Atg1/ULK1激酶与泛素样蛋白Atg8的结合调节自噬

Atg1/ULK1以LIR依赖的方式与Atg8结合

最近的工作确定哺乳动物Atg1同源物ULK1可能是Atg8/LC3的相互作用体(Behrends等人，2010年)，我们假设Atg8可能参与Atg1调控。一项彻底的生物信息学分析确定了ULK1和ULK2以及酵母Atg1中存在的保守的苯丙氨酸/酪氨酸-X-X-缬氨酸（F/YXXV）序列(图2A)，满足功能性LIR基序的标准。为了研究酵母Atg1是否确实通过这个假定的LIR基序与Atg8结合，我们进行了在体外交互作用研究。如所示图2B，Atg1与Atg8强烈结合，但不与泛素结合。重要的是，预测的Atg1的LIR基序中缬氨酸432和谷氨酸433（Atg1-VE）或谷氨酸428、苯丙氨酸429和谷氨酸盐433（Attg1-EYE）的突变完全消除了这种结合，表明Atg1和Atg8的相互作用是以LIR依赖的方式介导的。这种相互作用独立于Atg13，因为Atg1与Atg8的结合在缺乏Atg13的细胞中持续存在(图2C). 此外，正如预期的那样，从非重叠的结合位点(图2A)，Atg1-LIR突变体有效结合Atg13，这意味着Atg1中的LIR基序不需要与Atg13结合(图2D；补充图S3A).

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图2

Atg1以依赖LIR的方式绑定Atg8。(A类)芽殖酵母Atg1的示意图表示及其假定的LIR基序与不同物种的Atg1同源物的序列比对。预测的LIR基序的保守残基用灰色方框表示，突变靶向残基用星号（*）标记。Atg1激酶结构域下划线，Atg13结合区以黑色阴影显示。带圆圈的“P”标记Atg1上已知的磷酸化位点。N： 氨基末端蛋白；C： 羧基末端。(B类)GST-Atg8或GST泛素（Ub）从大肠杆菌并绑定到GSH珠子上。从酵母中纯化野生型Atg1-TAP或VE和EYE突变体，与固定化GST蛋白和结合蛋白孵育，并通过western blotting分析。(C)GST-Atg8和GST-泛素按照(B类)，并探索其结合从野生型或第13天Δ单元。(D类)atg1处Δ第13天表达所示野生型Atg1-TAP或VE或EYE突变体的Δ细胞，以及野生型Atg 13或Atg13-FV突变体的细胞生长到中对数期。Atg1被免疫沉淀，并通过western blotting检测其与Atg13的关联。(E类)GST、GST-LC3B、GST-GATE16和GST-GABARAP从大肠杆菌并绑在珠子上。将表达野生型（wt）HA-ULK1或DFP突变体的细胞制备的HEK293细胞裂解物与珠培养，并通过western blotting分析结合蛋白。(F类)将GFP或GFP-GABARAP与野生型HA-ULK1或DFP突变体共同转染HEK293细胞。将GFP和GFP-GABARAP固定在GFP-Trap树脂上，通过western blotting分析HA-ULK1结合。图：可以使用补充数据.

有趣的是，人类ULK1中包含保守LIR基序的区域先前被证明与GABARAP、GATE-16结合，并与LC3弱结合(Okazaki等人，2000年). 为了证实这些结果，我们将预测的ULK1的LIR基序中的天冬氨酸356、苯丙氨酸357和脯氨酸361突变为丙氨酸（DFP），并测试野生型或ULK1-DFP突变是否能结合Atg8同源物LC3B、GATE-16和固定在珠子上的GABARAP。ULK1有效地保留在GABARAP和GATE16涂层珠上，也结合到LC3上，尽管程度较低。这些相互作用在DFP突变体中显著减少(图2E)这意味着它们是由这个保守的LIR基序介导的。调查这种相互作用体内将GFP或GFP-GABARAP与野生型HA-ULK1或DFP突变体共同转染HEK293细胞。将GFP和GFP-GABARAP固定在GFP-Trap树脂上，通过免疫印迹分析结合蛋白。与我们之前的观察结果一致，内源性和HA标记的ULK1都与GFP-GABARAP结合体内，并且这种交互需要ULK1中的功能性LIR基序(图2F；补充图S3B). 总之，这些数据确定Atg1/ULK1是一种保守的Atg8相互作用因子，在酵母和哺乳动物中直接与Atg8结合。

