在所有真核生物中发现的一种高度保守的细胞营养状态传感器是AMP-activated protein kinase(AMPK)。作为对细胞内ATP减少的反应,AMPK被激活并作为代谢检查点,通过急性调节代谢酶和抑制促生长合成代谢途径恢复ATP水平(1). LKB1是在低能量条件下激活AMPK所必需的上游激酶,其失活是几种形式的人类癌症中的常见事件(2). 此外,全球最流行的2型糖尿病药物二甲双胍的治疗效果需要肝脏中的LKB1信号,而小鼠肝脏中LKB1失活会导致2型糖尿病样代谢病(三). 因此,LKB1-AMPK途径提供了肿瘤抑制与细胞和生物体代谢控制之间的直接联系。
与AMPK激活类似,细胞自噬过程是在营养不良和低能量条件下启动的,作为一种生存机制,以确保关键代谢中间产物的可用性,并消除受损的细胞器,包括线粒体(4). 自噬被认为是在营养有限的条件下由一种保守的激酶复合体启动的,该复合体包含丝氨酸-三氢嘌呤激酶Atg1及其相关亚单位Atg13和Atg17(5). 在哺乳动物中,这种复合物由两种Atg1同源物ULK1和ULK2以及亚基Atg13和FIP200编码,它们通过尚不清楚的机制向下游自噬调节因子发出信号。在酵母和哺乳动物细胞中,在营养丰富的条件下,雷帕霉素靶向复合物1(TORC1)抑制Atg1或ULK1的活性(6). 然而,激活Atg1或ULK1的生化事件尚未确定。
我们使用两部分筛选来确定AMPK的底物,这些底物调节AMPK对细胞生长和代谢的影响。首先,我们使用了一个最佳的AMPK衬底基序(7)在真核生物数据库中搜索含有保守候选靶位点的蛋白质。AMPK的许多体内底物不仅符合该基序,而且在AMPK磷酸化后也与磷酸结合蛋白14-3-3结合。因此,我们在野生型但非AMPK缺陷细胞中筛选与重组14-3-3结合的蛋白质,并且仅在能量应激条件下,当AMPK激活时进行筛选。我们确定的一种蛋白是哺乳动物Atg1同源物ULK1,它包含多个保守的候选AMPK磷酸化位点,并以AMPK依赖的方式与14-3-3相关(). ULK1包含四个站点(Ser467,序列号555、Thr574,序列号637)匹配最佳AMPK底物基序,所有这些基序在高等真核生物中都是保守的。其中两个地点保存在秀丽隐杆线虫(序列号555和Ser574)在哺乳动物家族成员ULK2中,虽然不是较远的家族成员ULK1和ULK4,但与ULK1、ULK2不同,它们被认为不具有自噬功能。事实上,内源性AMPK亚单位与ULK1和ULK2共同免疫沉淀,但与ULK3没有共同免疫沉淀(图S1)和AMPK亚单位在与过度表达的ULK2共同免疫沉淀蛋白的无偏见鉴定中被发现(图S2)与最近的蛋白质组分析一致(8). 为了检测ULK1在体内的磷酸化位点,我们对从使用或不使用线粒体复合物I抑制剂苯福明处理的细胞中分离的表位标记的ULK1进行了串联质谱分析(9). 我们在ULK1中检测到跨越四个候选AMPK位点中三个位点的肽(Ser555、Thr574、Ser637),这三个位点只有在二甲双胍治疗后才被磷酸化(图S3、S4). 为了在体外检测ULK1是否可以作为AMPK的直接底物,我们创建了一个激酶活性等位基因(K46I;参考文献。10),以消除其自身磷酸化。AMPK对ULK1的磷酸化程度高于既定底物Raptor(,第5页),这可能反映了ULK1中至少存在四个潜在的AMPK位点,而猛禽则有两个AMPK据点(7). 我们产生了针对Ser的磷酸特异性抗体467和Ser555ULK1。这两个位点的磷酸化都是由二甲双胍处理或具有组成活性AMPKα1等位基因的ULK1表达诱导的(11)在没有能量压力的情况下(). 在体外激酶分析中,纯化的AMPK也在这些位点诱导磷酸化,与它们的直接磷酸化一致(). 使用AMPK和ULK1缺陷的原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或匹配的对照野生型MEF,我们观察到内源性ULK1在Ser555在用AMP-mimetic AICAR处理细胞后以AMPK依赖的方式(). 值得注意的是,这些细胞中ULK1的磷酸化与两种真正的AMPK底物ACC和Raptor的磷酸化平行(,第6页).
