AMPK和mTOR通过Ulk1的直接磷酸化调节自噬

AMPK通过磷酸化Ser 317和Ser 777激活Ulk1

为了了解AMPK激活Ulk1的机制，我们测定了Ulkl中的AMPK磷酸化位点。我们最初在Ulk1测试了AMPK共识站点。令人惊讶的是，Ulk1中AMPK共识位点（Ser 494、Ser 555、Ser 574、Ser622、Thr 624、Ser693和Ser 811）的突变对AMPK的Ulkl磷酸化没有显著影响在体外（未显示数据）。接下来，我们进行了系统的Ulk1缺失实验，发现AMPK磷酸化了Ulk的富含丝氨酸/苏氨酸的结构域（S/T结构域）(图2a). 进一步的缺失和突变分析确定Ser 317和Ser 777是主要的AMPK磷酸化位点(图2b). Ser 317和Ser 777的突变显著降低了AMPK对全长Ulk1的磷酸化，尽管不是完全降低在体外(补充信息，图S2a)这表明Ulk1中存在额外的AMPK磷酸化位点。然而，由于AMPK磷酸化和自身磷酸化导致的葡萄糖饥饿诱导的Ulk1迁移率变化在转染细胞中的S317/777A突变中显著降低(图2c)表明这两个残基是AMPK对葡萄糖饥饿反应的主要位点体内.确认Ulk1磷酸化体内制备抗体并验证其对AMPK磷酸化的重组Ulk1片段的特异性在体外317号和777号(补充信息，图S2b). 使用这些抗体的Western blot表明，AMPK联合转染增加了Ulk1 Ser 317和Ser 777的磷酸化(图2d).

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图2

AMPK直接磷酸化Ser 317和Ser 777的Ulk1。(一)AMPK磷酸化Ulk1 S/T结构域在体外顶部：用于绘制磷酸化位点的Ulk1结构域结构和缺失构建体的示意图。小鼠Ulk1蛋白由N-末端激酶结构域（KD；1-278）、富含丝氨酸/苏氨酸结构域（S/T结构域，279-828）和C-末端结构域（CTD，829-1051）组成。底部：从转染的HEK293细胞中免疫纯化所示Flag–Ulk1缺失突变体，并用于在体外AMPK分析作为底物。磷酸化通过³²western blot检测P-放射自显影和蛋白水平。(b条)Ulk1中AMPK磷酸化位点的测定。所示的重组GST–Ulk1突变体从大肠杆菌，并用作在体外AMPK磷酸化。缺失分析表明，S/T结构域中的两个Ulk1片段279-425和769-782被AMPK高度磷酸化在体外Ser 317突变消除了Ulk1片段279-425中的大部分磷酸化。在片段769–782中，五个丝氨酸残基（Ser 774、Ser 777、Ser 77 8、Ser 7 79和Ser 780）突变为丙氨酸，表示为（769–78 2）5SA，完全消除了AMPK的磷酸化作用。在该突变背景（769–782）4SA-S777中重组Ser 777，而不是其他四个残基中的任何一个，恢复了AMPK的磷酸化。GST和GST–TSC2F（TSC2片段1300–1367包含Ser 1345的AMPK磷酸化位点）分别用作AMPK反应的阴性和阳性对照。磷酸化测定方法³²考马斯染色检测P-放射自显影和蛋白水平。(c（c）)葡萄糖饥饿诱导的Ulk1磷酸化需要Ser 317/Ser 777体内将HA–Ulk1和突变体转染到HEK293细胞中。如图所示，细胞缺糖4小时。HA–Ulk1进行免疫沉淀，并通过western blot检测其流动性。(d日)AMPK诱导Ulk1 Ser 317和Ser 777的磷酸化。如图所示，野生型HA–Ulk1或S317/777A突变体与AMPK共同转染到HEK293细胞中。HA–Ulk1被免疫沉淀（IP），Ser 317和Ser 777的磷酸化被western blotting检测。斑点的未裁剪图像如所示补充图S5.

