结果
确定一个DFCP1域对ER靶向是必要的和充分的
为了解释其不寻常的定位，我们假设DFCP1可能包含一个新的结构域，使其能够独立于其FYVE结构域靶向ER/高尔基体。先前的工作也表明在残基416–602中存在这样的结构域(Cheung等人，2001年). 该区域周围DFCP1的GFP标记片段鉴定出416–543氨基酸之间的一个结构域()，当单独表达时，局限于ER(，GFP-ER）。该域中的几个残基被作为进一步诱变的靶点(，红色和下划线），基于其跨物种的保护和C末端的精细绘图（未描绘）。W543、H541或三个显示的半胱氨酸残基的突变导致了具有细胞质定位的蛋白质(W543A为GFP-ER（W/A），其他未描述）。这些残基在野生型（WT）或双FYVE域突变（DM）背景的全长蛋白中也被诱变（DM包含两个点突变，使两个FYVE-域失活；如Ridley等人，2001年). 虽然WT和DM主要局限于ER/Glgi(、myc-DFCP1和myc-dmDFCP1；Ridley等人，2001年)，关键残基的突变导致细胞质定位(W543A的myc-DFCP1（W/A）和myc-dmDFCP1。因此，DFCP1位于内质网/高尔基体膜上而非内体上的原因是它包含一个ER靶向结构域，该结构域在两个FYVE结构域中占主导地位。为了提供关于该结构域结合特性的生化数据，我们创建了GST标记的构建物并在细菌中表达。该结构域来源于与大鼠肾脏分离的微粒体结合的WT蛋白，而W543A点突变降低了结合(). 有趣的是，微粒体膜的胰蛋白酶消化并没有抑制这种结合，这表明该结构域与脂质或胰蛋白酶敏感性蛋白表位结合。识别此域的绑定伙伴的工作正在进行中。
DFCP1中ER靶向结构域的鉴定和部分表征。（A） DFCP1的连续截断确定了一个内部域，这对于在ER中指定本地化是必要的，也是足够的。ER本地化需要用红色和下划线表示的残留物。（B） GFP-[416–543]结构定位于HEK-293细胞中的内质网，而该结构域内的突变体（此处显示的是W543A结构）是细胞溶质的。如图所示，在ER靶向中重要的选定残基也在全长蛋白中被诱变。全长DFCP1（myc-DFCP1）定位于ER，而DM（myc-dmDFCP1。关键残基的突变导致细胞质重新分布（此处显示为W/A突变）。所有样本均含有钙连蛋白（CLNX）抗体，钙连蛋白是一种内质网蛋白。（C） 将416–543结构域的WT或W/A突变体纯化为GST融合蛋白（输入），并与大鼠肾脏微粒体混合。结合材料通过离心回收。注意，野生型衍生蛋白与微粒体结合，而W/A突变体则没有。（D） 在用GST-[416-543]结构域孵育和离心之前，用指示单位的胰蛋白酶在冰上处理C中的微粒体。注意，微粒体上发现的外周蛋白β-COP几乎完全被胰蛋白酶消化；在这些条件下，DFCP1片段与微粒体的结合没有改变。
氨基酸饥饿期间DFCP1易位到点状隔室
为了研究DFCP1的功能，我们建立了表达myc标记蛋白的克隆HEK-293细胞系。在稳定的细胞系中，WT DFCP1和DM定位于ER/Glgi(，对照组），尽管只有WT蛋白结合PI（3）P(). 因为PI（3）P已被证明参与自噬(Lindmo和Stenmark，2006年)，我们检测了氨基酸饥饿期间DFCP1的定位，发现WT DFCP1易位到点状隔室，而DM(，底部），W/A突变体没有（未描述）。转移被已知的自噬抑制剂如3-甲基腺嘌呤和沃特曼抑制(). 饥饿后对DFCP1的免疫染色显示，点状结构与任何已知的细胞器（内质网出口部位、高尔基体、早期/晚期内体、溶酶体、线粒体，未描述）均不对应，但似乎与内质网相邻(). 点状小室部分与自噬体共定位，如GFP标记的MAP-LC3的瞬时表达所定义(；Kabeya等人，2000年). 一般来说，60%的myc-DFCP1点与GFP-MAPLC3在固定细胞中共定位，但我们认为这是基于两种蛋白质之间的动态相互作用的低估（见下文）。
饥饿诱导的和PI（3）P依赖的DFCP1向点状结构的易位，部分与自噬体共定位。（A） 表达WT DFCP1或DM的细胞的裂解液用与PI（3）P偶联的亲和凝胶珠培养；WT DFCP1与PI（3）P结合，而DM没有。in，输入的5%。（B） 表达WT DFCP1或DM的稳定HEK-293细胞系未经处理或缺乏氨基酸90分钟。然后固定细胞并对其进行DFCP1染色。正常情况下，WT和DM DFCP1都局限于ER/Glgi；饥饿后，只有WT易位为点状结构。（C） 如DFCP1固定和染色前所示，稳定表达WT DFCP1的HEK-293细胞单独饥饿或在3-甲基腺嘌呤（MA）或沃特曼（麦芽）存在下饥饿。（D） 表达DFCP1的饥饿HEK-293细胞与内质网标记物（如calnexin和KDEL）共染。（E） 用GFP-MAP-LC3转染稳定表达WT-DFCP1的HEK-293细胞，并饥饿90分钟。请注意，在表达WT DFCP1的细胞中，MAP-LC3和DFCP1在饥饿时都易位到点状结构，其中一些是共定位的。棒材：（A–C和E）20μm；（D） 0.5微米。
饥饿诱导的PI（3）P富集区与内质网和自噬体相关
由于饥饿诱导的DFCP1易位需要功能性FYVE结构域，并且对PI（3）P形成抑制剂敏感，我们假设这一运动反映了饥饿期间PI（3P）池的形成和识别。另外两个PI（3）P-特异性探针被用于进一步探索这一点：一个来自FENS-1的分离的FYVE结构域(Ridley等人，2001年)或p40 PHOX中分离的PHOX同源（PX）结构域(Bravo等人，2001年). GFP-FYVE和GFP-PX与ER/Glgi上的DFCP1不同，它们与早期内体标记物（如早期内体抗原1[EEA1]，未发表的数据）部分共定位。氨基酸饥饿后，所有三种蛋白质都变得更加点状（图S1，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1)，但MAP-LC3主要与DFCP1共定位，与其他两个PI（3）P探针共定位的更少（图S1）。这些结果表明，在氨基酸饥饿期间形成了多个PI（3）P池，DFCP1可能是与ER相关的池的最合适报告者。为了直接解决这个问题，我们将DFCP1的ER靶向结构域融合到FENS-1的FYVE结构域，以生成一个连接到ER外围的PI（3P）探针。该探针（GFP-ERFYVE(Ridley等人，2001年)显示了10倍的更少绑定(). 正常条件下这四种蛋白的定位与预期一致：GFP-FYVE是细胞溶质的，部分为间断结构，而其他三种结构在ER/Glgi膜上发现(，顶部）。氨基酸饥饿后，GFP-FYVE变得更具斑点状（如上所示），而GFP-ER和GFP-ERFYVE*没有变化。值得注意的是，GFP-ERFYVE完全重新分配到点状隔间(，底部）。与DFCP1一样，GFP-ERFYVE结构的重新分布被沃特曼（和3-MA，未描述）抑制，但不受布氏菌素A（BFA；). 此外，GFP-ERFYVE点状隔室与ER相邻，部分与MAP-LC3共定位().
