物适度升高，这可能反映了ULK1的补偿作用。重要的是，氨基酸或葡萄糖饥饿引起的自噬激活在两种情况下都被强烈抑制乌尔克1和Ulk2被删除。然而，即使在ULK1/2缺乏的情况下也会出现一些残余自噬。Ulk1/2号机组营养缺乏时，DKO MEF在溶酶体通量受阻的情况下，仍累积有LC3和自噬体膜，尽管其程度大大降低。这些数据表明，尽管不存在ULK1/2复合物，但下游自噬机制仍以低但可检测的速率发挥作用。其他已发表的结果支持细胞氨依赖型自噬，其功能独立于ULK1/2。34也有可能在Ulk1/2号机组DKO条件下，其他ULK家族成员（ULK3、ULK4和STK36）可能会进行补偿，以支持低水平的残余或非规范自噬。ULK3与肿瘤诱导的细胞衰老过程中激活的一种特定的自噬亚型有关，40但ULK4和STK36均未与自噬有关。
我们以前的研究表明，ULK1/2 C末端结构域能够以显性负向方式抑制饥饿诱导的自噬7表明这些过度表达的片段竞争必要的ULK1/2结合伙伴，如ATG13或RB1CC1。12-14与关键ULK1/2-ATG13-RB1CC1自噬复合物的概念一致，我们观察到ATG13敲除单独抑制饥饿依赖性自噬的程度与Ulk1/2号机组丹麦克朗。此外，ATG13敲除在Ulk1/2号机组DKO背景，可能是因为该综合体已经被破坏。我们从MEF获得的数据与从鸡B细胞系统获得的观察结果形成对比，后者表明ATG13和RB1CC1的自噬调节作用独立于ULK1/2。41进一步的研究应阐明哺乳动物ATG13和RB1CC1在特定细胞环境中是否具有类似的ULK非依赖性自噬作用。
葡萄糖饥饿依赖性自噬独立于PtdIns3P
我们的进一步研究结果表明，缺乏稳定的PtdIns3P生成的情况下，缺乏葡萄糖的细胞有能力进行自噬，而PtdIns3P生成长期以来一直被认为是自噬的必要条件。29在自噬途径的早期，PtdIns3P由ER-localized PIK3C3/Vps34-BECN1-ATG14 PtdIns3K复合物生成。42，43MEF自噬调节的层次分析将ULK信号定位于PIK3C3-BECN1-ATG14 PtdIns3K复合物上游的功能18以及使用WIPI2和ZFYVE1标记的结果Ulk1/2号机组DKO MEF与此模型一致。当PIK3C3-BECN1-ATG14 PtdIns3K复合物转位到内质网时，WIPI2被招募到omegasome处的PtdIns3P并继续修饰吞噬细胞或新生自噬体。有几篇关于WIPI和ULK家族成员在形成自噬体方面共定位的报道。18，44氨基酸饥饿后LC3脂质化需要WIPI2，这突出了PtdIns3P效应器在自噬启动级联的进一步下游步骤中的作用。28
在这里，我们观察到缺乏葡萄糖的细胞无法形成WIPI2点，而它们确实表现出LC3脂化升高。我们验证了WIPI1，18，36当细胞缺乏葡萄糖时也未能形成点状，这与Pfister等人一致。Pfister等人在MEF系统中研究GFP-WIPI1标记物。44由于WIPI1和WIPI2都绑定PtdIns3P，28，36我们质疑缺乏PtdIns3P生成的葡萄糖饥饿细胞是否能够自噬。当细胞缺乏葡萄糖时，内质网生成PtdIns3P的需求似乎被取消，因为我们检测到LC3脂质氧化和自噬体的生成，即使存在PtdIns3K抑制剂沃特曼。根据先前的结果，Wortmann抑制了氨基酸缺乏细胞中LC3的脂质化和膜形成。29
对核心调节因子有不同依赖性的自噬途径已被确定，并统称为非标准自噬。35描述了一种ATG5-ATG7非依赖性自噬机制45尽管这些基因中任何一个的缺失都会导致小鼠的新生儿死亡。30，31另一个例子是，白藜芦醇诱导了一种非经典形式的自噬，这种自噬在某些情况下被证明是BECN1和PtdIns3P独立的。46另一些人报告称，白藜芦醇依赖性自噬对沃特曼和WIPI1/2功能部分敏感，但在没有WIPI1/2阳性结构形成的情况下发生。47我们之前从HEK293细胞获得的数据表明，reservatol治疗可诱导内源性WIPI2-阳性点状细胞。28我们在这里提供的数据表明，在没有明显的PtdIns3P生成或WIPI2募集到omegasome和新生自噬体的情况下，存在葡萄糖饥饿依赖性自噬的可能性。该途径仍然需要ULK1和ULK2，但PIK3C3-BECN1-ATG14 PtdIns3K复合物在非经典自噬过程中的明显旁路仍有待探索。
