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细胞生物学杂志。2008年5月5日；181(3): 497–510.
数字对象标识：10.1083/jcb.200712064年10月10日
预防性维修识别码：下午2364867
PMID：18443221
第条

FIP200是一种ULK相互作用蛋白，是哺乳动物细胞自噬体形成所必需的

太极原野，1 高村明仁，1 Chieko Kishi先生，1 家村顺一，2 托鲁·夏目漱石，2 关俊林，三和Noboru水岛1,4
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补充资料

摘要

自噬是一种膜介导的细胞内降解系统。丝氨酸/苏氨酸激酶Atg1在自噬体形成中起重要作用。然而，哺乳动物Atg1同源物UNC-51样激酶（ULK）1和2的作用尚不清楚。我们发现，在饥饿条件下，小鼠ULK1和2定位于自噬隔离膜。ULK1和2的激酶缺失等位基因对自噬体的形成具有显性负效应，表明ULK激酶活性对自噬菌体的形成很重要。接下来，我们筛选了ULK结合蛋白，并确定了200 kD的黏着斑激酶家族相互作用蛋白（FIP200），该蛋白调节细胞大小、增殖和迁移等多种细胞功能。我们发现，在饥饿条件下，FIP200从细胞质重新分布到隔离膜。在FIP200缺乏的细胞中，各种处理均能消除自噬诱导，ULK1的稳定性和磷酸化均受损。这些结果表明，FIP200是一种新型哺乳动物自噬因子，与ULK一起发挥作用。

介绍

自噬是细胞质内容物定向到溶酶体降解的主要途径(Cuervo，2004年；莱文和克林斯基，2004年；Rubinsztein，2006年；水岛，2007年；水岛等人，2008年). 自噬有三种类型：宏观自噬、微观自噬和伴侣介导的自噬。其中，只有宏观自噬（以下简称自噬）是由自噬体介导的。在诱导自噬后，一个被称为隔离膜（也称为吞噬细胞）的膜池包裹部分细胞质以生成自噬体。自噬体随后与内体融合，最后与溶酶体融合，导致隔离在自噬体内的细胞质衍生物质降解。尽管在正常情况下自噬发生在低水平(Hara等人，2006年；小松等人，2006年)，自噬在饥饿条件下被广泛激活(水岛和克林斯基，2007年).

酵母的遗传分析揭示了自噬的分子机制(克林斯基，2005年；铃木和大树，2007年)其中31个自噬相关自动液位计到目前为止，基因已经被鉴定出来。在这些基因中，Atg1-10、12-14、16-18、29和31（统称为AP-Atg）是自噬体形成所必需的。在酵母中，自噬体是在液泡膜附近的一个特殊位置生成的，称为前自动吞噬体结构（PAS），在那里大多数AP-Atg蛋白被吸收(Kim等人，2001a；Suzuki等人，2001年；铃木和大树，2007年). 尽管自噬只需要这些AP-Atg蛋白，但一种称为细胞质-空泡靶向（Cvt）途径的自噬相关途径，从细胞质向空泡传递两种空泡酶，氨肽酶1和α-甘露糖苷酶1，几乎需要除Atg17、29和31外的所有Atg蛋白。

AP-Atg蛋白分为六个功能群：Atg1蛋白激酶复合物；Atg2–Atg18复合体；Atg8共轭体系；Atg12共轭体系；Atg14-磷脂酰肌醇3-激酶复合物；和Atg9(铃木等人，2007年). 在这些功能单元中，Atg1复合体有一个独特的特征：它显然接收到饥饿信号。Atg1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在营养素饥饿或雷帕霉素等自噬诱导治疗后，其激酶活性可以上调(Kamada等人，2000年). 尽管存在争议，但Atg1的激酶活性被认为是自噬所必需的(Kamada等人，2000年；Abeliovich等人，2003年；Kabeya等人，2005年；Cheong等人，2008年). Atg1复合体包括Atg13、Atg17(Kamada等人，2000年)，日期29(Kawamata等人，2008年)，附件31/Cis1(Kabeya等人，2007年)，附件11/Cvt9(Kim等人，2001b)，附件24/Cvt13(尼斯等人，2002年)，Atg20/Cvt20(尼斯等人，2002年)和Vac8(Scott等人，2000年). 附件17(Kamada等人，2000年), 29 (Kawamata等人，2005年)、和31(Kabeya等人，2007年)具体参与自噬，而Atg11、Atg20、Atg24和Vac8是Cvt途径所需的。Atg13和1参与两种途径。最近的一项系统分析表明，Atg17和11对PAS组织至关重要，并且Atg17被认为是一种支架蛋白(铃木等人，2007年). Atg1–Atg17交互在很大程度上取决于Atg13(Cheong等人，2005年；Kabeya等人，2005年)，但酵母双杂交分析表明，Atg1和17也可以直接相互作用(Cheong等人，2005年). 饥饿处理增强了Atg13、1和17之间的相互作用，并且Atg13和17对正确调节Atg1激酶活性都很重要(Kamada等人，2000年；Kabeya等人，2005年).