FYVE结构域在依赖PI（3）P的途径中与内质网易位外周连接到饥饿诱导的点状结构。（A） 来自FENS-1的GFP-FYVE结构域与PI（3）P-偶联的脂珠结合，而DFCP1的GFP-ER靶向结构域显示出很少的结合（前四个通道；输入的5%；3P，与PI（3）P-偶联的珠结合的部分）。FENS-1 FYVE结构域融合到DFCP1的ER结构域（GFP-ERFYVE*）的构建物维持PI（3）P结合，而FYVE-结构域中点突变的构建物（GFP-ERFYVE**）的结合明显减少。（B） 表达A中所示四种结构的稳定细胞系在固定和荧光显微镜检查前未经处理或饥饿45分钟。请注意，GFP-ERFYVE结构在饥饿时转移到点状结构。（C） 将表达GFP-ERFYVE的细胞单独饥饿或在所述的沃特曼宁或BFA存在下饥饿。（D） 表达GFP-ERFYVE并饥饿45分钟的细胞要么使用KDEL抗体进行ER复染（顶部），要么与mRFP-MAP-LC3共转染（底部）。请注意，GFP-ERFYVE点状结构经常位于ER上，并显示与LC3部分共定位。右侧面板显示了左侧装箱区域的放大视图。棒材，10μm。
为了完全摆脱DFCP1，我们构建了一个由FENS-1的FYVE结构域组成的新报告子，该结构域通过跨膜结构域锚定在ER膜上。这种尾锚定蛋白以前曾被广泛研究过(Bulbarelli等人，2002年；Borgese等人，2007年). 如前所述，具有这种来源于细胞色素b5的锚定物的GFP定位于内质网(Bulbarelli等人，2002年)并且在氨基酸饥饿期间不会移位(). 相反，GFP-FYVE-TM蛋白在正常生长条件下位于内质网()在点状结构（未描述）上的一小部分细胞在饥饿时转移到点状结构(). 一个单点突变失活FYVE结构域的构建物没有易位()这表明点状定位需要PI（3）P识别。为了支持这一点，GFP-FYVE-TM结构在点状结构上的定位被沃特曼（未描述）完全抑制。这些GFP-TM-FYVE点状结构部分与MAP-LC3共定位()和经常被包围的RFP阳性结构(，箭头）。这种定位为这个隔间的功能提供了线索，稍后将进行详细讨论。在实时成像实验中，GFP-FYVE-TM的易位发生在30分钟内，而在相同的细胞中，dsRED-ER（一种带有ER滞留信号的dsRED蛋白）的定位没有改变(和视频1，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1). 最后，我们经常在这些细胞中看到GFP-FYVE-TM环的形成和塌陷，如（箭头标记早期阶段的粒子）。这些结构也在DFCP1的实时成像过程中看到，稍后将详细讨论。
ER-anchored FYVE结构域在依赖PI（3）P的途径中转位到饥饿诱导的点状结构。（A） 三个基于GFP的构建物装配有一个连接区、一个跨膜结构域（TM）和一个短的细胞质尾部：GFP单独（GFP-TM）、GFP融合到FENS-1的WT FYVE结构域（GFP-TM-FYVE），以及GFP融合至无法结合PI（3）P（GFP-FYVE*-TM）的FENS-1 FYVE-结构域的点突变。所有三种构建体都在HEK-293细胞中瞬时表达，并在氨基酸饥饿或不饥饿的情况下检测它们的定位60分钟，如图所示。请注意，GFP-TM-FYVE在饥饿期间易位到点状结构。（B） 用GFP-FYVE-TM和mRFP-LC3转染HEK-293细胞，并饥饿60分钟。注意，两名报告人的点状细胞共定位，GFP结构经常环绕mRFP-LC 3膜（箭头所示）。总的来说，细胞中GFP-FYVE-TM比mRFP-LC3点多，平均80%的LC3点与GFP-FYVE-TM颗粒共定位。插图显示了装箱区域的放大视图。（C） HEK-293细胞共存GFP-FYVE-TM和dsRED-ER并饥饿60分钟的实时成像。另请参阅视频1（可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1). （D） C（底部中间，方框）中显示的区域在饥饿期间展开并显示28-40分钟。注意环状粒子的形成和坍塌。箭头标记处于早期阶段的粒子。棒材：（A–C）20μm；（D） 1微米。
饥饿期间PI（3）P室的实时成像
为了研究自噬过程中点状室的动力学，我们建立了表达GFP标记的DFCP1的HEK-293稳定细胞系。我们从myc-DFCP1稳定细胞系的研究中注意到，高水平的DFCP1（但不是DM）特异性抑制了自噬体的形成（图S2，A-D，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1GFP-MAP-LC3过表达；内源性MAP-LC3未描述）。在活体成像研究中，选择并检测了几个克隆。与myc-DFCP1类似（图S2，A–D），GFP-DFCP1的高表达抑制了自噬体的形成，如电泳期间MAP-LC3向点状结构的易位和II型形式的形成所测(克隆206和231）。在剩下的工作中，我们选择了克隆201，该克隆对饥饿有良好的反应，并且可以被沃特曼治疗所抑制，但对BFA不敏感().