Atg8与Atg1的相互作用在体内具有功能相关性

测试Atg1与Atg8的交互对其功能是否重要体内，我们比较了野生型和Atg1突变细胞在Cvt途径和自噬中的活性。有趣的是，表达Atg1-EYE或Atg1-VE的细胞对Cvt活性有部分缺陷，尽管这两种突变蛋白的表达水平与野生型Atg1相当。定量分析表明，Ape1在稳定状态下的液泡处理减少了～60%(图3A；补充图S3C). 使用pho8Δ60分析，atg1-眼睛和在g1-VE与野生型对照组相比，突变细胞在饥饿4小时后显示出很少的Pho8Δ60活性(图3B；补充图S2C)，表明Atg1中的LIR基序是Cvt途径和自噬功能所必需的。

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图3

Atg1中的LIR域在功能上很重要体内试验。(A类)atg1处Δ第13天将含有空对照质粒、野生型或指示的Atg1突变体以及Atg13野生型、Atg13-FV突变体或空质粒的Δ细胞培养至对数中期。通过western blotting分析内源性Ape1的加工过程，并按照图1I不同蛋白的表达由抗Atg1或Atg13抗体的免疫印迹控制。星号表示Atg13抗体检测到的非特异性带。(B类)第8页Δ60磷13Δatg1处表达野生型（wt）、激酶死亡（kd）、Atg1-VE（VE）或-EYE（EYE）突变体或空质粒的Δ细胞生长至对数中期，并在SD-N培养基中饥饿4h。在“材料和方法”中所述的三个独立实验中测量了Pho8Δ60特异性碱性磷酸酶（ALP）活性（nmol/min/mg），并绘制了与野生型对照组相比具有标准偏差（s.d.）的相对ALP活性图。(C)单元格，如中所示(A类)表达GFP-Atg8的细胞在SD-N培养基中饥饿4h后生长至对数中期。对GFP-Atg8的加工过程进行分析和量化，如下所示图1I. (D类)呈指数级增长atg1处Δ和atg1处Δ第8天通过荧光显微镜检查表达PAS标记物Ape1-RFP和GFP标记的野生型Atg1或Atg1-VE突变体的Δ菌株。棒材=5μm。(E类)atg1处含有TAP标记的野生型或指示的Atg1突变体的Δ细胞生长到中对数期。Atg1被免疫沉淀在体外通过放射自显影术测定自身磷酸化活性。激酶死亡（kd）Atg1突变体K54A作为阴性对照。图：可以使用补充数据.

相反，通过监测GFP-Atg8裂解或营养缺乏时的Ape1处理来分析自噬时，没有观察到明显的缺陷(图3C；补充图S3C和D)，表明Atg8与Atg1的结合可能影响自噬的后续步骤(Cheong等人，2005年). 事实上，荧光显微镜显示，Atg1-EYE和Atg1-VE突变体的Cvt缺陷并不是由其向PAS招募的缺陷引起的，这是以Atg8-独立的方式发生的(图3D). 此外，干扰Atg1与Atg8的结合并没有改变其激酶活性在体外(图3E). 因此，尽管Atg1和Atg8的相互作用在功能上很重要体内，Atg1的激酶活性或PAS定位不需要Atg8结合。

为了检测Atg1-LIR和Atg13-FV突变体是否影响Atg1功能的相同或不同方面，我们分析了双突变体的自噬途径缺陷。有趣的是，虽然Atg1和Atg13单一突变体显示Cvt活性部分降低(图1I和​和3A），第3页)，双突变体在Ape1处理过程中几乎完全受损(图3A). 同样，尽管Atg1 LIR突变体在GFP-Atg8处理中没有表现出明显的缺陷(图3C)，带有Atg13-FV的双突变体导致了强烈的自噬缺陷(图3C). 总之，这些数据表明，Atg8和Atg13相互作用于Atg1以调节其功能体内可能在自噬途径的不同阶段。

