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.2011年3月22日；108(12):4788-93.
doi:10.1073/pnas.1100844108。 Epub 2011年3月7日。

营养饥饿引起由Ulk1去磷酸化介导的急性自噬反应及其随后与AMPK的分离

李斌商 1, She Chen女士, 丰河渡, 沈丽（Shen Li）, 赵丽萍, 王晓东
附属公司

营养饥饿引起由Ulk1去磷酸化介导的急性自噬反应及其与AMPK的解离

李斌商等。 美国国家科学院程序. .

摘要

大自噬（以下简称自噬）是一种进化上保守的自我消化过程细胞，适应饥饿和其他应激反应。饥饿时，自噬被诱导，为细胞提供所需的营养物质。我们在这里报道了Unc-51样激酶1（Ulk1），一种哺乳动物自噬的关键启动子，在饥饿时经历了剧烈的去磷酸化，特别是在丝氨酸638和丝氨酸758。Ulk1的磷酸化是由哺乳动物靶向罗哌霉素（mTOR）激酶和腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK）介导的。AMPK以营养依赖的方式与Ulk1相互作用。Ulk1上的适当磷酸化对Ulk1/AMPK关联至关重要，因为Ulkl上的单一丝氨酸-丙氨酸突变（S758A）会破坏这种相互作用。与野生型ULK1相比，该ULK1-S758A突变体在早期启动饥饿诱导的自噬更快，但在饥饿延长时不会改变自噬的最大容量。因此，这项研究揭示了以前未被注意到的对环境变化的急性自噬反应。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
Ulk1在丝氨酸638和丝氨酸758处的磷酸化受到不同的调节。(A类)Ulk1磷酸化动力学。U2OS细胞在全饥饿培养基（含1%富培养基的HBSS溶液）中饥饿，然后用富培养基（DMEM加10%透析的FBS）补充，持续时间如图所示。通过Western blotting分析细胞提取物，以可视化Ulk1在丝氨酸638和丝氨酸758的磷酸化。(B类)如图所示，U2OS细胞处理2小时。取血清时，细胞在无FBS的DMEM中培养；为了提取DMEM，在HBSS中使用10%透析的FBS培养细胞。使用针对这两个位点的磷酸特异性抗体分析Ulk1在Ser638和Ser758的磷酸化。(C类)钙对丝氨酸638处的Ulk1磷酸化至关重要，但对丝氨酸758则不然。如图所示，U2OS细胞被处理2小时。通道3：向全饥饿培养基中添加钙，以达到与常规DMEM中相同的钙浓度（0.2 g/L）；通道4：常规DMEM培养基（含10%透析FBS），单次钙缺失。另请参见图S1.
图2。
图2。
Ulk1在丝氨酸638和丝氨酸758处的磷酸化由mTOR和AMPK不同地介导。(A类)雷帕霉素处理诱导Ulk1在丝氨酸638和丝氨酸758处脱磷酸化。U2OS细胞在富培养基中培养，并添加雷帕霉素（100 nM）。然后在雷帕霉素处理后的给定时间点收集细胞。(B类)mTOR的敲除诱导Ukl1在丝氨酸638和丝氨酸758处的去磷酸化。用对照siRNA（Luc）或mTOR siRNA寡核苷酸转染U2OS细胞。转染72h后，收集细胞并用Western blotting分析提取物。(C类)敲除AMPK诱导Ulk1在丝氨酸638处去磷酸化，但丝氨酸758处不去磷酸化。在添加多西环素（Dox）后，生成了可诱导敲除AMPKα（α1和α2）或AMPKβ（β1和β2）的U2OS稳定细胞系。添加Dox后72小时，通过Western blotting观察Ser638和Ser758处Ulk1的磷酸化。(D类)AMPK活性与Ulk1在丝氨酸638处的磷酸化相关，但与丝氨酸758处的磷酸化无关，这与各种营养条件有关。如图所示，U2OS细胞处理2 h，并通过Western blotting分析细胞提取物。
图3。
图3。