为了测定内源性Ulk1的Ser 317和Ser 777磷酸化，用磷酸化-Ser 317-和磷酸化-Ser777-特异性抗体检测MEF细胞的总裂解物。我们发现，葡萄糖饥饿诱导了317号和777号Ser的强烈Ulk1磷酸化(图3a). 值得注意的是，这些磷酸化在AMPK DKO细胞中完全减少。这些数据证明了AMPK在Ulk1 Ser 317和Ser 777磷酸化中的重要作用。Ser 317和Ser 777的磷酸化在30分钟时出现，在60–120分钟葡萄糖剥夺时达到峰值，这些磷酸化事件在重新添加葡萄糖后120分钟逐渐降至基础水平(图3b). 值得注意的是，氨基酸饥饿和雷帕霉素治疗不足以增加Ulk1 Ser 317和Ser 777的磷酸化，因为AMPK未被这些治疗激活。此外，化合物C抑制了Ulk1的磷酸化，二甲双胍（AMPK激活剂）刺激了Ulk的磷酸化⁴³)类似于AMPK底物ACC的磷酸化(图3c). 这一结果表明，AMPK激活对于Ulk1 Ser 317和Ser 777在葡萄糖饥饿时的磷酸化是必要的和充分的。为了确定葡萄糖饥饿时内源性Ulk1 Ser 317/Ser 777磷酸化的水平，我们将内源性Ul k1的相对磷酸化与在体外磷酸化的Ulk1，根据迁移率变化，它几乎被AMPK完全磷酸化(图3d). 葡萄糖饥饿诱导内源性Ulk1磷酸化至约50%的水平在体外磷酸化Ulk1，表明内源性Ulk1的显著部分确实在葡萄糖饥饿时被磷酸化。这些数据表明Ulk1 Ser 317和Ser 777在生理条件下被AMPK磷酸化。

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图3

AMPK依赖性的Ulk1 Ser 317和Ser 777磷酸化是Ulkl激活应对葡萄糖饥饿的必要条件。(一)如图所示，AMPK野生型或DKO MEF缺乏葡萄糖（4小时）。对总细胞裂解液进行Ulk1蛋白和磷酸化检测。(b条)Ulk1 Ser 317和Ser 777磷酸化响应葡萄糖饥饿/再添加的时间进程。MEF在指定时间内缺乏葡萄糖（−Glu）。饥饿3小时后，将培养物切换到含葡萄糖（25mM）的培养基，并收获样品（Re-Glu）。同时，用无氨基酸（−A.A）培养基或50 nM雷帕霉素（Rapa）处理细胞3小时(c（c）)Ulk1 Ser 317和Ser 777的磷酸化与AMPK活性相关。MEF缺乏葡萄糖（4小时），如存在或不存在20µM化合物C（C.C）所示。同时，在富含葡萄糖的培养基中用2 mM二甲双胍（Met，2 h）处理细胞。ACC S79的磷酸化被测试为AMPK激活的阳性对照。(d日)葡萄糖饥饿导致Ulk1在Ser 317和Ser 777高度磷酸化体内.测定Ulk1磷酸化水平体内，免疫纯化的HA–Ulk1蛋白被AMPK磷酸化在体外（100%代表AMPK对Ulk1的完全磷酸化）。体外磷酸化的HA–Ulk1按指示稀释，并与在富含葡萄糖（+Glu）或无葡萄糖（−Glu，4h）培养基中生长的细胞的免疫沉淀的HA–Ultk1一起进行免疫印迹。然后量化条带的密度。通过这一测量，从葡萄糖缺乏细胞中分离出的大约50%的Ulk1在Ser 317和Ser 777上被磷酸化。(e（电子）)从在高糖培养基中生长的转染HEK293细胞中免疫纯化所示HA–Ulk1蛋白，然后在冷ATP存在下与AMPK孵育15分钟在体外反应后，通过大量洗涤去除AMPK，在存在的情况下对产生的Ulk1免疫复合物进行激酶活性检测³²P-ATP。(（f）)HA–Ulk1蛋白（野生型或S317/777A突变型）从转染的HEK293细胞中免疫沉淀，在裂解前用葡萄糖或不加葡萄糖孵育细胞（4h）。安在体外在GST–ATG13和FIP200存在下进行激酶反应。斑点的未裁剪图像如所示补充图S5.