Atg17–Atg13–Atg1复合体的功能尚未完全理解。虽然Atg1和13能够感知营养状况，但这种复合物似乎并不能作为饥饿信号的简单传感器。例如，Atg1是微噬菌后期所必需的毕赤酵母(Mukaiyama等人，2002年)以及Cvt途径，这是在富含营养的条件下进行的组成生物合成途径(Kamada等人，2000年；Abeliovich等人，2003年). 此外，已知Atg1对于从PAS检索Atg9和23很重要(Reggiori等人，2004年).

在其他物种中也发现了Atg1的同源物，如盘状网柄菌(Otto等人，2004年),秀丽隐杆线虫(Ogura等人，1994年；Melendez等人，2003年),黑腹果蝇(Scott等人，2004年),拟南芥(Hanaoka等人，2002年)和哺乳动物(Yan等人，1998年，1999). 迄今为止所检测物种中的Atg1突变确实表现出自噬缺陷表型(Melendez等人，2003年；Otto等人，2004年；Scott等人，2004年；Chan等人，2007年).

然而，在后生动物中，Atg1的作用似乎并不局限于大型自噬。秀丽隐杆线虫Atg1被称为UNC（非协调运动）-51。这个unc-51号机组突变体表现出神经异常，如瘫痪和轴突伸长缺陷(Ogura等人，1994年). 在哺乳动物中，已经报道了两种Atg1同源物：UNC-51样激酶（ULK）1（也称为Unc51.1；Yan等人，1998年；Tomoda等人，1999年)和ULK2（也称为Unc51.2；Tomoda等人，1999年；Yan等人，1999年). RNAi介导的仅抑制ULK1表达足以抑制自噬(Chan等人，2007年)mAtg9从TGN重新分布到内体(Young等人，2006年). 除了自噬表型外，ULK1的一种显性负性形式K46R抑制小脑颗粒神经元的轴突延伸(Tomoda等人，1999年)，这与unc-51号机组蠕虫。

Atg1是一种多功能蛋白的观察结果表明，Atg1应该与几个不同的伙伴协同作用。的确，秀丽隐杆线虫UNC-51与UNC-14相互作用，UNC-14是一种参与协调运动的蛋白质(Ogura等人，1997年). 在哺乳动物中，ULK1与Ras的负调控因子SynGAP和Rab5相互作用蛋白Syntenin相互作用(Tomoda等人，2004年). 这些相互作用被认为对轴突引导/延伸很重要。另一篇最近的论文也表明，ULK1通过p62被招募到TrkA–NGF受体复合物中，并调节生长锥中非网格蛋白包被的内吞作用、丝状伪足延伸和分支(Zhou等人，2007年). 然而，酵母Atg1相互作用的自噬蛋白的同源物在高等真核生物中还没有报道（除了植物Atg13；Hanaoka等人，2002年).