表达GFP-DFCP1的稳定HEK-293克隆的分离和鉴定。（A） 筛选了四个克隆以检测GFP-DFCP1的表达（插图显示了内源性DFCP1和GFP-DFCP 1的印迹，以β-COP作为负荷控制；标记的DFCP1在内源性DFCP 1上的过度表达也显示了折叠），并通过GFP-MAP-LC3向点状结构的易位来检测饥饿的良好反应（如图所示）或获得内源性LC3-II形式（插图的最后一条车道）。高水平的DFCP1抑制饥饿反应（克隆206尤其明显）。误差条显示了三个独立实验的标准偏差。（B） 如图所示，克隆201细胞未经处理或在没有或存在沃特曼（wortmannin）或BFA的情况下饥饿45分钟，并通过荧光显微镜检查GFP-DFCP1的分布。注意，沃特曼抑制易位，而BFA则没有作用。（C） 用抗Vps34或beclin-1的siRNA或如图所示的对照siRNA处理克隆201细胞，饥饿60分钟，并用荧光显微镜检查。注意，Vps34和beclin-1减少的细胞中点状结构水平降低；这是针对D中的三个独立实验进行分析的（误差条显示标准偏差）。（D，插图）siRNA处理后Vps34和beclin-1的水平。这项工作的外围关注点是，在beclin-1的siRNA治疗期间，Vps34的减少是可重复的。（E） 克隆201细胞饥饿60分钟。成像速度为每20秒1帧，显示整个序列中选定的帧。另请参阅视频2（可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1). （F） 对于选定的时间间隔（大约在饥饿后35分钟开始），显示了一个显示omegasome形成和崩溃的序列（箭头）。棒材（A–C和E）20μm；（F） 2微米。
已知酵母和哺乳动物的自噬依赖于Vps34及其适配器beclin的功能。我们针对这两个基因使用siRNA来确定DFCP1反应是否依赖于这些蛋白质的功能。在Vps34和beclin水平降低50–80%的条件下(，插图），我们观察到DFCP1点状结构的水平显著降低了50-60%().
饥饿期间的实时成像显示，DFCP1随着时间的推移变得更加点状，在饥饿后约50分钟达到峰值(和视频2，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1). 虽然整体形态趋于点状，但随着时间的推移，单个环状点状结构不断形成和坍塌(). GFP-FYVE-TM构造也可以看到这些结构(). 它们的最大直径平均为1μm，寿命（从形成到坍塌）为～6–7分钟。因为它们经常与潜在ER（见下一节）一起形成Ω状，所以我们称之为“ω形”
omegasomes与自噬体和内质网的相互作用
DFCP1特异性点状结构（ω体）非常动态，部分与内源性自噬特异性蛋白（如MAP-LC3和ATG-5；图S3，A-C）共定位。因此，我们通过实时成像检查了氨基酸饥饿对共表达GFP-DFCP1、mRFP-MAP-LC3和CFP-ER（一种含有ER定位信号的CFP蛋白）的动态分布的影响。从这些视频中可以明显看出，自噬体在ω体内形成，并与内质网动态平衡。饥饿期间10分钟间隔的特征序列如所示（和视频3，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1). 开始时，少量DFCP1集中在ER链的边缘(，GFP-DFCP1面板上的箭头）。作为时间的函数，DFCP1增大了，并且在某些时候(，37′），MAP-LC3开始在同一区域积聚（RFP-LC3面板上的箭头）。DFCP1和MAP-LC3在接下来的5分钟内膨胀(，40′–41′），直到DFCP1ω气团完全包围MAP-LC3粒子。值得注意的是，所有这些扩展都对应于基础ER链的变化，但三个域（ER、DFCP1和MAP-LC3）仍然是不同的(，插入40′时间点）。当DFCP1 omegasome达到最大直径时，LC3粒子开始离开它(, 41′40′′–44′). 这是一个非常复杂的运动，它似乎涉及LC3颗粒在离开omegasome时对DFCP1染色膜的某种获取（“涂层”）(，插入42′20〃时间点；注意淡绿色勾勒出红色颗粒）。最后，在序列后期，LC3颗粒几乎完全没有DFCP1染色，所有DFCP1都被吸收回内质网(，46′及以上）。进一步探讨了这些结果的几个方面。
通过活体成像和固定细胞中含PI（3）P的ω体和内质网和自噬体的关系。（A） 用mRFP-MAP-LC3（红色）和CFP-ER（蓝色）转染克隆201细胞并饥饿60分钟。以每10秒1帧的速度进行成像，并显示此序列中的选定间隔，从饥饿后33分钟开始。箭头表示首次出现可识别的ω体（绿色）和自噬体（红色）。放大的面板来自两个方框区域，按顺序表示（1）ER、（2）DFCP1、（3）MAP-LC3、（4）ER-MAPLC3、（5）DFCP1-MAPLC3和（6）MAPLC3-ER的视图。另请参阅视频3（可从http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1). （B） 利用TIRFM成像研究ω和ER的动态关系。注意，ω在含有ER的区域形成并在那里崩塌。另请参阅视频4。（C） 饥饿45分钟后解冻克隆201细胞冰冻切片，并双重标记抗GFP-DFCPI（箭头，10纳米金）和抗PDI（箭头、5纳米金）。请注意，在PDI标记的内质网膜附近，标记有DFCPI-GFP的自噬样空泡（星号）。这是多面板补充图的一个面板（图S4）。（D） 从GFP-DFCP1和mRFP-MAP-LC3在饥饿期间的实时成像中选择的帧，由此形成中间产物，其中MAP-LC3似乎从omegasome发芽，同时仍被DFCP1染色膜勾勒出来。每块面板的底部都是这些结构的线条图，使用了相关框架的放大照片。另请参阅视频6。（E） 利用外源性应用的PI（3）P-结合蛋白对ω体进行结肠化。克隆201细胞饥饿60分钟，用硝化纤维素穿孔，并用纯化的p40的GST-PX结构域染色凤凰（phox）大多数GSP-PX结构域对早期内体进行染色（未描述），但大量蛋白质也与DFCP1 omegasomes（F和G）结合。（F和G）ω体与自噬蛋白和ER的关系。如图所示，克隆201细胞用内源性ER和内源性MAP-LC3或Atg5抗体反染。放大面板1-5中显示了从这些细胞中选择的示例（除了显示的示例外），其中ER位于单层中，并且从胞浆中很好地分离出来，以便评估共定位。棒材：（A、B和D）1μm；（E–G）20μm。
omegasomes与ER的关系