接下来，研究了Ser 317和Ser 777磷酸化在Ulk1激活中的功能意义。AMPK显著激活野生型Ulk1，但未激活激酶活性K46R突变体或磷酸化缺陷型S317/777A突变体在体外(图3e). S317/777A背景中单个AMPK共有位点的额外突变并未进一步显著降低Ulk1活性，这表明Ser 317和Ser 777是AMPK诱导Ulkl活化的主要位点(补充信息，图S2c). 与在体外实验数据，HA–Ulk1^S317/777A型在转染细胞中，葡萄糖饥饿对其激活程度最低，而野生型HA–Ulk1的激活效率更高(图3f). 总之，我们的数据证明了Ser 317/Ser 777磷酸化在葡萄糖饥饿诱导和AMPK依赖性Ulk1激活中的重要性。

mTORC1通过磷酸化Ulk1 Ser 757干扰Ulk1-AMPK相互作用

在酵母中，营养素饥饿促进ATG1–ATG13–ATG17复合物的形成，并伴随ATG1激酶的激活^16–17然而，类似的规定可能不适用于哺乳动物Ulk1，因为Ulkl复合物的形成不受营养物质的调节^22–23相反，我们观察到Ulk1和AMPK之间的相互作用(图4a). 缺失分析表明，S/T结构域，特别是Ulk1的片段（711–828），是结合AMPK（α、β和γ；图4a、b). 值得注意的是，AMPK结合域与ATG13-和FIP200-结合区（Ulk1、CTD的C末端域）不重叠。Ulk1-AMPK和Ulk1-ATG13-FIP200的相互作用不受葡萄糖饥饿的影响（数据未显示）。据报道，酵母TORC1破坏了ATG1复合物¹⁶，但mTORC1对Ulk1–mAtg13–FIP200复合物没有类似的影响^22–23有趣的是，我们发现Ulk1和AMPK之间的相互作用被mTORC1破坏。mTORC1激活剂Rheb的过度表达^44–45、减少Ulk1–AMPK联合免疫沉淀和雷帕霉素抑制Rheb的作用(图4c). 雷帕霉素治疗增加了内源性Ulk1和AMPK的相互作用(图4d). 考虑到mTORC1可以磷酸化Ulk1的报告，尽管磷酸化位点尚未确定^21，23，31，我们检测了mTORC1是否可以通过磷酸化Ulk1直接调节Ulk1-AMPK相互作用。免疫沉淀Ulk1与mTORC1孵育在体外然后用于下拉AMPK。mTORC1预培养显著降低了Ulk1下拉AMPK的能力(图4e). 这些数据表明，mTORC1通过直接磷酸化Ulk1抑制Ulk1-AMPK相互作用。