材料和方法
试剂和抗体
巴菲尔霉素A1和沃特曼来自Calbiochem或Tocris Bioscience。SiGENOME siRNAs由Dharmacon/TermoScientific生产。完整的蛋白酶抑制剂片（04693124001）购自罗氏公司。Immobilon-P PVDF膜（IPVH00010）来自Millipore。Amersham ECL western blotting检测试剂（RPN2106）和Amersham Hyperfilm MP高性能放射自显影胶片（28-9068-45）来自GE Healthcare。Restore PLUS western blot剥离缓冲液（46430）来自ThermoScientific。
兔抗LC3B（ab48394）和兔抗肌动蛋白（ab8227）来自Abcam。小鼠抗LC3（5F10）来自德国Teningen的Nanotools。小鼠抗肌动蛋白（克隆AC-40，所有肌动蛋白亚型）来自Sigma-Aldrich。豚鼠抗SQSTM1（p62-C）来自Progen。抗磷酸乙酰辅酶A羧化酶（Ser 79，#3661）、抗磷酸核糖体RPS6蛋白（Ser 240/244，#2215）和抗LC3（免疫细胞化学，#2775）多克隆兔抗体来自细胞信号技术。先前描述了小鼠抗WIPI2、兔抗WIPI1和兔抗ATG13。7，28根据制造商的说明，针对小鼠ULK1序列的肽CSGRPGPFSSNRYGASV生成多克隆兔抗ULK1抗体，并使用SulfoLink肽固定试剂盒（Pierce）进行亲和纯化。Alexa fluor 555结合驴抗鼠抗体（A31570）、Alexa fluor 488结合驴抗兔抗体（A21206）和Alexa fruor 680结合驴抗小鼠抗体（A21057）来自Invitrogen。Dylight 800偶联的山羊抗兔抗体（35571）从Thermoscientific获得。从Sigma-Aldrich中获得了与HRP偶联的驴抗兔IgG（NA934V）和与HRP结合的驴抗鼠IgG。
ULK基因敲除小鼠
ULK1靶向小鼠来源于AC0566胚胎干细胞系（Wellcome Trust UK，Sanger Institute Gene Trap Resource），该细胞系在小鼠9.8 kb内含子3至4内携带pGT0lxr基因陷阱插入乌尔克1轨迹。pGT0lxr基因陷阱盒包含β-地理选择标记（β-半乳糖苷酶/新霉素抗性融合）的2剪接受体5引物。利用ES细胞衍生的基因组DNA，通过PCR绘制内含子3内的基因陷阱插入位置（更多详细信息请参阅图S1). 一位创始人携带乌尔克1靶向性回交到C57/Bl6菌株上10代。Ulk2公司敲除小鼠由C.Tournier博士（英国曼彻斯特大学）提供，并在之前进行了描述。26
乌尔克1淘汰赛和Ulk2公司基因敲除小鼠杂交产生乌尔克1/Ulk2公司双杂合小鼠。乌尔克1/Ulk2公司将双杂合子杂交产生本研究所描述的不同基因型。所有动物工作均按照英国内政部和英国癌症研究机构的指导方针进行。
小鼠胚胎成纤维细胞的产生和培养