为了获得omegasome–ER动力学的另一种观点，我们使用了全内反射荧光显微镜（TIRFM），可以更清楚地观察ER(和视频4，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1). 这些电影显示，ω体从头形成，其膨胀和塌陷伴随着潜在ER的变化。共焦实时成像期间，ER和ω体之间的空间关系类似，DFCP1环与等效ER环位于同一平面上（图S3 D）。为了获得更高分辨率的omegasomes和ER视图，我们使用免疫电镜。解冻后，用抗GFP和抗蛋白二硫异构酶（PDI；ER标记物）对醛固定细胞的冰冻切片进行双重标记；GFP-DFCP1标记的结构在大多数情况下与内质网膜紧密相连(和图S4）。
ω体和MAP-LC3
为了获得omegasome-MAP-LC3结构的3D视图，我们使用了串行重建（视频5，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1). 在这一观点中，欧米伽马体表现为一个圆环，即一个圆圈状的环，它用DFCP1-和MAP-LC3-染色域包围MAP-LC3颗粒，这些域明显不同，但在边缘有一些重叠。该结构与GFP-FYVE-TM结构非常相似()与内源性LC3和Atg5的实验染色一致（见图S3、A和C）。我们还试图获得LC3“包衣”步骤的其他观点，这似乎是在ω体崩解回到内质网和自噬体完全形成之前的退出步骤。有两种类型的运动是明显的：MAP-LC3颗粒平稳地离开欧米伽玛体(或者当DFCP1膜沿着LC3颗粒“压缩”时，可以辨别出几个离散的步骤(，示例2）。视频6显示了此过程的五个示例。当表达GFP-DFCP1的细胞处于饥饿状态并被染色以获得内源性MAP-LC3时，也可以观察到这种顺序性相互作用（图S3 A，放大的面板）。
外源性PI（3）P探针对ω染色体的染色
为了确保ω体确实是富含PI（3）P的膜，我们对饥饿的细胞进行穿孔，并用纯化的GSP-PX结构域对其进行染色，该结构域已知能结合PI（3P）P(Ellson等人，2001年). 我们看到GST-PX信号的一个子集出现在Ω上()而其余的则在早期内体上。
ω体、内源性自噬体和ER
因为所有这些结果都是通过过表达蛋白的实时成像获得的，所以我们试图通过内源性蛋白染色来验证这些结果。我们针对DFCP1的抗体无法检测到内源性蛋白。因此，表达GFP-DFCP1的细胞被饥饿并染色以获得内源性ER和内源性MAP-LC3()或内源性Atg5().显示了这种染色的单个细胞，而放大的面板是代表100个此类细胞的放大示例。我们发现，DFCP1 omegasome与MAP-LC3或Atg-5阳性结构的共定位经常发生在潜在的ER上。最后，我们还确保了这些细胞中的饥饿反应是正常的，如三种独立的测定所示：点状MAL-LC3的形成、点状Atg5的形成，以及电泳期间II型MAP-LC3形式的形成（图S5，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1).
在GFP-ERFYVE探头的实时成像过程中，也观察到DFCP1结果的主要参数。在饥饿期间，表达GFP-ERFYVE的稳定细胞显示出许多动态点状结构，这些结构经常与MAP-LC3共定位，ERFYVI/LC3关联发生在ER链上（未发表的数据）。
omegasome退出后的自噬体成熟
通过单丹磺酰尸胺（MDC）染色，追踪LC3颗粒在活细胞中离开omegasome后的命运，MDC是已知的染色酸性细胞室，包括成熟的自噬体(Bampton等人，2005年). 我们观察到自噬体形成与MDC染色之间有3-5分钟的延迟()，这与从omegasomes中出现的自噬体尚未完全成熟的观点一致：这种情况发生在晚些时候。有趣的是，自噬体的MDC染色并不涉及与另一个MDC阳性膜的融合，例如晚期内体/溶酶体。
欧米伽马体退出后的自噬体成熟。表达GFP-DFCP1和mRFP-MAP-LC3的细胞在指定的时间间隔内饥饿并成像。饥饿后30分钟，细胞也与2μM MDC孵育。请注意，自噬体首先从欧米伽小体中出现（标记为自噬小体形成的面板；箭头表示欧米伽小体），然后开始用MDC染色（标记为自吞噬小体成熟的面板），但似乎没有改变其外观或与另一个MDC阳性囊泡融合。
PI（3）P的来源：Vps34的实时成像
基于siRNA数据()，我们假设这些细胞中PI（3）P的来源是Vps34酶，可能通过易位或通过囊泡途径传递到内质网。为了解决这些可能性，我们将mRFP-Vps34引入到表达GFP-DFCP1的稳定细胞系中，并衍生出表达这两种报告物的新稳定细胞系。在这些细胞中，mRFP-Vps34的表达水平与内源性蛋白相当，DFCP1和Vps34在饥饿期间没有变化(). 在Vps34适度表达的细胞中，饥饿反应正常（图S5）。Vps34在大多数细胞中定位为胞质和囊泡，用各种细胞器标记物染色显示，Vps34囊泡对应于Lamp-2和Lamp-1阳性的晚期内体/溶酶体()而EEA1（早期内体蛋白）染色显示无共定位（未描述）。有趣的是，这些Vps34小泡总是靠近内质网，并且经常沿着内质网运动()不管饥饿状况如何。在确定Vps34以细胞溶质和囊泡形式存在后，我们在氨基酸饥饿期间进行了实时成像实验。我们没有获得任何证据表明细胞溶质Vps34在饥饿期间易位到内质网，或其细胞溶质定位发生改变。相比之下，我们在饥饿期间多次看到，ω与Vps34囊泡密切相关(; 和视频7，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1). 在许多情况下，最早可见的DFCP1聚集发生在Vps34囊泡附近，其中Vps34小泡的大小保持不变，而DFCP1膜扩大和膨胀（比较序列开始和结束时Vps34颗粒的大小）). 此交互期间基础ER的位置如所示对于的选定帧，以及视频7中的整个序列。Omegasome扩张伴随着与Vps34颗粒紧密相连的潜在ER的变化。我们注意到，在表达非常高水平mRFP-Vps34的细胞中，Atg5和GFP-DFCP1在点状结构中的积累抑制了自噬（未发表的数据）。