Atg1/ULK1以LIR依赖的方式与自噬体相关

为了测试Atg8是否可以招募Atg1/ULK1进入自噬体，我们首先将酵母细胞裂解物分离为细胞质（上清液）和膜（颗粒）部分，并通过免疫印迹分析Atg1的存在。为了丰富自噬体，我们用饥饿法密码7Δ细胞，在自噬体与液泡膜的有效融合方面存在缺陷。有趣的是，Atg1在Triton X-100敏感膜组分中富集，与内胚体膜蛋白Pep12一起，表明Atg1与膜相关(图4A；补充图S3E). 膜相关的Atg1对蛋白酶K的蛋白水解裂解具有抵抗力，表明部分Atg1可能在完整的自噬体中受到保护(补充图S3E). 重要的是，Atg1的膜结合依赖于功能性LIR基序，因为Atg1-VE突变体与膜的分离减少(图4B). 总之，这项生化分析表明，Atg1与Atg8的结合将Atg1招募到膜上，而膜很可能代表自噬体。

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图4

Atg1/ULK1定位于酵母和哺乳动物的自噬体。(A类)呈指数级增长密码7Δ细胞在SD-N培养基中饥饿4h，裂解并将提取物分离为细胞质（S）和5000克膜颗粒部分。用（+）或不使用（−）TX-100处理颗粒，离心，并用抗Atg1、抗Pep12和抗Pgk1抗体进行免疫印迹分析上清液（S）和颗粒（P）组分。(B类)呈指数级增长密码7Δatg1处表达野生型Atg1或Atg1-VE突变蛋白的Δ细胞在SD-N中饥饿4h，裂解并将提取物分离为细胞质（S）和膜（P）部分。用抗Atg1、抗Pgk1和抗Ape1抗体对组分进行western blotting分析，并量化颗粒组分中Atg1与Ape1的比率，并将其表示为与野生型细胞的比率。(C)用GFP-GABARAP和HA-ULK1共同转染HEK293细胞，饥饿2h，然后免疫染色HA（红色）和WIPI2（白色）。箭头标记了假定的自噬体，这些自噬体对所有三种标记物都呈阳性。棒材=10μm。(D类)用野生型HA-ULK1或DFP突变体转染稳定表达GFP-LC3的HEK293细胞，饥饿2h后进行HA和WIPI2免疫染色。使用Imaris软件对70多个细胞（两个实验中的一个）的HA-ULK1和WIPI2斑点数进行计数，并绘制为ULK1与WIPI2点状细胞的比率***表示具有统计显著性P（P）-值<0.0001。显示了两个独立实验中的一个。(E类)表达野生型HA-ULK1或DFP突变体的HEK293细胞中HA-ULK1和WIPI2斑点数的量化。细胞按上述方法处理，并使用Imaris软件计算斑点数。典型的免疫荧光图像如所示补充图S3F.***和*表示P（P）-值分别小于0.0001或0.0158。图：可以使用补充数据.

为了证实这些数据，我们接下来询问ULK1与自噬体的结合是否依赖于哺乳动物细胞中的LIR基序。事实上，在氨基酸饥饿时，HEK293细胞中低水平表达的HA标记的ULK1被发现位于通过WIPI2标记的点状结构上，WIPI2是PI3P-结合蛋白Atg18的哺乳动物同源物(Polson等人，2010年)和GFP-GABARAP或GFP-LC3(图4C；补充图S3F). 这些结构很可能代表自噬体，但也可能包括吞噬细胞和omegasome。ULK1的DFP突变体中ULK1阳性结构的数量显著减少，这表明ULK1向自噬体的有效补充需要其与哺乳动物Atg8的相互作用(图4D和E). 有趣的是，表达ULK1-DFP突变体后，WIPI2点的总数增加(图4E)这意味着WIPI2阳性的自噬体或自噬前体在自噬的早期阶段就停滞了。总之，这些结果表明，Atg8招募Atg1/ULK1进入酵母和哺乳动物的自噬体样结构，这似乎对自噬小体的形成和/或成熟具有重要的功能。