在受孕后13.5天处死怀孕的雌性小鼠，并取下子宫角。将分离的胚胎斩首，并去除内脏。保留组织进行基因分型。将剩余的身体组织切碎，然后用0.05%的胰蛋白酶稀释在0.2 g/L versene和100 Kunitz单位/mL DNase I中进行消化。向消化后的组织中添加温MEF培养基（DMEM、20%FBS、pen/strep和4.8 mM L-谷氨酰胺），将其短暂研磨，使剩余的大组织碎片沉降。低速旋转含有上清液的细胞，将每个胚胎产生的细胞颗粒重新悬浮在温暖的MEF培养基中，并将其置于10 cm的组织培养皿中。24小时后，丢弃未连接的细胞。MEF保存在MEF培养基中。通过连续传代获得的稳定复制原代培养物用于实验。通过从pBabePuro载体中转染表达SV40 T抗原的逆转录病毒使MEF永生化。实验使用了传说中所示的原始线或永生线。为了产生稳定表达GFP ZFYVE1的MEF，33的编码部分GFP-Zfyve1号机组将其亚克隆到pBabeHygro逆转录病毒载体中，并使用病毒库转导永生化MEF系，然后在含潮霉素的培养基中进行选择。
基因分型
用补充了0.1 mg/mL蛋白酶K的DirectPCR试剂（Viagen，101-T）消化用于产生MEF的胚胎组织。PCR MegaMix-Blue（2MMB-5）来自Microzone，Ltd乌尔克1野生型等位基因为F:5′-ACTCGTGAGATCTCATGGCACATGG-3′和R:5′-GCATAAATAGAGAGTGGCACAGC-3′。针对基因陷阱盒的引物(乌尔克1敲除等位基因）为F:5′-ACACCAGGTCCCAGGTCCCG-3′和R:5′-TTCAGGCTGCAACTGTG-3′。底漆Ulk2公司以前曾报道过等位基因。26
成绩单分析
MEF培养物在Trizol试剂（Invitrogen Lifesciences）中进行裂解，并根据制造商的方案提取总RNA。使用寡核苷酸-dT引物和Bioscript逆转录酶（Bioline试剂）从等量的总RNA合成第一链cDNA。根据制造商的协议，使用SensiMix SYBR（no-Rox）（生物线试剂）试剂盒进行定量PCR。实时PCR引物：乌尔克1正向TGCCCTTGATGAGATGTTCC，乌尔克1反向AGTCTCCTCAATGCACAGC；Ulk2公司转发TCGTTTATCGCTACCAAGG，Ulk2公司反向GCCTGCTACTCACAGTTGC；β-肌动蛋白正向GCCTTCCTTTGGGTATGG，β-肌动蛋白反向GCACTGTGTTGGCATAGAGG。
siRNA的转染
使用针对小鼠Atg13双链2（Dharmacon，D-053540-02）和RISC-Free对照siRNA（D-001220-01）的siRNA对MEF进行敲除。在用MEF培养基替换细胞之前，用20 nM siRNA和0.25%Oligofectamine在OptiMEM中处理细胞6 h。24小时后重复siRNA转染。再过24小时，刷新培养基，24小时后将细胞用于实验。
氨基酸和葡萄糖饥饿
对于氨基酸饥饿，用新鲜MEF培养基、EBSS或带有巴非霉素A的EBSS冲洗和处理细胞1对于葡萄糖饥饿，用新鲜MEF培养基、无葡萄糖MEF培养液（无葡萄糖DMEM、透析FBS、青霉素/链霉素）或无葡萄糖MEF-培养基和巴非霉素A冲洗并处理细胞2 h116至24小时。如图例所示，在收获前16或24小时，向葡萄糖饥饿样品中添加100 nM沃特曼。在收获前2小时，在开始氨基酸饥饿处理的同时，向这些培养物补充额外的100 nM沃特曼。
免疫印迹
用PBS洗涤MEFS，并在补充有完全蛋白酶抑制剂的TNTE缓冲液（20mM Tris pH 7.4、150mM NaCl、5mM EDTA、1%TritonX-100）中裂解。将裂解液离心，并使用核后上清液进行免疫印迹。将浓缩的莱姆利缓冲液添加到裂解液中，加热样品，然后使用MES缓冲系统通过电泳在4–12%梯度双三丙烯酰胺（NuPAGE）凝胶上进行拆分。转移到PVDF膜上的蛋白质用5%牛奶/TBS封闭，并用抗LC3、抗肌动蛋白、抗ATG13、抗ULK1或抗SQSTM1孵育。按照制造商的方案，在5%BSA/TBS/0.1%吐温20中隔夜培养含磷-ACC和含磷-RPS6一级抗体。使用适当的二级抗体检测一级抗体，并使用标准增强化学发光和薄膜进行开发。使用ImageJ软件（NIH）对胶片扫描的密度测定进行量化。或者，使用Odyssey（Li-Cor Biosciences）红外定量成像系统可视化LC3（5F10）、磷酸-ACC、磷酸-RPS6和相应的肌动蛋白印迹。