Ulk1与AMPK相互作用，以响应养分的可用性。(A类)在培养细胞时，只有Ulk1与AMPK相关，而mAtg13没有。在HeLa细胞中，生成了Flag-HA-Ulkl和Flag-HA-Atg13稳定株。用富培养基或全饥饿培养基处理细胞2小时。使用从上述处理制备的细胞提取物进行Flag-HA串联IP分析。最终洗脱液中的蛋白质用4-12%SDS-PAGE凝胶分离，并通过银染色进行可视化。箭头表示MS鉴定的主要免疫沉淀蛋白(B类)Ulk1/AMPK相互作用对养分可用性的响应动力学。如图所示，细胞饥饿，并用富培养基反复培养。然后进行标记IP分析。Western blotting分析Ulk1/AMPK关联模式。(C类)Ulk1/AMPK结合需要丝氨酸758处的Ulk1磷酸化。如图所示，用野生型Flag-Ulk1或Flag-Ualk1突变体转染HEK 293T细胞，并在富含或完全饥饿培养基中处理2 h。细胞提取物用抗旗帜珠免疫沉淀，洗脱液用Western blotting分析。(D类)Ulk1/AMPK结合不需要丝氨酸638处的Ulk1磷酸化。实验的执行与(C类)带有野生型Ulk1或指示突变体。另请参见图S2.
图4。
图4。
丝氨酸638和丝氨酸758的Ulk1磷酸化的功能输出。(A类)LLPD分析显示，与野生型Ulk1相比，Ulk1-S758A启动饥饿诱导的自噬更快(*对=0.003（单尾学生）t吨-用等方差进行测试，n个=3）。错误条代表SD.U2OS稳定细胞系，该细胞系在添加Dox后诱导敲除mAtg13。mAtg13的缺失也导致了Ulk1的缺失。添加Dox后72 h，用野生型Ulk1或Ulk1-S758A构建物转染细胞，并在不含Dox的富培养基中再培养48 h三H标记但过多的冷亮氨酸。然后将细胞在富含或完全饥饿的培养基中培养10分钟。的百分比三计算细胞释放到培养基中的H标记亮氨酸。(B类)无论是在喂食条件下还是饥饿后10分钟，表达Ulk1-S758A的细胞与野生型相比表现出更高的hVps34活性。使用与中相同的细胞和相同的转染(A类)，hVps34的激酶活性通过定量PI到PI3P在给定时间内的转化来测定，如材料和方法。错误栏表示SD(C类)上部：在喂食状态（0分钟）和饥饿30或120分钟后，表达Ulk1-S758A突变或野生型Ulk1的U2OS细胞中形成LC3II；下部：LC3II与LC3I比值的定量分析(n个=3）。(D类)在Ulk1-S638A背景下，丝氨酸758在补充培养基60分钟后不能正确地重新磷酸化，而在野生型Ulk1背景下，这一过程不到15分钟。产生了一种U2OS稳定细胞系，该细胞系在添加Dox后可诱导敲除Ulk1。添加Dox后72 h，用野生型Ulk1或Ulk1-S638A构建物转染细胞，并在富培养基中再培养48 h以允许表达。然后按照指示处理细胞。(E类)在S638A背景下，Ulk1/AMPK重新关联速度减慢。使用与中相同的细胞系和转染(D类)，将细胞饥饿1小时并恢复20分钟。提取物用抗病毒珠免疫沉淀，洗脱液用Western blotting分析。另请参见图S4.
图5。
图5。
Ulk1磷酸化对营养素的反应模型。当细胞被喂食时，Ulk1在丝氨酸638和丝氨酸758处发生超磷酸化。饥饿后，丝氨酸638首先去磷酸化；然后在丝氨酸758处进行去磷酸化。Ulk1的去磷酸化导致Ulk1/AMPK的解离。当细胞被富培养基补充时，mTOR被激活；它磷酸化丝氨酸638和丝氨酸758。Ulk1在丝氨酸758的磷酸化然后导致Ulk1和AMPK之间的重新结合。当接近时，AMPK的功能是将Ulk1磷酸化维持在丝氨酸638。
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    1. Levine B，Kroemer G.自噬在疾病发病机制中的作用。单元格。2008;132:27–42.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 水岛N，Levine B.哺乳动物发育和分化中的自噬。自然细胞生物学。2010;12:823–830.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 梅伦德斯A，诺伊费尔德TP。后生动物自噬的细胞生物学：一个发展的故事。发展。2008;135:2347–2360.-项目管理咨询公司-公共医学

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