Atg13促进Atg1活性，但与Atg1形成稳定的复合物，无论营养条件如何

虽然从酵母到哺乳动物的自噬诱导需要Atg1，但已经提出了不同的激活机制。我们对酵母的生化和突变分析证实，Atg13和Atg1的相互作用是直接的，并促进了Atg1激酶的活性体内然而，与因Atg13而缺失的细胞相比，不能与Atg1相互作用的Atg13突变体的自噬缺陷不那么明显，这表明Atg13可能在Atg1复合体之外具有功能。在酵母中，Atg13促进Atg1的自磷酸化和二聚化(Yeh等人，2011年)TORC1介导的Atg13磷酸化被认为可以阻止其与Atg1的相互作用。相反，苍蝇和哺乳动物的Atg13分别与Atg1同源物dAtg1和ULK1组成性结合，这表明在这些生物体中，复合物通过磷酸化或其他因素的结合等其他方式被激活(Hara等人，2008年；Chan等人，2009年；Alers等人，2011年). 令人惊讶的是，通过比较在富氮或缺氮条件下生长的细胞中的复合物形成，或雷帕霉素抑制TOR激酶后，我们没有检测到酵母Atg13与Atg1复合物结合的能力有任何显著差异。与这个概念一致，Atg1复合物的大小不随其激活状态而改变，因为激酶活性的Atg1-T226AS230A在蔗糖梯度中表现出与野生型Atg1复合体相似的沉降行为(Kijanska等人，2010年). 最后，不能与Atg1相互作用的Atg13突变体表现出Cvt缺陷，这意味着在TORC1激活的条件下，Atg13和Atg1的结合在功能上很重要。总之，这些结果强烈表明，与其他生物体一样，酵母Atg1激酶的激活不受Atg13的调节结合介导。虽然Atg13以外的蛋白质是否以营养依赖的方式加入复合物尚待确定，但在其激活环中保守残基上调节Atg1的磷酸化对Atg1活性至关重要在体外和体内(Kijanska等人，2010年；Yeh等人，2010年). 同样，哺乳动物ULK1中的激活环被磷酸化，并且该位点的磷酸化是其激活所必需的(巴赫等人，2011年). 有趣的是，哺乳动物ULK1中的其他位点被AMP-activated protein kinase（AMPK）磷酸化，这表明葡萄糖饥饿也通过磷酸化激活自噬(Egan等人，2011年). 类似地，已经观察到PKA依赖的酵母Atg1磷酸化和活化(Stephan等人，2009年). 最后，Atg13的磷酸化状态由TORC1调节，表明这些位点与其营养依赖性调节有关体内综上所述，这些结果表明，与高等真核生物一样，酵母Atg1的激活需要Atg1和Atg13的磷酸化，但不受Atg1与Atg13结合的调节。

Atg8招募Atg1/ULK1进入自噬体并促进空泡中Atg1的降解

有趣的是，我们的结果表明，Atg8通过一个保守的LIR基序直接与Atg1相互作用，而Atg13结合并不需要这个基序。特异性废除Atg8结合的突变降低了Atg1促进Cvt通路进展的能力，并使细胞对自噬缺陷敏感，这意味着Atg13和Atg8独立地促进Atg1功能体内与Atg13相反，Atg8结合对Atg1激酶活性来说是不必要的，这意味着Atg1与Atg8和Atg13的结合可能影响Atg1功能的不同方面，并且很可能在途径的不同步骤中发生。酵母Atg1的LIR基序在人ULK1中是保守的，在那里它介导与Atg8样蛋白GABARAP和GATE-16的结合，已知这两种蛋白调节自噬体形成的后期步骤(Weidberg等人，2010年). 之前已经观察到ULK1与膜相关(Chan等人，2009年)，我们的结果表明，ULK1向自噬体样结构的募集至少部分依赖于其与GABARAP/GATE16的相互作用。虽然导致ULK1-DFP表达细胞中WIPI2点积聚的确切分子机制尚待确定，但这可能反映了在自噬后期GABARAP/GATE16的功能中对ULK1的需求(Weidberg等人，2010年). 同样，Atg8与Atg1的结合是其在酵母中募集到膜和液泡降解所必需的，并且Atg1–Atg13复合物也在植物的自噬体上可见(Suttangkakul等人，2011年). 这些结果表明，Atg1/ULK1可能在货物吞噬或自噬体形成，或其成熟和传递到液泡中发挥保守作用。例如，Atg1/ULK1可以磷酸化，从而激活参与自噬体闭合或液泡融合的因子。有趣的是，不能结合Atg8的酵母Atg1突变体在Cvt途径中表现出缺陷，但当用GFP-Atg8裂解试验测定时，并没有显著影响自噬进展。由于Cvt小泡通常比自噬体小，因此在后期可能需要更高的局部Atg1活性，因此只有当通路已经敏化时，Atg1-LIR突变体的自噬缺陷才变得明显。这一观点与激酶活性降低的Atg1突变体一致，后者影响Cvt途径，自噬缺陷极小。或者，Atg8–Atg1复合物可能对选择性自噬途径特别重要，这些途径需要特殊机制来选择和吞噬不同的货物。这些特殊步骤可能需要局部的Atg1/ULK1活性，这对于饥饿诱导的大量自噬是不必要的。