长期蛋白质降解分析
如前所述，进行了长效蛋白降解。48简单地说，在含有65µM缬氨酸和10%透析FCS的DMEM中，用0.2µCi C14-缬氨酸标记35 mm WT、DKO#1和DKO#2 MEF培养皿24小时。24小时后，用含有2 mM缬氨酸的全培养基替换培养基。额外24小时后，将细胞清洗并返回至全培养基，或在EBSS中孵育2小时。培养基和细胞收集，并按所述计算长期蛋白质降解百分比。48
免疫荧光
将镀在玻璃盖玻片上的MEF用3%多聚甲醛固定20分钟，并用100%冰镇甲醇渗透。用50 mM NH淬灭醛自荧光4Cl/PBS 20分钟。用5%BSA/PBS封闭细胞，并用小鼠抗WIPI2（1:400）或兔抗WIPI1（1:500）在1%BSA/PBS中孵育。用PBS清洗细胞，用Alexa fluor 555结合的驴抗鼠IgG在1%BSA/PBS中孵养。WIPI1/2的图像是使用40×/1.2NA物镜和Zen 2010软件在蔡司LSM 780共焦显微镜上采集的。对于内源性LC3的免疫染色，在与抗LC3（细胞信号）孵育过夜之前，将固定在多聚甲醛和渗透的甲醇中的MEFs封闭在明胶/PBS中。用抗兔Alexa fluor 546进行初步染色。稳定表达GFP-ZFYVE1的MEF被镀在玻璃盖玻片上，在固定和可视化之前按照指示进行处理。在装有HCX PL APO CS-63x-1.4NA物镜和HyD GaAsP检测系统（Leica Microsystems）的Leica TCS SP5共聚焦显微镜上捕获内源性LC3染色和GFP-ZFYVE1荧光。
点子的量化
WIPI2-阳性斑点使用Imaris软件（Bitplane）自动计数。对于两个实验中的每一个，每个条件都获得了10个场。人工计数Hoechst染色细胞核。每个实验都设定了阈值和斑点大小。使用ImageJ中设计的自定义图像分析宏量对LC3免疫染色进行量化，该宏量报告了单细胞图像中的点状和区域。只有超过阈值大小的点被用于分析以排除背景。GFP-ZFYVE1 punta的图像由一名不知道样本身份的观察者手动评分。使用Prism软件（Graphpad）编译数据。统计测试详见图表图例。
致谢
我们感谢Cathy Tournier慷慨赠送Ulk2公司−/−老鼠。F.M.和S.A.T.感谢英国癌症研究所的资助。威廉姆森感谢英国生物技术和生物科学研究委员会的支持。E.Y.W.C.感谢伦敦皇家学会（Royal Society of London for Improvement Natural Knowledge）的支持。我们感谢Nicholas Ktistakis慷慨捐赠GFP-DFCP1（ZFYVE1）质粒，并感谢Noboru Mizushima获得永生附件5−击倒MEF。我们感谢Nahoum Anthony在用于图像数据分析的Perl编程方面提供的帮助。F.M.和S.A.T.感谢实验室成员的有益讨论和阅读手稿。
词汇表
缩写：
| 行政协调会 | 乙酰辅酶A羧化酶 |
| AMPK公司 | AMP活化蛋白激酶 |
| BafA1型 | 巴菲尔霉素A1 |
| BECN1公司 | 贝克林1 |
| MTOR公司 | 雷帕霉素的作用靶点 |
| PtdIns3K型 | 磷脂酰肌醇3-激酶 |
| 铂族锡3P | 磷脂酰肌醇3-磷酸 |
| RB1CC1型 | RB1-感应线圈1 |
| RPS6系列 | 核糖体蛋白S6 |
| SQSTM1系列 | 隔离体1 |
| 乌尔克 | 未配位51样激酶 |
| ZFYVE1型 | 锌指，FYVE域包含1 |
工具书类
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