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图4

mTORC1干扰Ulk1–AMPK相互作用。(一)AMPK与Ulk1互动。将各种Flag–Ulk1缺失突变体与AMPKα/β/γ、Atg13和FIP200一起转染HEK293细胞。免疫沉淀Flag–Ulk1蛋白（用白色箭头表示），并用western blots检测AMPKα/β/γ、Atg13和FIP200的共同免疫沉淀。(b条)负责AMPK相互作用的Ulk1区域的缺失分析。所示Flag–Ulk1截断突变体是从共表达AMPK复合物（α/β/γ）的转染HEK293细胞免疫沉淀而来。通过western blots检测AMPK亚单位的共免疫沉淀。(c（c）)Rheb抑制Ulk1–AMPK相互作用。如图所示，将HA–AMPKα、Flag–Ulk1和Myc–Rheb联合转染到HEK293细胞中。细胞在裂解前用或不用雷帕霉素（50 nM Rapa）处理1小时。免疫沉淀Flag–Ulk1，western blot检测AMPKα共免疫沉淀。(d日)雷帕霉素处理增强内源性Ulk1和AMPK的相互作用。从Ulk1或AMPK野生型和敲除（单敲除；KO或双敲除；DKO）MEF中免疫沉淀内源性Ulkl蛋白。建议使用50 nM雷帕霉素治疗1小时（Rapa）。western blot检测内源性AMPKα蛋白的共免疫沉淀。箭头表示AMPKα蛋白。（e） mTORC1磷酸化抑制Ulk1结合AMPK的能力在体外如图所示，用链霉亲和素珠从转染的HEK293细胞中纯化CBP/SBP–Ulk1，并用猛禽免疫沉淀法制备的mTORC1在冷ATP存在下培养Ulk1-珠复合物。将产生的Ulk1复合物与含有AMPK的细胞裂解物孵育，然后广泛清洗。蛋白质印迹法检测Ulk1和相关的AMPKα。斑点的未裁剪图像如所示补充图S5.

为了了解mTORC1在Ulk1调控中的作用，我们努力确定Ulkl中的mTORC1-磷酸化位点。我们用mTORC1检测了各种Ulk1缺失的磷酸化在体外。如所示图5a，Ulk1 S/T结构域（残基279-828）被mTORC1磷酸化。由于mTORC1磷酸化残基651–1051在体外²³，我们假设mTORC1可能在残基651和828之间磷酸化Ulk1。值得注意的是，该区域包括AMPK相互作用所需的片段（711-828）。因此，我们检测了mTORC1对Ulk1片段（711–828）的磷酸化作用。Ulk1（711-828）被mTORC1磷酸化，但不被mTORC磷酸化(补充信息，图S3a). 进一步的缺失和诱变分析确定Ser 757为该片段中的mTORC1磷酸化位点(图5b). 使用磷酸化Ser 757的特异性抗体，我们发现当Rheb共同表达激活mTORC1时，Ser 757-磷酸化增加，雷帕霉素治疗抑制了Rheb的作用(图5c). 正如预期的那样，在Ulk1中未检测到这种磷酸化^S757A型突变体，证实抗体的特异性。我们一直观察到Rheb过度表达诱导了Ulk1迁移率的改变，并且这种改变在Ulkl中被消除^S757A型突变体(图5d)表明Ser 757是主要的mTORC1磷酸化位点体内试验。我们还将Ulk1的氨基末端区域映射为猛禽结合的重要结构域(补充信息，图S3b)，是mTORC1的底物重结晶亚单位⁴⁶为了进一步评估mTORC1在Ulk1磷酸化中的作用，我们检测了Tsc1型^−/−MEF，mTORC1活性升高⁴⁷内源性Ulk1 Ser 757的磷酸化在Tsc1型^−/−MEF，但仍被雷帕霉素抑制(图5e)，证实了Ulk1 Ser 757磷酸化对mTORC1活性的依赖性。此外，抑制mTORC1的葡萄糖饥饿降低了内源性Ser 757磷酸化(图5e). 葡萄糖饥饿导致的Ser 757磷酸化降低在Tsc1型^−/−MEF，与葡萄糖饥饿对mTORC1的低效抑制相一致坦桑尼亚先令突变细胞³⁸AMPK是抑制mTORC1以应对葡萄糖缺乏的必要条件^38–39一直以来，葡萄糖饥饿对降低AMPK DKO MEF中Ulk1 Ser 757磷酸化的效果较差(补充信息，图S3c)，进一步支持mTORC1在Ulk1 Ser 757磷酸化中的作用。