omegasome形成期间的Vps34动力学。（A） 用mRFP-Vps34转染克隆201细胞，选择一个稳定的群体表达这两种蛋白（最后三个通道）。注意，外源性mRFP-Vps34与内源性Vps34相当，并且在氨基酸饥饿期间是稳定的。（B） 将A中的细胞饥饿60分钟，固定，并染色Lamp-2。请注意，DFCP1点状结构经常靠近Vps34膜（左下角箭头所示），大多数但不是所有的Lamp-2囊泡（～80%）与Vps34共定位，而所有的Vps34囊泡与Lamp-2共定位（右下角箭头表示缺乏Vps34的Lamp-2-囊泡示例）。（C） 从mRFP-Vps34在细胞中的实时成像中选择的帧也表达CFP-ER。请注意，Vps34囊泡始终靠近ER，并且经常使用ER链进行远距离移动（底部箭头）。时间指的是氨基酸饥饿后的时期，但在没有饥饿的情况下，类似类型的运动也很明显。（D和E）氨基酸饥饿期间mRFP-Vps34、GFP-DFCP1和CFP-ER实时成像的选定帧。（D） 在Vps34粒子附近形成的欧米伽玛体。棒材，1μm。对于此视频的选定帧，如图所示（10–12和35–37），E显示了Vps34与DFCP1（顶部）、Vps34和ER（中部）以及所有三个帧（底部）的关系。另请参阅视频7（可从http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1). （F） 另一个来自实时成像实验的示例显示，在Vps34粒子附近形成了一个欧米伽玛体。
下调DFCP1并不抑制自噬
内源性DFCP1在HEK-293细胞中被siRNA下调，并探索内源性MAP-LC3的自噬反应。在消除>80%DFCP1表达的条件下，氨基酸饥饿后MAP-LC3Ⅱ型自噬特异性形式明显，沃特曼仍抑制反应（图S2，E-H）。
讨论
在自噬诱导过程中与内质网动态连接的PI（3）富磷隔室
在这项工作中，我们提供了证据表明，在氨基酸饥饿后不久和自噬早期阶段，膜室中形成了一个PI（3）P池。三种不同的报告蛋白在氨基酸饥饿期间转移到这个隔间：DFCP1，一种已知的哺乳动物蛋白；ER-FYVE，通过将DFCP1的ER靶向结构域与通常位于内体中的异源FYVE结构域融合而创建的人工报告子；和FYVE-TM，一个由异源（内胚体）FYVE结构域通过跨膜结构域锚定到内质网的报告者。在所有三种情况下，易位依赖于氨基酸饥饿，需要功能性PI（3）P识别，即WT FYVE结构域。沃特曼和其他PI 3-激酶抑制剂阻断了转运，需要Vps34和beclin功能。我们将这一隔室的膜称为ω体，以表明它们既不是自噬体，也不是成熟为自噬体内的自噬前体。
基于几个互补的观察结果，我们提出这些富含PI（3）P的膜与内质网动态连接：（a）使用宽场、共焦和TIRFM的实时成像数据显示，ω体和潜在内质网经常重合；（b） 内源性自噬蛋白、ω体和内源性内质网的共聚焦显微镜也表明，ω体与内质网之间存在一些共定位；（c） 当内涵体PI（3）P探针（FENS FYVE结构域）与内质网连接时，但当同一探针为胞质时，该隔室未被揭示；和（d）ER和omegasomes的免疫电镜标记显示信号经常散布。对所有这些数据最安全的解释是，定位于内质网的蛋白质可以进入这个点状隔室。我们的数据不能排除高尔基体膜也可能产生ω染色体的可能性，尽管我们认为它们不是必需的，考虑到BFA对高尔基体的破坏根本不会影响奥米伽小体的形成。最后，我们不能消除（事实上，我们赞成）这种可能性，即这个隔室起源于内质网，但一旦自噬体蛋白在那里积累，它就会获得不同的特征。未来通过生物化学方法鉴定该隔室的成分的工作将解决这个问题。
这个富含PI（3）P的小室参与自噬体的生物发生。我们清楚地观察到了ω体与形成自噬体的持续动态相互作用，并且我们捕获到了自噬小体首先出现在ω体内，然后才变得独特并获得成熟的特征，如低pH值。最简单的解释是，ω体可能为至少某种类型的自噬体的生物发生提供场所。我们的数据不能排除并非所有自噬体都是以这种方式起源的可能性，因为我们没有获得ω体和内源性自噬蛋白之间的100%共定位。在实时成像实验中，在首次出现MAP-LC3阳性点状结构的情况下，我们几乎总是看到它与omegasome相关。从这个意义上说，我们认为ω染色体的结合可能是自噬体形成的重要原因。
正如目前所理解的，自噬体的生物发生需要一系列生化反应，两个结合系统聚合形成一个多聚物蛋白质组合，使自噬体形核化(Yolimitsu和Klionsky，2005年). 一个共轭体系产生4:4:4 Atg16/Atg12/Atg5多聚体(尤里米苏和克林斯基，2005年)而平行共轭体系涉及Atg8（哺乳动物同源物MAP-LC3、GABARAP和GATE-16）与磷脂酰乙醇胺或磷脂酰丝氨酸的异常共价修饰(Sou等人，2006年). 由于omegasomes与两种共轭体系的组分（Atg5和MAP-LC3）共定位，因此它们非常适合这种粒子的成核形成，而下面的内质网膜将提供共轭步骤中使用的脂质的良好来源。
在ω体内富集的PI（3）P对于吸引和定位效应物（如Atg18）也很重要(Guan等人，2001年；Proikas-Cezanne等人，2004年)、Atg20和Atg21(Stromhaug等人，2004年)，附件24(Ano等人，2005年)和Alfy1(Simonsen等人，2004年)所有这些结合PI（3）P.DFCP1是另一个功能目前未知的效应器。基于DFCP1在酵母中没有对应物的事实，特别是在黑腹果蝇表现出正常的自噬反应(Rusten等人，2004年；Scott等人，2004年)，我们认为DFCP1本身可能在自噬过程中参与一些（非必需的）特殊功能。
虽然DFCP1对自噬不是必需的，但它结合的PI（3）P池必须有遗传和药理学数据，这些数据表明PI（3(Blommaart等人，1997年；Kihara等人，2001b；水岛等人，2001年). 我们的发现是，高水平的ER/Gegi-localized WT DFCP1（但不是类似定位的DM）抑制自噬体的形成，这可以用PI（3）P隔离的机制来解释，并且与显示双FYVE结构域的工作类似(Gilloly等人，2000年)高浓度使用时可在体内外抑制内体功能(Boeddinghaus等人，2002年；Petiot等人，2003年；Asano等人，2004年). 特别是，FYVE结构域的过度表达已被证明会导致内胚体PI（3）P的隔离和EEA1从内胚体重新分布到胞浆(Byfield等人，2005年). 在DFCP1的情况下，myc-和GFP-标记的构建物在高于内源性蛋白10倍的水平上表达都抑制了自噬体的形成。
PI（3）P的来源