不管精确的分子功能如何，我们的结果表明，与自噬体相连的Atg1–Atg13复合物随后在液泡中降解。有趣的是，这种依赖于Atg8的降解机制有效地下调活化的Atg1–Atg13复合物，因此可以通过将自噬通量与新合成Atg1和Atg13所需的氨基酸和能量的可用性耦合来防止过度的自噬降解。由于饥饿调节的信号通路（如TORC1）不仅诱导自噬，而且抑制蛋白质翻译，因此这些机制有望协同调节自噬流量以满足生理需求。这种负反馈回路以前是根据苍蝇的遗传实验提出的，其中TORC1激活Atg1激酶，而Atg1又反过来反馈给TORC1以微调通路的活性(Chang和Neufeld，2009年).

质粒构建和双杂交分析

质粒列在补充表S2。通过QuikChange突变（Stratagene）进行定点突变，并通过测序进行验证。ATG13公司利用其内源性启动子和终止子（分别为698和371个碱基）从基因组DNA中扩增并连接到pRS316载体(西科尔斯基和希特，1989年)使用Xba公司我和Hin公司dIII限制位点。TAP和GFP融合自动液位计1通过连接PCR-扩增的TAP和GFP标签生成Pst（磅/平方英尺）我-萨尔我去的C终点自动液位计1在其内源性启动子（726个碱基）下表达，克隆到pRS315中。通过对pRS316-GFP-Atg8质粒进行亚克隆，构建了pRS313-GFP-Atg8质粒Xho公司我-囊I站点。酵母双杂交试验按所述进行(Kijanska等人，2010年).ATG13公司，自动液位计1并将所示突变体分别亚克隆到酵母双杂交载体pGAD和pLEX中。

酵母细胞提取物的制备、免疫沉淀和pho8Δ60测定

如前所述，使用TCA和免疫印迹进行蛋白质提取(Kijanska等人，2010年). 为了在非变性条件下制备提取物，细胞在选择性培养基中生长至OD₆₀₀0.5–0.8，通过离心收集并用2%葡萄糖在PBS中洗涤。然后将细胞重新悬浮在颗粒体积的裂解缓冲液中（PBS、10%甘油、0.5%吐温-20、1 mM NaF、1 mMPMSF、1 mM-Na_三VO（旁白）₄蛋白酶抑制剂鸡尾酒；Roche），并在液氮中冷冻成液滴。在用冷冻磨机（6770，Spex，USA）破碎细胞后，在5000℃下离心清除提取物克5分钟，然后在10000下进行两次离心克持续15分钟。注意，与球状成形相比，冷冻碾磨破坏了细胞器封闭的蛋白质。

HA免疫沉淀按说明进行(Kijanska等人，2010年). 对于蛋白A免疫沉淀，根据制造商的协议，Dyna环氧磁珠（Invitrogen）与兔IgG偶联，并代替HA琼脂糖使用。

按照说明进行pho8Δ60分析(克林斯基，2007年). 为了确保酶反应的线性范围，使用两种不同的样品浓度进行分析。

细胞分离和蛋白酶保护试验

将在SD-N中饥饿4小时的酵母细胞洗涤，并用2-OD/ml DTT缓冲液（10 mM DTT，10 mM Tris pH 9.4；15分钟，30°C）培养，再悬浮在10-OD/ml SP缓冲液（1 M山梨醇，20 mM PIPES pH 6.8）中，并通过酶-20T（MP Biomedicals）处理进行球形化。通过离心（2000克5分钟）并用渗透溶解缓冲液（200 mM山梨醇，20 mM管道pH 6.8，5 mM MgCl）轻轻溶解₂，“input”）以保存细胞器内的封闭颗粒。两个500之后克离心步骤去除未破碎的细胞，得到的总裂解物（T'）进一步分离成5000个克上清液（'S'）和颗粒部分（'P'）。使用抗Pgk1、抗Ape1和抗Atg1抗体进行免疫印迹分析，以确定Atg1的分离和分布效率。在含有完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）和0.1 mM PMSF的情况下，用0.2%Triton X-100处理颗粒部分30分钟，然后用5000克离心步骤，分离上清液（'S'）和不溶性颗粒部分。对于蛋白酶保护分析，5000克将颗粒重新悬浮在含有或不含蛋白酶K（50μg/ml，AppliChem）和0.2%Triton X-100的渗透溶解缓冲液中。在冰上培养30分钟后，用TCA沉淀样品，并用抗Ape1、抗Atg1和抗Pep12（分子探针）抗体进行免疫印迹分析。