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图5

mTORC1在Ser 757磷酸化Ulk1。(一)mTORC1磷酸化Ulk1 S/T结构域。从转染的HEK293细胞制备Ulk1缺失突变体，用于在体外mTORC1分析。磷酸化通过³²通过western blot（底部）测定P-放射自显影图（顶部）和蛋白质水平。(b条)Ser 757被mTORC1磷酸化。左图：所示的重组GST–mUlk1突变体从大肠杆菌和用于在体外mTORC1分析作为底物。缺失分析分离出片段（753-771）作为mTORC1的靶点。Ulk1（753–771）片段包含五个保守的丝氨酸/苏氨酸残基，即Thr 754、Ser 757、Ser 760、Thr 763和Thr 770。右：Ser 757突变通过mTORC1消除了Ulk1磷酸化在体外GST作为mTORC1磷酸化反应的阴性对照。磷酸化测定方法³²P-放射自显影（顶部），而蛋白质水平通过考马斯染色检测（底部）。(c（c）)Rheb增加Ulk1 Ser 757磷酸化。从转染的HEK293细胞中免疫沉淀HA–Ulk1野生型和S757A突变体。提示联合转染Rheb和雷帕霉素（Rapa）治疗。western blot检测Ulk1 Ser 757磷酸化。(d日)Rheb在野生型Ulk1中诱导迁移，但在Ulkl中没有诱导迁移^S757A型突变体。将HA–Ulk1转染到HEK293细胞中，无论是否含有Rheb。在富含营养的培养基下，从细胞中免疫沉淀HA–Ulk1，并用western blot检测Ulkl的迁移率。(e（电子）)内源性Ulk1 Ser 757磷酸化在Tsc1型^−/−MEF公司。Tsc1型^+/+（重量）和Tsc1型^−/−（KO）MEF缺乏葡萄糖（4小时），或用50 nM雷帕霉素治疗（Rapa，1小时）。用磷酸化-Ulk1 Ser 757抗体检测内源性Ulk1的Ser757磷酸化。斑点的未裁剪图像如所示补充图S5.

接下来，我们确定了mTORC1依赖性磷酸化对Ulk1–AMPK相互作用的影响。Ulk1 Ser 757突变为天冬氨酸或丙氨酸，我们发现这两种突变都大大降低了Ulk1-AMPK相互作用(补充信息，图S3d). 这不仅仅是因为突变的整体结构改变，因为Ulk1^S757A仍然可以与Atg13和FIP200关联（未显示数据）。因此，我们推测该位置（羟基）的化学性质对AMPK相互作用至关重要。我们用结构上接近丝氨酸的半胱氨酸残基取代了Ser 757，并发现它与AMPK保留了一些相互作用，尽管较弱(补充信息，图S3d). 重要的是，S757C突变体和AMPK之间的相互作用不再受Rheb过度表达或雷帕霉素治疗的调节，如联合免疫沉淀法所确定的体内(图6a). 此外，在在体外下拉测定，由雷帕霉素处理的细胞制备的野生型Ulk1与AMPK的结合比由在营养丰富的条件下培养的细胞制备的Ulk1更强(图6b). 然而，在S757C突变体中没有观察到雷帕霉素增加Ulk1–AMPK相互作用的作用。这些数据表明，mTORC1对Ser 757的磷酸化对调节Ulk1–AMPK相互作用很重要。与此假设一致，两个AMPK位点Ser 317和Ser 777的磷酸化在Tsc1型^−/−MEF公司(图6c)或通过Rheb联合转染(图6d)这两种情况都会导致高mTORC1活性。如所示图6dAMPK位点Ser 317和Ser 777以及mTORC1位点Ser 757的磷酸化受激活或抑制AMPK和mTORC 1的条件的相互调节。葡萄糖饥饿降低了Ulk1 Ser 757磷酸化，但增加了Ser 317和Ser 777磷酸化。正如预期的那样，化合物C阻断了葡萄糖饥饿效应。相反，Rheb刺激了Ser 757磷酸化，但抑制了Ser 317和Ser 777磷酸化。这些效应被雷帕霉素逆转。此外，Rheb的过度表达抑制了葡萄糖饥饿诱导的Ulk1活化，GST–Atg13的自磷酸化和转磷酸化证明了这一点(图6e). 这些数据表明，mTORC1通过Ulk1 Ser 757的磷酸化破坏了Ulk1-AMPK之间的相互作用，从而阻止了AMPK激活Ulk1-。