真核细胞中的内质网高度分化(Levine和Rabouille，2005年)但在正常条件下含有少量PI（3）P(Gilloly等人，2000年). 那么，饥饿期间内质网如何形成PI（3）P？我们发现，含有Vps34的囊泡经常与最早可识别的ω小体斑点相关，并随着ω小体扩张而继续相关。这些Vps34囊泡对LAMP-2呈阳性，这表明它们是晚期内体或溶酶体，并且总是在内质网附近发现，经常沿着内质网链长距离移动。我们观察到的最简单假设是，Vps34通过某种类型的囊泡转运步骤传递到内质网，尽管我们不能排除Vps34阳性囊泡与内质网直接相互作用的可能性，使Vps34在内质网上生成PI（3）P。值得注意的是，Vps34的这种拟议作用模式与酵母中的情况类似。酵母在自噬过程中产生的单个自噬体位于液泡附近，与Vps34蛋白非常接近，Vps34也定位于液泡(Obara等人，2006年). 鉴于液泡在功能上等同于哺乳动物的晚期内体/溶酶体，我们提出自噬体出现在Vps34阳性囊泡附近，这使得这两个系统非常相似。
先前的研究表明，Vps34对自噬反应的启动至关重要(Kihara等人，2001b)但矛盾的是，总Vps34活性受到氨基酸的刺激，在氨基酸饥饿和自噬期间实际上会下降(Byfield等人，2005年；Nobukuni等人，2005年). 这些观察结果表明，在氨基酸饥饿期间，Vps34分子的一个亚群被激活，而大多数蛋白质被抑制。为了支持这一点，在酵母中的研究表明存在两种Vps34复合物，一种参与内胚体功能，另一种参与自噬(Kihara等人，2001b). 除Vps34外，参与自噬的复合物还包含两个辅助蛋白Vps14和Vps30/Atg6。哺乳动物Atg6的同源物beclin 1已被证明对诱导自噬至关重要(Liang等人，1999年)，最近的定位和功能研究表明Beclin 1部分针对ER(Pattingre等人，2005年)尽管大多数Vps34是针对转高尔基网络和晚期内体/溶酶体的(Kihara等人，2001a). 鉴于omegasome的形成需要Vps34和beclin功能，PI（3）P形成的一种可能机制是，Vps34阳性囊泡与ER相互作用，将Vps34传递给已经存在的结合伙伴beclin。
自噬体形成的实时视图
基于我们的研究结果和之前的大量工作，我们提出了以下至少某些类型自噬体生物发生的工作模式(). 在氨基酸饥饿的早期，PI（3）P开始积聚在Vps34囊泡附近的平坦内质网池（绿色）的一部分。这种富含PI（3）P的膜有助于定位自噬相关蛋白（红色），并形成混合池。拓扑上，富含PI（3）P的膜（ω组）总是环绕自噬体膜，但其与内质网的确切联系尚不清楚(，问号）。混合池继续扩大，PI（3）P-和自噬体丰富的膜在空间上保持不同，但彼此连续。到目前为止，我们的模型与之前提出的分离膜膨胀途径相似，不同之处在于，在我们看来，所有这些都发生在富含PI（3）P的膜平台上。在先前的自噬体形成模型中，最后一步是通过未知机制将隔离膜融合成双膜囊泡。同样，我们的建议是相似的，但我们建议扁平隔离膜的融合由PI（3）P外层协助：当ω形体达到最大尺寸时，向内芽变将产生预融合自噬体中间产物，其中富含PI（3P）的膜标志着双膜囊泡的最终闭合点。事实上，实时成像显示，在ω体塌陷期间，最后一个可识别的PI（3）P池修饰了自噬体的边缘。
ω体在自噬体生物发生中的潜在作用。我们的假设是，在氨基酸饥饿期间，含有Vps34的小泡与ER相互作用，并在与ER相连的膜上形成PI（3）P（步骤1，绿色）。该膜域与自噬体蛋白（红色）结合，形成一个混合膜域，该混合膜域继续扩张，但与外部的PI（3）P和内部的自噬细胞膜保持空间分离（步骤1和2）。注意，该膜与ER的连接未完全显示，因此连接处有问号。一旦omegasome达到其最大尺寸，自噬体膜向内出芽（步骤2和3），产生完全形成的双膜自噬体（步骤4）。步骤3中间的PI（3）P外膜可能有助于融合反应。向内芽接将允许自噬体摄取细胞质物质和/或自噬体内的细胞器。在步骤2、3和4的底部，我们绘制了相关结构的剖切图，以指示双层的几何结构。
我们提出的模型与之前关于自噬体生物发生的观察结果并不冲突，但它确实强调PI（3）P的生成是一个非常关键的早期事件。我们认为，PI（3）P是该途径的调节器，是自噬体诱导定位的决定因素。此外，我们的建议更符合自噬体生物发生的成熟模型，并表明内质网在这一过程中起着重要作用，它为ω小体的形成和所使用的膜提供了场所。
材料和方法
除非另有说明，否则所有化学品均来自Sigma-Aldrich。
抗体
本研究过程中使用的抗体有：小鼠抗GST（GeneTex，Inc.）、小鼠抗β-COP（已故T.Kreis赠送，德国海德堡欧洲分子生物学实验室）、大鼠抗ER蛋白（主要是BiP，英国剑桥Babraham研究所G.Butcher赠送）、兔抗GFP（Invitrogen）、，9E10小鼠抗myc、兔抗MAP-LC3（Santa Cruz Biotechnology Inc.）、兔抗–MAP-LC3（Sigma-Aldrich）、鼠抗EEA1（BD Biosciences）、兔抗钙网蛋白（Assay Designs）、家兔抗钙网织蛋白（在家中制备）、兔对抗COPII（亲和生物试剂）、小鼠抗LAMP2（发育研究杂交瘤库）、，兔抗甘露糖苷酶2（从佐治亚州雅典市佐治亚大学K.Moremen处获得）、兔抗Vps34（Invitrogen）、兔对抗beclin 1（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、兔抗病毒素（Covance）和兔抗Atg5（Sigma-Aldrich）。
本研究中使用的质粒
如前所述，将野生型和C650S/C770S DFCP1（DM）克隆到pEGFPC2（Invitrogen）和pCMV3myc中(Ridley等人，2001年). 使用标准技术将DFCP1的截短突变体（残基416–535、416–543、416-549和416–576）克隆到pEGFPC2中。使用标准PCR技术进行定点突变以在DFCP1内产生点突变，所有构建物均通过DNA测序进行验证。pECFP-ER质粒（包含CFP，两侧有ER插入信号和KDEL C末端ER保留信号）是C.Taylor（英国剑桥大学）赠送的礼物。pdsRED-ER质粒（类似于CFP质粒）来自Clontech Laboratories，Inc。
为了产生GFP-ER-FYVE记者，FENS-1的FYVE领域(Ridley等人，2001年)通过PCR扩增并连接到编码DFCP1（指定ER）416–543片段的pEGFPC2质粒。这位记者的准确定位很重要：GFP-ER-FYVE起作用，而GFP-FYVE-ER不起作用。为了使用突变的FYVE结构域生成该基因的一个版本，如前所述，使用基于寡核苷酸的突变来创建C/S突变(Ridley等人，2001年).