为了更好地理解Atg1/ULK家族的作用，我们筛选了ULK相互作用蛋白，并鉴定了200 kD的FAK家族相互作用蛋白（FIP200），也被称为RB1CC1（视网膜母细胞瘤1-诱导型卷曲线圈1）。据报道，FIP200与包括FAK在内的多种蛋白质相互作用(Abbi等人，2002年)，派克2(Ueda等人，2000年)、TSC1(Gan等人，2005年)，p53(Melkoumian等人，2005年)、ASK1和TRAF2(Gan等人，2006年)从而调节多种细胞功能，如细胞迁移、增殖、细胞大小和凋亡。FIP200也被独立鉴定为RB1的新诱导剂。我们发现ULK1、ULK2和FIP200存在于自噬隔离膜上。使用FIP200型−/−小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），我们发现FIP200是一种新型哺乳动物自噬因子，与ULK一起发挥作用。

结果

ULK1和ULK2定位在隔离膜上（吞噬体）

我们在小鼠数据库中发现了四个ULK同源物。虽然ULK1和2与秀丽隐杆线虫UNC51、ULK3和4仅在激酶结构域中与UNC51相似（图S1，可在http://jcb.org/cgi/content/full/jcb.200712064/DC1). 因此，我们分析了ULK1和2在自噬体形成中的作用。我们首先使用在N末端（GFP-ULK1和GFP-ULK2）稳定表达ULKs与GFP融合的NIH3T3细胞测定ULK1与2的亚细胞分布。在营养丰富的条件下，GFP-ULK1和GFP-ULK2主要均匀分布在细胞质中，很少有点状分布(图1、A和B，完成）。我们偶尔在一些细胞的皱褶膜上观察到GFP-ULK1和-ULK2（图S2）。在氨基酸和血清饥饿后，GFP-ULK1和-ULK2定位于间断结构(图1、A和B、饥饿）。补充营养液后，这些间断结构立即消失(图1、A和B、饥饿→完成）。如前所述(Chan等人，2007年)这些数据表明ULK1和2是针对自噬相关结构的。然后我们更详细地检查了GFP-ULK的定位，发现ULK1和2几乎完全与内源性Atg16L1共定位(图1、C和D). 因为Atg16L1和Atg12–Atg5结合物特别定位于伸长的隔离膜（也称为吞噬细胞；水岛等人，2001年)这些数据表明ULK1和2都是针对隔离膜的。

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ULK1和2在饥饿条件下定位于分离膜（吞噬体）。（A和B）将稳定表达GFP-ULK1（A）和-ULK2（B）的NIH3T3细胞在完全培养基或饥饿培养基中培养30分钟。然后将其在新鲜完全培养基中再培养30分钟（饥饿→完成）。将稳定表达GFP-ULK1（C）和-ULK2（D）的（C和D）NIH3T3细胞在饥饿培养基中培养120分钟。固定、渗透细胞，并使用抗Atg16L1抗体和Alexa Fluor 660结合二级抗体进行免疫荧光显微镜检查。90%以上的GFP-ULKs点对Atg16L1呈阳性。（E–H）野生型（E和G）和附件5−/−用编码GFP-ULK1和-ULK2的逆转录病毒载体转染（F和H）MEF。稳定表达GFP-ULK1（E和F）和-ULK2（G和H）的MEF在完全培养基或饥饿培养基中培养120分钟。固定细胞并用荧光显微镜检查。棒材，20μm。

在酵母中，Atg1独立于Atg5定位于PAS(铃木等人，2007年). 虽然不清楚哺乳动物细胞是否具有类似的PAS，但我们检查了ULK的点状结构是否独立于Atg5。野生型和附件5−/−用编码GFP-ULK1的逆转录病毒载体转染MEF(图1、E和F)和-ULK2(图1、G和H)饥饿后观察。虽然GFP-ULK1和-ULK2穿孔都是在野生型MEF中形成的(图1、E和G)，这些圆点在附件5−/−MEF公司(图1、F和H). 这些结果表明，哺乳动物细胞中ULK点的形成依赖于Atg5。

激酶头ULK突变体抑制自噬

在酵母中，Atg1激酶活性在氮饥饿或Tor失活诱导的自噬过程中上调(Kamada等人，2000年). 然而，尚不清楚哺乳动物细胞中是否存在这种情况。因此，我们测定了在营养丰富和饥饿条件下MEF中的ULK激酶活性。用抗ULK1抗体沉淀内源性ULK1，并用髓磷脂碱性蛋白作为模型底物，通过体外激酶分析产生的免疫沉淀。与营养丰富的条件相比，饥饿条件下的ULK1激酶活性水平增加了1.3倍(图2 A). 尽管这种变化不大，但这些数据表明，ULK1激酶活性的增加可能对诱导自噬体的形成很重要。