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图6

mTORC1对Ulk1 Ser 757的磷酸化抑制Ulk1-AMPK相互作用。(一)mTORC1需要Ulk1 Ser 757来调节Ulkl与AMPK的相互作用体内CBP/SBP标记的Ulk1（野生型或S757C）与HA–AMPKα和Rheb共同转染到HEK293细胞中，如图所示。用链霉亲和素珠纯化Ulk1，并用western blot检测共沉淀的HA–AMPKα（Rapa，50 nM雷帕霉素处理1 h后细胞裂解）。(b条)雷帕霉素需要Ulk1 Ser 757来增强Ulk1-AMPK相互作用在体外CBP/SBP Ulk1蛋白（野生型或S757C）是从转染的HEK293细胞中制备的，如图所示，这些细胞预先与50 nM雷帕霉素（Rapa，1h）孵育。通过链霉亲和素珠纯化Ulk1蛋白，并将得到的Ulk1-珠与细菌纯化的AMPKα/β/γ复合物孵育。AMPKα蛋白水平在体外使用AMPKα抗体通过western blot检测下拉试验。有限责任公司。；长期接触。(c（c）)Ulk1中AMPK位点Ser 317和Ser 777的磷酸化在Tsc1型^−/−MEF公司。Tsc1型^+/+（重量）和Tsc1型^−/−（KO）MEFs缺乏葡萄糖（4小时），或用50nM雷帕霉素处理（Rapa，1小时）。用western blotting检测内源性Ulk1的Ser 317和Ser 777磷酸化的Ulkl抗体。(d日)Rheb以依赖于mTORC1的方式抑制Ulk1 Ser 317和Ser 777磷酸化。如图所示，将HA–Ulk1、AMPKα激酶突变体（DN）和Myc–Rheb联合转染到HEK293细胞中。用无葡萄糖培养基（−Glu，4 h）培养细胞，其中添加20µM化合物C（C.C.）或50 nM雷帕霉素（Rapa）。如图所示，用在317、777、757和HA上磷酸化的Ulk1抗体检测总细胞裂解物。(e（电子）)Rheb抑制葡萄糖饥饿诱导的Ulk1激活。将HA–Ulk1和Myc–Rheb转染到HEK293细胞中，在裂解前将其与无葡萄糖（−Glu）、无氨基酸（−A.A）培养基或50 nM雷帕霉素（Rapa）孵育4小时。对HA–Ulk1进行免疫沉淀，并进行激酶分析。Ulk1活性的测量方法为³²用western blot和考马斯氏染色分别测定P-放射自显影图和检测中使用的HA–Ulk1和GST–Atg13蛋白水平。斑点的未裁剪图像如所示补充图S5.

细胞培养、转染与病毒感染

HEK293细胞或HEK293T在含有10%胎牛血清（FBS；Invitrogen）和50µg ml⁻¹青霉素/链霉素。MEF在补充有β-巯基乙醇（Invitrogen）、1 mM丙酮酸和非必需氨基酸混合物（Invit罗gen）的DMEM培养基（完整培养基）中生长。用聚乙烯亚胺（PEI）进行转染，如下所述^三为了产生表达野生型或所示突变小鼠Ulk1蛋白的稳定细胞，用pQCXIH（Clontech）空载体或表达CBP（钙调蛋白结合肽）/SBP（链霉亲和素结合肽）的mUlkl构建物转染293个凤凰逆转录病毒包装细胞，进行逆转录病毒感染mUlk1蛋白的N末端。转染后（48小时），逆转录病毒上清液补充5µg ml⁻¹通过0.45-µm注射器过滤器过滤的聚brene，用于感染乌尔克1^−/−（Ulk1-KO）机械工程师。感染后（36 h），用0.2 mg ml⁻¹完整培养基中的潮霉素（Invitrogen）。为了在Ulk1-KO背景下建立Ulk2敲除稳定细胞，需要构建包含shRNA靶向小鼠的慢病毒构建物（pLKO.1-TRC系统，Addgene）Ulk2公司（2592–2612，正向寡核苷酸：5′-CCGGaacctgagctgacatctCGAGAG琼脂ttttt c-3′；反式寡核苷酸：5′-AATTGAAAAAAaaccctgagctgacatctCTCGAGAGAGATGTCACAGCTCAGGTT公司-3′; 小写字符和斜体字符分别是靶区的正反义序列），并与病毒包装质粒（psPAX2和pMD2.G）共同转染到HEK293T细胞中。病毒上清液通过0.45-µm过滤器过滤，并应用于Ulk1-KO MEF。在5µg ml的条件下获得稳定的池⁻¹嘌呤霉素（西格玛）。