激酶分析

总之，将10 mg清洁酵母提取物与50μl IgG-耦合磁珠（Dynabeads，Invitrogen）在4°C下培养1 h，并进行旋转。在IP缓冲液（100 mM Tris–HCl pH 7.5，300 mM NaCl，10 mM EDTA，10 mM-EGTA，1%NP-40，10 m M Na）中清洗珠子4×_三VO（旁白）₄，10 mM NaF，1 mM PMSF，蛋白酶抑制剂鸡尾酒；罗氏），在激酶缓冲液中两次（25 mM MOPS pH 7.5，1 mM EGTA，10 mM Na_三VO（旁白）₄，15 mM氯化镁₂). 在总体积为11μl、含有10μCiγATP的条件下，在30°C下进行激酶反应20分钟。用10μl尿素负载缓冲液停止反应，并通过SDS-PAGE和荧光成像进行分析。

漂浮物分析

蔗糖梯度中的浮选根据林伍德和西蒙斯（2007）简而言之，将清除的酵母或HeLa细胞提取物调整为40%蔗糖，并在TNE中以5-35%蔗糖梯度分层（50 mM Tris–HCl pH 7.4，150 mM NaCl，2 mM EDTA，蛋白酶抑制剂鸡尾酒；罗氏）。梯度在20万下离心克在Beckman Coulter Optima TLX超离心机的SW41转子中放置18小时。总共收集了1 ml组分，并用TCA沉淀。请注意，底部4–5个级分含有可溶性蛋白质，如calnexin，而脂质相关复合物漂浮在较高的级分中（caveolin）。

Atg8-结合试验和联合免疫沉淀试验

使用IgG-coupled sepharose beads（GE Healthcare）在自然条件下制备的酵母细胞提取物在4℃下免疫沉淀过夜，洗涤TAP标记蛋白，然后用TEV蛋白酶在4℃或16℃下裂解3-6小时。TEV洗脱液与3–4μg GST-Atg8或纯化自大肠杆菌用兔多克隆抗TAP（Thermo Scientific）和鼠单克隆抗GST抗体（Sigma）分析结合蛋白。对于联合免疫沉淀实验，将20 mg清洁酵母提取物与30μl抗HA琼脂糖珠（Sigma）或磁性Dynabeads（Invitrogen）在4°C的旋转轮上与兔IgG耦合培养1 h。将小球在裂解缓冲液中洗涤6倍，并用70μl尿素负载缓冲液洗脱结合蛋白。

哺乳动物Atg8蛋白的纯化和哺乳动物结合分析

GST、GST-LC3B、GST-GABARAP或GST-GATE-16蛋白从大肠杆菌在谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂上。总之，33μg每种蛋白质与含有蛋白酶抑制剂（罗氏）的PBS中的谷胱甘肽Sepharose 4B珠结合。在TNTE缓冲液（20 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，5 mM EDTA，0.3%Triton X-100）中，由转染HA-ULK1野生型或HA-ULK1的HEK293细胞制备的细胞裂解物，其中含有突变D356A、F357A、P361A补充有完整蛋白酶抑制剂的鸡尾酒与GST蛋白结合珠培养2小时，然后在TNTE中大量洗涤。结合蛋白用2×样品缓冲液洗脱，并通过SDS-PAGE和western blotting进行分析。

哺乳动物蛋白质的共免疫沉淀

使用脂质体2000（Invitrogen）和GFP-GABARAP转染HEK293细胞，或与GFP-GABARAP和野生型HA-ULK1或DFP突变体联合转染。作为阴性对照，如上所述使用GFP而不是GFP-GABARAP转染细胞。第二天用冷PBS清洗细胞一次，并在补充有完整蛋白酶抑制剂混合物的TNTE缓冲液（20 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，5 mM EDTA，0.3%Triton X-100）中溶解。GFP-GABARAP和GFP蛋白通过与GFP-Trap珠（ChromoTek）在4°C孵育1小时来免疫沉淀，然后用TNTE进行两个洗涤步骤，再用50 mM Tris 7.4进行额外洗涤。然后向小球中添加30μl的2×样品缓冲液（125 mM Tris 6.8，6%SDS，20%甘油，6.66%β-巯基乙醇，0.2%溴酚蓝），并在100°C下煮沸10分钟。分别使用兔抗ULK1（Santa Cruz）或鼠抗HA（Covance）通过western blot分析内源性ULK1或过度表达的HA-ULK1的结合。