ULK1是AMPK的保守底物。(A)ULK1中的四个保守位点和ULK2中的两个位点与最佳AMPK底物基序匹配的晶体排列。(B)将ULK1和GST或GST-14-3-3表达载体转染到人类胚胎肾(HEK)293T细胞中,并放置在含有20µM STO-609(STO)、载体(veh)或5mM苯福明(Phen)的培养基中1h。如图所示,对细胞裂解物和GST下拉进行免疫印迹。(C)用myc-标记的催化失活(KI:K46I)ULK1或myc-标签的野生型猛禽进行体外激酶分析,这些猛禽是从HEK293T细胞中免疫沉淀出来的,并用作纯化活性AMPK的底物,存在于32P-γ-ATP。(D)将转染myc标记的野生型ULK1或丝氨酸-丙氨酸ULK1突变体的HEK293T细胞用载体或1mM苯甲酸处理1h,或与组成活性AMPKα1(aa1-312)哺乳动物表达载体联合转染(11). 如图所示,用磷酸特异性抗体对裂解产物中的蛋白质进行免疫印迹。(E)使用上述myc-ULK1和纯化AMPK进行体外激酶分析。用指示的磷酸特异性抗体免疫印迹检测myc-ULK1的磷酸化。(F)用2mM AICAR或载体处理小鼠原代胚胎成纤维细胞(MEFs)1h。所示的裂解物免疫印迹,包括检测内源性ULK1 P-Ser555
我们研究了AMPK或ULK1缺陷对小鼠肝脏和原代肝细胞自噬标记物的表型影响。AMPK缺陷肝脏的免疫印迹和免疫组化分析(12)显示p62蛋白的积累(,第7部分)其自噬的选择性降解使其成为这一过程中广泛使用的标志物(13). p62包含一个UBA泛素结合域,该域介导与靶向自噬介导降解的泛素化货物的结合(13). 与此功能一致,在AMPK缺乏的肝脏中,p62聚集体与泛素聚集体共定位(图S7). 值得注意的是,p62被征募到线粒体中以进行有丝分裂,并参与线粒体聚集和清除(14,15). ULK1-deficient小鼠在成熟红细胞中表现出缺陷线粒体的堆积,而成熟红细胞通常缺乏线粒体(16). 考虑到在小鼠肝脏中缺乏AMPK时p62的异常积累,以及啮齿动物肝细胞在培养时发生明显的有丝分裂(17),我们检测了原代肝细胞中AMPK或ULK1缺乏是否会出现线粒体缺陷。在AMPK或ULK1缺陷肝细胞的裂解液中,p62和线粒体标记蛋白CoxIV的蛋白水平同样升高,但野生型对照组没有升高(,S8). 内源性ULK1-Ser磷酸化增加555二甲双胍激活AMPK后,在野生型但非AMPK缺乏的肝细胞中观察到(). 使用透射电子显微镜(TEM)对ULK1和AMPK肝细胞进行进一步分析,发现异常线粒体水平升高,并使用形态计量软件进行定量分析(,右侧面板)。类似于其他自噬突变肝细胞的发现(18)与野生型对照组相比,AMPK和ULK1缺陷肝细胞中每个细胞的线粒体数量显著增加(图S9)线粒体膜蛋白TOM20的免疫细胞化学染色也可见().