蛋白质印迹和免疫沉淀

用轻度溶解缓冲液（MLB；10 mM Tris，pH 7.5，2 mM EDTA，100 mM NaCl，1%NP-40，50 mM NaF，1 mM Na_三VO（旁白）₄蛋白酶抑制剂鸡尾酒；罗氏）。这些细胞裂解物用于西方分析。对于免疫沉淀，所示抗体与TBST中1%牛血清白蛋白（BSA）中的蛋白G–Sepharose（Amersham bioscience）偶联（20 mM Tris，pH 8.0，170 mM NaCl和0.05%吐温-20）。将该免疫复合物添加到细胞裂解物中，并在4°C下孵育2 h。在分析之前，用MLB将所得珠清洗五次。

细胞死亡测定

根据制造商的说明，通过台盼蓝染色（Sigma，T8154）进行细胞计数来测定细胞活力。此外，用western blot检测凋亡标记蛋白poly-ADP核糖聚合酶（PARP）。凋亡指数由PARP蛋白裂解与非裂解的比率决定。在ImageJ软件上量化带强度(http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html).

蛋白质纯化和激酶分析

将含有指示基因的细菌表达构建物（pGEXKG）转化为大肠杆菌DH5α。在0.5 mM IPTG（异丙基β-d日-1-硫代吡喃半乳糖苷）。细胞在含有0.5%Triton X-100和2 mMβ-巯基乙醇的PBS中重新悬浮，然后进行超声处理。根据制造商的协议（Amersham Bioscience），使用谷胱甘肽珠通过一步纯化蛋白质。在pH 8.0和10%甘油的条件下，用20 mM Tris透析纯化的蛋白质。纯化的细菌GST–Ulk1蛋白（0.5µg）用作mTOR或AMPK分析的底物，以确定磷酸化位点。对于mTOR分析，从HEK293细胞制备mTORC1，其中Myc-mTOR和HA–Raptor被联合转染。用Raptor免疫沉淀mTORC1，通过添加过量的HA肽从珠中洗脱，然后用脱盐旋转柱脱盐。对于AMPK分析，使用10 ng纯化的AMPKα/β/γ复合物（细胞信号技术）。mTORC1（参考。4)和AMPK（参考。5)如前所述进行分析。GST–Ulk1蛋白的磷酸化由³²P-自动放射自显影。

体外Ulk1激酶测定

如图所示，用HA（Covance）或内源性Ulk1（Santa Cruz，N-17）抗体免疫沉淀Ulk1蛋白。免疫复合物用MLB（一次）和RIPA缓冲液（50 mM Tris，pH7.5，150 mM NaCl，50 mM NaF，1 mM EDTA，1 mM-EGTA，0.05%SDS，1%Triton X-100和0.5%脱氧胆酸盐）广泛洗涤两次，然后用含有20 mM HEPES的激酶分析缓冲液洗涤，pH7.4，1mM EGTA，0.4 mM EDTA,5 mM MgCl₂和0.05 mM DTT（二硫苏糖醇）。对于Ulk1自动磷酸化检测，免疫沉淀的Ulkl珠在含有10µM冷ATP和2µCi[γ-³²P] 每次反应的ATP。对于使用GST–ATG13和/或FIP200进行的激酶分析，从转染的HEK293细胞中对GST–ATA13进行细菌纯化，对HA–FIP200蛋白进行免疫纯化，并通过添加过量的HA肽（Sigma）进行洗脱。通过脱盐自旋柱（Pierce）去除HA肽。激酶反应在37°C下进行30分钟，并通过添加SDS样品缓冲液终止反应，并进行SDS–PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和放射自显影。