净化和在体外Atg1和Atg13片段的结合分析

Atg1的501–897氨基酸和野生型或Atg13-FV突变体的432–520氨基酸被克隆到pGEX4T1中，从而产生N-末端GST融合蛋白。蛋白质从大肠杆菌在谷胱甘肽Sepharose 4B树脂上，Atg13蛋白在1×PBS pH 7.4条件下与凝血酶裂解。在4 mM pefabloc和固定在谷胱甘肽Sepharose 4B珠上的GST-Atg1存在下培养多余的裂解Atg13。大量洗涤后，用样品缓冲液洗脱结合蛋白，并通过SDS-PAGE和考马斯染色进行分析。使用ImageJ软件量化Atg13与GST-Atg1结合的比率，并根据各自蛋白质的大小进行标准化。从Atg13与GST-Atg1的考马斯染色凝胶定量的比率为0.11，而尺寸比率为0.13。因此，结合比大约为1:1。

体内甲基化相互作用测定

Atg1的C末端标记有组蛋白3-HA，C末端标记为野生型，Atg13-FV突变体标记有Suv甲基化酶域。这两种蛋白均由其内源性启动子在CEN质粒上表达atg1处Δ第13天Δ酵母菌株，并通过分析Ape1处理进行功能测试。M-track甲基化分析按所述进行(Zuzuarregui等人，2012年).

免疫荧光

如前所述，生成稳定表达GFP-LC3的HEK293细胞(Kochl等人，2006年)在盖玻片上生长，并使用Fugene转染试剂（Promega）转染野生型HA-ULK1或DFP突变体。为了分析HA-ULK1与GFP-GABARAP的共定位，用相同的方法将GFP-GABARAP和HA-ULK1共转染HEK293细胞。第二天，在Earls平衡盐溶液（EBSS）中培养细胞2小时，诱导细胞自噬。然后将细胞固定在4%多聚甲醛中，用50 mM NH淬火₄Cl作用10分钟，用0.2%Triton X-100渗透3分钟。在5%BSA中封闭1小时，然后用大鼠抗HA（Roche#11867423001）和小鼠抗WIPI2孵育1小时(Polson等人，2010年)抗体，在PBS中清洗三次，并与二级抗体（山羊抗鼠555、驴抗鼠647；Invitrogen）孵育1小时。然后用PBS清洗细胞三次，然后用mowool（Calbiochem）将其安装在玻璃载玻片上。使用配备有×63浸油物镜的LSM 510激光扫描共焦显微镜（卡尔蔡司显微成像公司）采集图像。HA-ULK1和WIPI2斑点的定量是使用Imaris图像分析软件中的斑点函数对盲法样品进行的，对所有分析的细胞保持相同的阈值。

我们感谢Larissa Wilhelm、Dan Klonsky、Egon Ogris和Zvulun Elazar的质粒和抗体；谢尔盖·佩莱（Serge Pelet）提供显微镜方面的建议；Fulvio Reggiori分享未发表的结果；彼得实验室成员进行有益的讨论；以及Alicia Smith、Reinhard Dechant和Fulvio Reggiori对手稿的批判性阅读。CK由瑞士国家科学基金会（SNF）的Marie-Heim Vögtlin奖学金和维也纳科学技术基金会（WWTF）的“维也纳青年研究小组”资助。MK是分子生命科学博士项目（MLS）的成员，也是系统生理学和代谢疾病能力中心（SPMD）的MP和SSL的成员。SAT和EK由英国癌症研究所支持。Peter实验室的工作分别由欧洲研究委员会（ERC）、欧盟第七个框架项目UNICELLSYS以及SystemsX.ch、SNF和苏黎世ETH提供资助。

作者贡献：CK、MK、EK、ES、SL、GS、IS、AB、IH和MV进行了实验。CK、MK、EK、ES、SL、GA、KH、ST和MP参与了实验设计。CK和MP写了这篇论文。