小鼠肝脏或原代小鼠肝细胞AMPK或ULK1基因缺陷会导致自噬缺陷。(A)对来自母鼠配对小鼠的肝裂解物进行免疫印迹以检测所示抗体。通过免疫印迹密度测定计算p62与肌动蛋白的比值。数据显示为平均值+/-SEM。*p<.01(B)来源于ULK1的原代肝细胞+/+或ULK1−/−小鼠或AMPKa1+/−a2类L(左)/+或AMPKa1−/−a2类升/升如方法所述,将其置于含有2mM二甲双胍(met)或载体(veh)的培养基中2h。用所示抗体对裂解液进行免疫印迹。(C)对所示基因型的原代小鼠肝细胞进行透射电子显微镜(TEM)检查,发现AMPK-和ULK1-缺陷细胞中线粒体积聚。线粒体伪红色,细胞质蓝色,细胞核绿色,脂滴黄色。(D)通过线粒体标记物TOM20(红色)和细胞核(蓝色)的免疫细胞化学染色,对指定基因型的原代小鼠肝细胞进行染色。比例尺,10微米。
考虑到ULK1中AMPK位点的保守性,我们检测了这两种蛋白在线虫自噬中是否发挥保守性作用秀丽隐杆线虫。在基于秀丽隐杆线虫LC3同源物LGG-1(19,20),我们观察到胰岛素信号通过基因突变丢失(daf-2(e1370))或针对胰岛素受体的RNAidaf-2型导致皮下缝细胞中GFP::LGG-1阳性病灶数量增加,表明自噬增加,与胰岛素信号在抑制自噬中的既定作用一致秀丽隐杆线虫(19–23).daf-2型RNAi处理的突变蠕虫aak-2型或unc-51号机组AMPK和ULK1直方图分别导致含有点状突起的LGG-1丰度降低().daf-2型RNAi未能增加AMPK缺陷蠕虫LGG-1阳性病灶的数量(). 这些数据表明,AMPK和ULK1在胰岛素信号减少诱导的自噬中起着关键作用秀丽隐杆线虫表达组成活性AMPK的转基因蠕虫与对照组相比,缝细胞中LGG-1阳性病灶的数量增加了约3倍(). 喂食unc-51 RNAi后,LGG-1阳性病灶的数量显著减少()[中的所有原始数据图S10]. 这些观察结果表明,AMPK激活足以诱导蠕虫自噬,而ULK1是诱导自噬所必需的。
AMPK对于诱导自噬是必要的和充分的秀丽隐杆线虫.(A)胰岛素受体daf-2(e1370)用对照RNAi或RNAi处理表达GFP::LGG-1(相当于GFP-LC3)的突变蠕虫贝克-1(贝克林),aak-2型(AMPKα2)或unc-51号机组(ULK1)和每个皮下缝细胞LGG-1/LC3阳性点状细胞的数量被量化。(B) aak-2(ok524)表达GFP::LGG-1的突变体或野生型N2(WT)动物接受对照或daf-2型RNAi,并对每个缝细胞的LGG-1阳性泪点进行评分。(C)表达组成活性AAK-2的转基因蠕虫(参考。11)(氨基酸1-321)::番茄(CA-AAK-2::番茄(1-321)分析融合或对照组每个缝细胞的LGG-1阳性点。(D)表达CA-AAK-2的动物(1-321)::番茄和GFP::LGG-1用对照或unc-51号机组RNAi和LGG-1/LC3阳性点状细胞评分。所有面板均显示相对计数,请参见图S10了解详细信息。数据显示为平均值+/-SEM。*P<.0001
为了测试ULK1的AMPK磷酸化是否是ULK1功能所必需的,我们稳定地将野生型(WT)、催化非活性(KI)或AMPK非磷酸化(4SA)ULK1 cDNA引入人骨肉瘤U2OS细胞中,随后我们用慢病毒发夹shRNAs减少内源性ULK1和ULK2,以对抗每种细胞(图S11). 与感染空慢病毒载体的亲代U2OS细胞相比,稳定表达ULK1和ULK2 shRNA的U2OS电池的p62数量增加,表明自噬缺陷(,比较车道1和2)。myc标记的WT ULK1 cDNA的稳定逆转录病毒重组,而不是4SA或KI突变,恢复了p62降解(,3-5车道;图S12). 此外,我们重建了也被内源性ULK2敲除的ULK1−/−MEF(图S13)用WT、KI或4SA ULK1 cDNA检测这些细胞系在饥饿培养基中的自噬程度。缺乏ULK1和ULK2的MEF在饥饿时p62水平升高。与KI或4SA表达细胞不同,用WT ULK1重组的细胞降低了p62水平,而KI或4 SA表达细胞表现为ULK缺乏状态(,S14标准). 为了测试4SA突变体是否对线粒体内稳态有影响,我们在WT、KI和4SA ULK1稳定重建的ULK缺陷MEF上使用TEM和线粒体选择性染料。TEM和Mitotracker Red染色显示,与WT ULK1细胞相比,KI和4SA-ULK1表达细胞改变了线粒体的稳态,表现为线粒体总数增加和形态异常(,S18、S19). 饥饿后KI-和4SA-ULK1重组细胞中线粒体的嵴改变和异常形态增强(图S19). 为了测试这些线粒体是否功能受损,我们用活性依赖的JC-1染料分析了线粒体膜电位,结果显示KI和4SA重组MEF存在缺陷().
