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.2009年5月1日；284(18):12297-305.
doi:10.1074/jbc。M900573200。 Epub 2009年3月3日。

ULK1.ATG13.FIP200复合物介导mTOR信号，对自噬至关重要

伊恩·甘利 1, 杜海林, 王俊如, 丁晓军, She Chen女士, 姜学军
附属公司

ULK1.ATG13.FIP200复合物介导mTOR信号，对自噬至关重要

伊恩·甘利等人。 生物化学杂志. .

摘要

自噬是一种降解过程，可回收寿命长且有缺陷的细胞成分。它与许多疾病有关，是正常发育所必需的。ULK1是一种哺乳动物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在自噬的初始阶段起着关键作用，但确切的分子机制尚不清楚。在这里，我们报告了一种新的蛋白质复合物的鉴定，该复合物包含ULK1和两个额外的蛋白质因子FIP200和ATG13，所有这些都是饥饿诱导自噬所必需的。FIP200和ATG13对于ULK1在自噬前体的正确定位和ULK1蛋白的稳定性至关重要。此外，我们通过细胞实验和体外从头重组反应证明，FIP200和ATG13可以单独增强ULK1激酶活性，但两者都是最大刺激所必需的。此外，我们发现ATG13和ULK1通过mTOR途径以营养缺乏调节的方式磷酸化，这表明ULK1.ATG13.FIP200复合体作为一个节点，将传入的自噬信号整合到自噬体生物发生中。

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数字

图1。
图1。
ATG13与ULK1和FIP200相互作用体内.A类，GFP-ATG13免疫沉淀。MEF细胞，耗尽RNAi显示的蛋白质通过逆转录病毒转导表达GFP-ATG13。在完全生长培养基或氨基中培养1小时后无酸介质(饿死)，细胞被裂解，GFP-ATG13使用小鼠抗GFP免疫沉淀。共免疫沉淀蛋白按指示进行免疫印迹分析。B类，ATG13的RNAi缺失。琼脂糖凝胶描绘ATG13和GAPDH mRNA的RT-PCR显示了控制缺失和两个ATG13缺失细胞克隆（13-4和13-5）。C类ULK1复合蛋白的丢失抑制了自噬。MEF细胞，耗尽所指示的蛋白质并表达GFP-LC3的细胞在完全培养基或无氨基酸培养基培养1h，然后裂解，SDS-PAGE和抗GFP免疫印迹检测GFP-LC3。D类，相同中描述的单元格C类生长在玻璃盖玻片上在完全培养基或无氨基酸培养基中培养1h以及在荧光显微镜下观察到的GFP-LC3。E类、ULK1、，ATG13和FIP200在自噬刺激时共定位。U2OS细胞，生长于用mCherry-ULK1和GFP-ATG13转染玻璃盖玻片(顶部面板)或GFP-ULK1和mCherry-FIP200(底部面板). 24小时转染后，将细胞清洗并在无氨基酸培养基中培养1小时，然后在荧光下固定和可视化显微镜。箭头请举例说明mCherry-ULK1和GFP-ATG13(顶部面板)或GFP-ULK1和m樱桃-FIP200(底部面板).
图2。
图2。
ULK1、ATG13和FIP200形成一个大蛋白复合物。 A类，ULK1与ATG13和FIP200相互作用。所示的等摩尔量重组蛋白(U型，ULK1；如果，FIP200；13，ATG13）在室温下一起孵育1小时ULK1与抗ULK1 IgG的沉淀。洗涤后，结合蛋白质用所示抗体进行免疫印迹。B类，ATG13与ULK1和FIP200相互作用。结合分析按照A类，但使用抗T7抗体沉淀T7标记的ATG13然后洗涤并用免疫印迹法分析结合蛋白。C类，ULK1、ATG13和FIP200形成一个大的蛋白质复合物。这个指示的蛋白质单独培养或在凝胶后混合培养在Superose 6色谱柱上过滤。所示馏分经过用相关抗体进行免疫印迹。凝胶过滤位置分子量标准(兆瓦)显示在顶部.
图3。
图3。
将ULK1定位到隔离膜需要ATG13和FIP200。 A类，ULK1在自噬时定位于隔离膜刺激。单独稳定表达GFP-ATG5的MEF细胞(顶部面板)或GFP-ATG5加上标记有FLAG-S的ULK1(底部面板)成长于玻璃盖玻片，然后在无氨基酸培养基中培养1小时，固定并进行免疫荧光处理。内源性成本ULK1型(红色)如所示顶部面板与GFP一起荧光(绿色)，同时用抗S标签染色（用于FLAG-S-ULK1）和GFP荧光显示在底部面板。B类，ULK1在ATG13和FIP200缺失细胞中的定位被破坏。左侧面板显示1h氨基酸保护的MEF细胞RNAi耗尽的蛋白质，用抗ULK1染色(绿色)和DAPI(蓝色，标记细胞核）。右侧面板显示相同的表达FLAG-S标记ULK1的衰竭MEF细胞，按照左边面板，但被防S标签污染(红色)检测标记的ULK1和DAPI(蓝色).
图4。
图4。
ATG13和ULK1刺激ULK1激酶活性。 A类，ATG13刺激ULK1激酶活性。10牛顿米重组ULK1是与指定量的重组FLAG-ATG13孵育0.3 mg/ml MBP和[γ-32P] ATP如下所述“实验程序”。通过添加SDS样品缓冲液，然后进行SDS-PAGE并转移至硝化纤维素。这个上部面板显示的是32P标记的MBP膜的Ponceau-S染色显示MBP总量如下所示。每个反应中ULK1和FLAG-ATG13的数量表示为免疫印迹下部面板。B类、ATG13和FIP200对刺激ULK1激酶活性。10牛顿米ULK1，200牛顿米FLAG-ATG13或200 n米hisFIP200单独或在如图所示，结合MBP和[γ-32P] ATP和按中的方式处理交流，ATG13中ULK1激酶活性受损FIP200耗尽的细胞。MEF细胞，对照、ATG13-或FIP200耗尽在完全培养基或无氨基酸培养基中孵育1小时，然后通过FIP200的裂解和免疫印迹(顶部面板)和ULK1(底部面板). 重复样品的蛋白质负荷如下所示Ponceau-S染色下部面板.
图5。
图5。
ULK1和ATG13受到mTOR介导的磷酸化作用。 A类，ULK1在自噬后保持部分磷酸化归纳。MEF细胞在无氨基酸培养基中培养(饿死)1h后进行裂解。然后用磷酸酶或模拟处理，然后用免疫印迹法分析流动性ULK1。B类，ATG13在自噬诱导后脱磷酸。来自稳定表达GFP-ATG13的MEF细胞的裂解液也经过处理或用磷酸酶模拟处理，然后进行SDS-PAGE和免疫印迹抗GFP。C类、ULK1和ATG13在自噬时脱磷酸归纳。表达GFP-ATG13的MEF细胞在完全培养基中孵育(控制)，含500n的介质米雷帕霉素(雷帕霉素)或无氨基酸介质(饿死)，后面是抗ULK1的裂解和免疫印迹(顶部面板)或抗GFP(底部面板). 样品一式两份。D类，百万TOR过度表达增加ATG13磷酸化。转染293T细胞单独或与Myc-tagged野生型结合使用类型(重量)或kinase-dead(死去的)mTOR，如图所示。24小时转染后的细胞在含有500牛顿米雷帕霉素或无氨基酸培养基(饿死)的1.5 h。然后裂解细胞，加载两份，并进行SDS-PAGE和抗Myc免疫印迹。
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