The requirement of uncoordinated 51-like kinase 1 (ULK1) and ULK2 in the regulation of autophagy

doi:10.4161/auto.7.7.15450

.2011年7月；7(7):689-95.

doi:10.4161/auto.7.7.15450。 Epub 2011年7月1日。

非协调51样激酶1（ULK1）和ULK2在自噬调节中的需求

李恩珠¹, 凯西·托尼尔

附属公司

PMID： 21460635
预防性维修识别码：项目经理1149696
内政部： 10.4161/自动.7.7.15450

非协调51样激酶1（ULK1）和ULK2在自噬调节中的需求

李恩珠等。自噬. 2011年7月.

.2011年7月；7(7):689-95.

doi:10.4161/auto.7.7.15450。 Epub 2011年7月1日。

作者

李恩珠¹, 凯西·托尼尔

附属

¹英国曼彻斯特大学生命科学学院。

PMID： 21460635
预防性维修识别码：项目经理1149696
内政部： 10.4161/自动.7.7.15450

摘要

自噬是一种进化上保守的细胞自我控制的生理过程，以适应各种压力，包括饥饿。其分子基础涉及自噬相关基因家族编码的蛋白质的协同激活。最好的特征是酵母中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Atg1，它在自噬的早期阶段似乎是必不可少的。在哺乳动物中，五种Atg1同源物被鉴定为非协调（UNC）51-like激酶1-4和STK36。ULK1和ULK2是该家族中关系最密切的成员，在其蛋白激酶域内具有78%的同源性。然而，ULK1和ULK2在哺乳动物自噬中的具体功能尚不完全清楚。在这里，我们证明ULK1和ULK2是功能冗余的蛋白激酶，需要在营养缺乏的条件下介导成纤维细胞的自噬。相反，在无血清条件下，ULK1（而非ULK2）对于诱导小脑颗粒神经元（CGN）对低钾浓度的自噬反应至关重要。此外，我们发现ULK1对神经元具有细胞保护功能。总之，这些结果提供了强有力的遗传学证据，证明ULK1是自噬信号通路的重要组成部分。ULK2补偿ULK1功能损失的能力取决于细胞类型。

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数字

图1
ULK1和ULK2的缺失阻断了MEF对营养剥夺的自噬反应。（A）（i）示意图*ulk2号机组*野生型和突变等位基因。LZ-Neo盒取代了*ulk2号机组*基因；（ii）从杂合子尾部分离的基因组DNA(*ulk2号机组*^+/−)和纯合子(*ulk2号机组*^−/−)用野生型（P1+P3）和突变型（P2+P3；（iii）提取总RNAulk2号机组^+/−和*ulk2号机组*^−/−MEF和金额*ulk1号机组*和*ulk2号机组*成绩单归一化为*肌动蛋白*采用实时定量PCR检测。数据表示为任意单位。（B–E）*ulk2号机组*^+/−和*ulk2号机组*^−/−MEF转染对照（ctrl）siRNA或*ulk1号机组*siRNA培养48小时，并在完全或饥饿（HBSS）培养基中培养指定时间。如有指示，用Baf（D和E）或3-MA（F）培养细胞。进行免疫印迹分析以检测LC3转化和p62降解，并确认用针对ULK1（B、D和E）的siRNA转染细胞中ULK1表达的抑制。Tubulin被用作负荷控制。结果代表了三个（B）或两个（D和E）独立实验。免疫印迹信号用ImageQuantifier软件（BioImage，Jackson MI）定量（C）。LC3比率（LC3-II/LC3-I）和归一化为管蛋白的p62水平（p62/管蛋白）表示为每种情况下未处理细胞的倍数*p<0.05，表明*ulk2号机组*^+/−和ULK1-已完成*ulk2号机组*^−/−MEF公司。（F）*ulk2号机组*^+/−和*ulk2号机组*^−/−将pEGFP-LC3（3µg）与ctrl或*ulk1号机组*在完全培养基或饥饿培养基中培养30分钟。显微镜下观察GFP-LC3阳性细胞，并在每种情况下从至少八个随机视野进行肉眼计数。数据对应于两个独立实验的平均值±范围。包括代表性图像。比例尺，20µm。

图2
与ULK1丢失相关的CGN自噬受损增强了DNA片段化。（A）总RNA提取自*ulk2号机组*^+/−和*ulk2号机组*^−/−CGN和金额*ulk1号机组*和*ulk2号机组*成绩单归一化为*肌动蛋白*采用实时定量PCR检测。（B）在不存在或存在3-MA的情况下，将DIV7的CGN在K10培养基中孵育2小时。通过使用LC3抗体的免疫印迹分析检测通过LC3测定的自噬诱导。（C–F）*ulk2号机组*^+/−和*ulk2号机组*^−/−用ctrl siRNA或*ulk1号机组*DIV2处的siRNA。在DIV7，细胞在K10培养基中培养指定时间。如有指示，用Baf（E）或3-MA（F）培养细胞。进行免疫印迹分析以检测LC3转化、p62降解，并确认用针对ULK1（C和E）的siRNA转染的CGN中ULK1表达的抑制。Tubulin被用作负荷控制。结果代表了三个（C）和两个（E）独立实验。免疫印迹信号用ImageQuantifier软件（BioImage，Jackson MI）定量。LC3-II和p62归一化为Tubulin的水平表示为每种情况下未处理细胞的倍数。数据对应于三个独立实验（D）的平均值±SE或两个独立实验的平均值？SD（E）*p<0.05，表明转染CGN与*ulk1号机组*siRNA与ctrl siRNA。TUNEL检测到凋亡细胞核呈紫色（蓝色DAPI+红色TUNEL）。通过MAP2免疫染色将其与DNA碎片区分开来。在每种情况下，眼睛从至少八个随机视野中数出至少100个细胞。将TUNEL阳性核的百分比绘制为时间（F）的函数。数据对应于三个独立实验的平均值±SD*p<0.05，表明转染CGN与*ulk1号机组*siRNA与ctrl siRNA的比较。

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