ULK1的AMPK磷酸化是营养剥夺后有丝分裂和细胞存活所必需的(A)将稳定表达小鼠野生型(WT)或催化非活性(KI)或AMPK非磷酸化(4SA)ULK1 cDNA的U2OS细胞或空逆转录病毒载体(v)以及抗内源性人类ULK1和ULK2的shRNA放在含有5mM苯丙氨酸(Phen)或载体的培养基中1h。如图所示,对裂解液进行免疫印迹。(B)将稳定表达WT、KI或4SA ULK1 cDNA的ULK1−/−MEF或空逆转录病毒载体(v)以及针对内源性ULK2的shRNA放置在EBSS饥饿培养基(饥饿)或对照培养基(ctl)中,在有或无BafilomycinA(BafA)的情况下放置6h,并按指示进行免疫印迹。(C)通过TEM和Inform形态计量软件分析来自(B)的细胞。线粒体伪红色,细胞质蓝色,细胞核绿色。(D)对在基础条件下用JC-1染色或用线粒体解偶联剂CCCP作为对照的(B)细胞进行荧光激活细胞分选(FACS)分析,以测量线粒体膜电位。受损的线粒体膜电位向左移动,正如在CCCP处理的细胞中观察到的那样。(E)将转染20nM siRNA池的野生型(WT)MEF放入通用对照(ctl)、小鼠Atg5或小鼠ULK1和ULK2中72小时,然后放置在饥饿培养基(starv)或标准培养基(ct1)中12小时,并通过AnnexinV-FACS对细胞死亡进行评分。(F)将来自(B)的细胞置于饥饿培养基(starv)或标准培养基(ctl)中12小时,并通过AnnexinV-FACS对细胞死亡进行评分。(G)通过直接磷酸化ULK1和抑制mTORC1对ULK1的抑制,在双分支机制中激活ULK1 AMPK的模型。
细胞自噬缺陷的一个特征是在应激刺激后容易发生凋亡,而应激刺激通常会激活自噬以促进细胞存活(24). 我们研究了在饥饿后细胞生存需求方面,ULK1/2缺陷与中心下游自噬调节因子(如Atg5)的缺失相比如何。用对照、Atg5或联合ULK1和ULK2 siRNA处理野生型MEF,并分析其在饥饿条件下对细胞活力的影响。ULK1和ULK2的同时缺失反映了饥饿时Atg5缺失所观察到的细胞死亡的数量和动力学(,S20码). 接下来,我们研究了ULK1中AMPK位点的突变是否也可能模拟ULK1/2在该细胞存活试验中的功能丧失。用WT而非KI或4SA ULK1重建ULK缺陷的MEF,可在饥饿后恢复细胞存活(). 表达KI或4SA突变体ULK1的ULK1缺陷细胞显示出与使用ULK1和Ulk2 siRNA处理的WT MEF类似的细胞死亡率。因此,ULK1中AMPK位点的丢失模拟了ULK1和Ulk2在营养剥夺后细胞存活控制中的完全丢失。
我们的发现揭示了能量感应和核心保守自噬蛋白之间的直接联系。在哺乳动物中,ULK1的功能需要AMPK对ULK1进行磷酸化,以应对营养剥夺。AMPK抑制mTOR活性,mTOR抑制ULK1(25–29),AMPK通过双通道机制控制ULK1,确保仅在适当的细胞条件下激活(,S21型). 在许多生理和病理环境中,此途径可能发挥关键作用(30). 除了这些信号事件的保守性质和一些自噬基因作为肿瘤抑制剂的作用之外(24,31)AMPK在多种人类癌症中存在缺陷,其上游激酶LKB1发生失活突变。因此,正如二甲双胍刺激肝脏ULK1磷酸化和AMPK缺陷肝脏自噬严重缺陷所观察到的,ULK1可能在LKB1/AMPK途径对肿瘤抑制或代谢疾病治疗的有益作用中发挥中心作用。ULK1对线粒体内稳态和细胞存活的依赖性影响可能代表二甲双胍和其他AMPK活化剂对整体有机体健康和寿命的额外有益影响(32).