为了生成GFP-TM和GFP-FYVE-TM构建物，我们使用寡核苷酸在GFP或GFP-FYVE质粒的N末端的框架中添加以下序列：N′-GGGSGGGSGGSPSETLITTVESNSSSWWTNWVIPAISALVVALMYMAED-C′
该构建体中的间隔区（以GGGS开始、以ESNS结束的氨基酸）对其功能极其重要。较短的间隔物导致构建物停留在内质网中而不移位到点状结构。
还使用标准技术将截短的DFCP1结构（416–543和W543A 416–54/3 DFCP1）克隆到pGEX 4T-1（GE Healthcare）中。
为了产生对DFCP1特异的pSilencer RNAi B和RNAi C，设计了以下寡核苷酸：B，5′-GATCCCACCATGAGCGGAATAACTTTCCAGCTCATGGTTTGGAAAA-3′；B′，5′-agctttccaaaaaccatgagcggataagaccttctcttgaaagtctatccgctcatggtgg-3′；C、 5′-GATCCCTGTCAGTAATCTCCAGGAGTCAAGAGGACTCCTGGATACTCATTGGAAA-3′；C′，5′-AGCTTTTCCAAAAAATGTCAGTAATCTCCAGGAGTCTGAACTCCCTGGATACTGAGAGG-3′。
使用标准技术将寡核苷酸退火并连接到包含RNA U6或H1启动子的pSilencer载体（Ambion）中。构建物通过DNA测序进行验证。表达FENS-1 iFYVE的pEGFPC2是P.Hawkins（Babraham Institute）赠送的礼物。pEGFPC1 LC3是吉森（日本大阪大阪大学）赠送的礼物。为了创建RFP版本，使用标准技术将LC3克隆到pmRFPC1载体中。pEGFPC1表达p40的PX结构域荧光粉是C.Ellson（Babraham Institute）赠送的礼物。
细胞培养、转染和稳定细胞系的产生
HEK-293细胞系和COS-7细胞系在含有100 U/μl青霉素和链霉素（Invitrogen）和10%胎牛血清（Invit罗gen）的DME（Invitrongen）中生长。在800μg/ml基因素（Invitrogen）中选择稳定的表达DFCP1的细胞株。在800μg/ml基因素和100μg/ml zeocin中选择稳定的DFCP1和Vps34表达细胞系。
如前所述，用二乙氨基乙基-dextran瞬时转染COS-7细胞系(Manifava等人，2001年). 根据制造商的说明，使用FuGENE-6和FuGENE HD转染试剂（Roche）转染HEK-293细胞系。
小干扰RNA
我们使用了赛默飞世尔科技公司预先设计的寡核苷酸(智能pool）以降低Vps34、beclin和DFCP1的表达水平。使用dharmafect-1转染细胞，72小时后进行检测。
HEK-293细胞的饥饿与自噬抑制
在整篇论文中，我们提到了氨基酸饥饿，尽管应该注意的是，培养基中通常存在的其他生长因子也不存在。然而，我们确定DFCP1反应只有在氨基酸提取期间才明显，即当细胞在无血清DME中培养时，DFCP1仍然与ER/高尔基体相关。对于氨基酸饥饿，用预热的PBS清洗细胞一次，然后用预热的饥饿培养基（140 mM NaCl，1 mM CaCl）清洗细胞两次2，1 mM氯化镁2，5 mM葡萄糖和20 mM Hepes，pH 7.4），然后与饥饿培养基和1%BSA孵育，除非另有说明。注意，这种培养基缺乏氨基酸和钾；在初步实验中，我们发现它能在HEK-293细胞中产生更快的饥饿反应。如图所示，饥饿治疗的持续时间因实验而异。通过向细胞培养基中添加10 nM沃特曼或100μM LY294002抑制PI 3-激酶。向细胞培养基中添加10 mM 3-甲基腺嘌呤可抑制自噬。BFA的用量为5μg/ml。处理时间因实验而异。当使用MDC时，在0.05 mM的饥饿培养基中制备储备液，并在实验期间将其稀释为1:20–1:40。
免疫荧光显微镜
用于免疫荧光的细胞在玻璃盖玻片上生长，并固定在3.7%甲醛的200mM Hepes中，pH 7.2。免疫荧光染色和数字摄影如前所述(Manifava等人，1999年).