Lambda磷酸酶/AMPK治疗在体外

为了评估磷酸化对Ulk1激酶活性的影响，用lambda磷酸酶或AMPK对Ulk 1进行预培养在体外首先，细胞缺乏葡萄糖（4小时），然后如图所示免疫沉淀Ulk1（内源性Ulkl或HA标记的Ulk2）。将Ulk1免疫复合物与磷酸酶缓冲液中的5U lambda磷酸酶（细胞信号技术）或添加0.2 mM AMP和0.1 mM冷ATP的激酶分析缓冲液中5 ng纯化的AMPK（细胞信号科技）孵育15分钟。用RIPA缓冲液和激酶分析缓冲液对Ulk1结合珠进行广泛清洗，并通过离心回收。检测产生的Ulk1–珠的Ulk 1自动磷酸化和/或GST–ATG13磷酸化[³²P] ATP。为了排除残留AMPK或lambda磷酸酶污染可能影响Ulk1自动磷酸化（或GST-ATG13磷酸化）、激酶活性Ulkl（K46R）的自动磷酸化或³²分别检测P预标记GST-TSC2（TSC2片段1300-1367中Ser 1345的磷酸化）作为AMPK和lambda磷酸酶的对照。

体外下拉试验

如图所示，将CBP/SBP–Ulk1（野生型或S757C突变型）和Myc–Rheb联合转染到HEK293细胞中。用或不用50 nM雷帕霉素处理细胞1小时，然后用链霉亲和素珠纯化Ulk1蛋白。将得到的Ulk1–珠与细菌纯化的AMPKα/β/γ复合物孵育，并通过离心回收。用MLB广泛清洗珠子。对于在体外通过mTOR对Ulk1进行磷酸化，从转染的HEK293细胞中纯化CBP/SBP–Ulkl蛋白，将其与50 nM雷帕霉素孵育1 h，以去除Ulk 1上任何mTORC1诱导的磷酸化，然后在补充20µM冷ATP的激酶分析缓冲液中与mTORCl孵育30 min。Ulk1免疫复合物用RIPA缓冲液广泛清洗，并通过离心回收。将得到的Ulk1蛋白与100 ng细菌纯化的AMPKα/β/γ复合物或包括内源性AMPK复合物在内的总细胞裂解物在4°C下培养15分钟，然后进行MLB洗涤三次。通过添加SDS/样品缓冲液洗脱珠上的蛋白质，并使用Ulk1和AMPKα抗体进行SDS-PAGE和western blot。

GFP–LC3荧光分析

将稳定表达GFP–LC3的MEF镀在玻璃盖玻片上。第二天，在实验前用完整的培养基替换培养基4小时。葡萄糖饥饿4h诱导自噬。细胞用2%多聚甲醛固定20min，用PBS冲洗两次。细胞在共焦显微镜（蔡司LSM，×64 PlanAPO油透镜）下安装和可视化。为了量化GFP–LC3阳性自噬体，随机选择了五种不同的共聚焦显微镜图像，并在具有相同亮度和对比度设置的图像上检查GFP阳性点。显示五个以上强GFP阳性点的细胞被计数为GFP–LC3自噬体。通过DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）细胞核染色测定图像上的细胞总数。

我们感谢Guan实验室成员的讨论和试剂。我们要特别感谢I.Lian和C.Fang的技术援助，以及M.Farquhar、K.Kudicka和T.Meerloo在电子显微镜方面的帮助。这项工作得到了NIH拨款GM51586和GM62694（给K.-L.G.）的支持。