大鼠肾微粒体的制备及GST标记DFCP1片段的结合
将储存在−80°C的大鼠肾脏（Harlan Sera实验室）解冻、解剖并悬浮在4倍体积的肾膜缓冲液（0.2 M蔗糖、20 mM Hepes KOH、2 mM DTT、1 mM EGTA和GST蛋白酶抑制剂混合物，pH 7.2[Roche]）中。在以30000 rpm的转速均质和离心后，清洗膜颗粒，将其重新悬浮在缓冲液中，并在−80°C下储存。纯化的GST-标记的DFCP1蛋白通过14000离心进行预分离克在37°C下，在200μl总体积的硅化Eppendorf管中与微粒体混合10分钟。离心后，用SDS-PAGE对颗粒进行分析。
蛋白质与PI（3）P结合珠的结合
用合适的构建物瞬时转染的COS-7细胞在裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，50 mM KCl，10 mM EDTA，0.6 mM苯甲基磺酰氟，1μg/ml胰蛋白酶抑制剂和0.5%Nonide P-40）中进行裂解，并在14000℃离心克去除细胞碎片。如前所述，与PI（3）P耦合珠结合(Ridley等人，2001年).
外源性GST-PX对omegasomes的染色
将表达GFP-DFCP1并生长在盖玻片上的细胞饥饿60分钟，并用PBS广泛清洗。然后用硝酸纤维素穿孔，如前所述(西蒙斯和维塔，1987年)并用甲醛固定。用50μg/ml纯化的p40的GST-PX结构域进行染色凤凰（phox）（来自C.Ellson的礼物），其次是单克隆抗GST抗体和TRITC结合的山羊抗小鼠。
共焦成像
使用60×1.4 NA物镜（Olympus）用共焦显微镜（FV1000；Olympas）拍摄图像。分别使用488、543和633 nm激发光，使用顺序扫描设置对GFP、TRITC和Cy5三重标记的样品进行成像。在495–535 nm（GFP）、550–600 nm（TRITC）和>650 nm（Cy5）处收集发射。
活细胞成像
两个成像系统用于捕获活细胞的图像。使用共焦显微镜（UltraVIEW LCI；PerkinElmer）拍摄共焦图像，而使用Cell^R成像系统（Olympus）拍摄广域图像（包括TIRFM）。对于这两种系统，细胞被镀到直径为22 mm的玻璃盖玻片（BDH）上，并瞬时转染相关结构，然后将单个盖玻片固定在成像室中，如图所示添加2 ml细胞培养基或饥饿培养基。将组装好的成像室安装在显微镜上的加热台上，细胞保持在37°C。UltraView LCI共焦仪配备了一个100×1.4 NA物镜（尼康）、CSU 10扫描头（横河）、相机（Orca ER；哈马松）、sutter滤光片轮和一个在488（GFP）和568 nm（DsRed）下激发的氩氪激光器。使用497–547 nm（GFP）和577–622（DsRed）带通滤波器收集发射。Cell^R成像系统配备了60×1.45 NA和100×1.45 mA物镜、MT-20照明装置（150 W氙气/汞混合灯泡）和Orca ER相机。分别使用417–442 nm、486–498 nm和560–583 nm带通滤波器激发CFP、GFP和mRFP。使用455–475 nm（CFP）、510–545 nm（GFP）和600–650 nm（mRFP）带通滤波器收集发射。使用UltraView或Cell^R软件分析数据，然后使用ImageJ（美国国立卫生研究院）进行图像处理。使用Autodeblur（MediaCybernetics）进行反褶积，并在需要时使用Volocity软件（PerkinElmer）进行3D重建。
相对长度单位
EM样品在冰镇EM制备缓冲液（PBS，0.2 M蔗糖，1 mM MgCl）中清洗三次2，0.2 mM氯化钙2，以及0.1%BSA，pH 7.5），然后在冰上添加1 ml EM制备缓冲液（含或不含5 ng/ml洋地黄素）5分钟。将细胞固定在3.7%甲醛和0.1%戊二醛中，并在DME中淬灭。对于预包埋标记，在第二步固定步骤和包埋在epon中之前，用一级抗体和蛋白-A金对细胞进行染色。对于冷冻-EM，在RT下以800 rpm刮取细胞并离心5分钟，并使用标准技术处理细胞颗粒，以便用兔抗GFP抗体（Invitrogen）进行免疫金标记。
点刺定量
我们在三个独立的实验中测量了100个细胞，以确定点状结构的水平或共定位的程度。这些测量是在随机选择的视野上进行的。此外，所有报告显示点状构造差异的数据均由独立观察者以盲法进行了定性验证。
在线补充材料
图S1显示了三种PI（3）P-结合蛋白对饥饿的反应，并得出结论，DFCP1是与自噬体共定位的最合适报告者。图S2显示，WT DFCP1的高水平过度表达抑制了自噬体的形成，而siRNA对其的下调并不抑制这种反应。图S3显示了GFP-DFCP1与自噬相关蛋白（MAP-LC3和Atg5）和ER共定位的其他示例。图S4显示了DFCP1通过免疫电镜定位的其他实例。图S5显示了通过三种独立分析测量的自噬在整个工作中使用的细胞系中正常进行。视频1显示了饥饿期间GFP-TM-FYVE和dsRED-ER的双重成像。视频2显示了饥饿期间GFP-DFCP1的单次成像。视频3显示了饥饿期间GFP-DFCP1、mRFP-MAP-LC3和CFP-ER的三重成像。视频4显示了在饥饿期间使用TIRFM成像的GFP-DFP1和dsRED ER的双重成像。视频5显示了GFP-DFCP1和mRFP-MAP-LC3在不同旋转平面上的三维重建。视频6显示了饥饿期间GFP-DFCP1和mRFP-MAP-LC3的双重成像。显示了不同视频中显示“萌芽”步骤的几个面板。视频7显示了饥饿期间GFP-DFCP1、mRFP-Vps34和CFP-ER的三重成像。在线补充材料可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1.
笔记
E.L.Axe和S.A.Walker对本文的贡献相同。
本文中使用的缩写：ATG，自噬相关；BFA，布雷费尔丁A；DFCP1，双FYVE结构域-含蛋白1；DM，结构域突变；EEA1，早期内体抗原1；MDC，单丹酰卡达韦；PAS，前吞噬体结构；蛋白质二硫异构酶；PI 3-激酶、磷脂酰肌醇3-激酶；PI（3）P，磷脂酰肌醇3-磷酸；全内反射荧光显微镜；野生型野生型。