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激酶头ULK突变体抑制自噬。（A） 内源性ULK1的体外激酶测定。MEF在完全培养基或饥饿培养基中培养60分钟。按照材料和方法中的描述测定ULK1激酶活性。显示了相对激酶活性。数据是五个独立实验的平均值±SE。（B和C）NIH3T3细胞瞬时转染HA-ULK1、HA-ULK2、，或其激酶缺失突变体，并使用单克隆抗HA和多克隆抗Atg16L1抗体进行初级染色，使用Alexa Fluor 488结合的山羊抗小鼠IgG和Alexa Fuor 568结合的羊抗兔IgG抗体进行二级抗体免疫荧光显微镜检查。转染细胞用箭头表示。棒材，20μm。（D） 稳定表达GFP-ULK1的NIH3T3细胞K46N和GFP-ULK2K39吨在饥饿培养基中培养120分钟。使用抗Atg16L1抗体对细胞进行免疫荧光显微镜检查。棒材，20μm。（E） 用编码HA-ULK1的逆转录病毒载体转染NIH 3T3细胞K46N公司或与相应的空逆转录病毒（mock）结合。将其在完全培养基或饥饿培养基中培养120分钟。然后用所示抗体通过免疫印迹分析对细胞裂解物进行分析。

接下来，我们使用ULK激酶死亡突变体研究了ULK激酶活性的重要性。激酶ead Atg1突变体的过度表达抑制自噬D.盘状体(Tekinay等人，2006年)和D.黑腹果蝇(Scott等人，2007年)而野生型Atg1的过度表达会加速自噬D.黑腹果蝇(Scott等人，2007年). 然而，在哺乳动物细胞中，根据LC3转化分析判断，野生型和激酶缺失ULK1均抑制自噬(Chan等人，2007年). 因此，我们仔细研究了ULK1和2的野生型和激酶缺失突变体对Atg16L1点形成的影响。在瞬时转染实验中，激酶头HA-ULK1的适度表达K46N公司(Yan等人，1998年)和HA-ULK2K39吨(Yan等人，1999年)有效抑制饥饿诱导的Atg16L1穿孔形成(图2 C)而野生型ULK1和2几乎没有效果(图2 B; 注意，HA-ULK点不像稳定转化体中的点那么清晰[图1]由于高细胞质信号引起的过度表达）。相反，当在较高水平上过度表达时，野生型和激酶ead ULK都抑制了Atg16L1点的形成（未公布的数据）。野生型ULK过度表达细胞的形状异常（图S3，可在http://jcb.org/cgi/content/full/jcb.200712064/DC1)，如之前所示Chan等人（2007）细胞产生突起，最后从培养皿上脱落，这与之前的结果一致D.黑腹果蝇Atg1过度表达导致凋亡细胞死亡(Scott等人，2007年). 然而，在过表达激酶死亡的ULK1和2的细胞中没有观察到这些异常（图S3）。因此，野生型和激酶死亡的ULK的过表达的影响是不同的。激酶头突变体确实作为显性阴性突变体发挥作用，而野生型过度表达可能通过其他机制引起细胞毒性。总之，这些数据表明激酶活性对ULK参与自噬很重要。

我们还生成了稳定表达GFP-ULK1的NIH3T3细胞K46N公司和GFP-ULK2K39吨尽管Atg16L1和GFP-ULKs在饥饿后在野生型NIH3T3细胞中形成点状，但在稳定表达GFP-ULK1的NIH3T3细胞中很少观察到这些点状K46N公司或GFP-ULK2K39吨(图2 D)证实了激酶头ULKs在自噬体形成中作为显性阴性突变体发挥作用。

接下来，我们通过LC3转化试验测量了这种影响。细胞溶质LC3（LC3-I）在自噬过程中转化为膜结合磷脂酰乙醇胺（PE）-共轭LC3（LC3-II），LC3-II的数量与自噬体的数量相关(Kabeya等人，2000年). 在稳定表达ULK1的NIH3T3细胞中，饥饿期间的LC3转化被显著抑制K46N公司(图2 E)，据最近报道Chan等人（2007）进行另一项检测以监测自噬通量。因为p62（SQSTM1/隔离体1）可以结合LC3，所以p62优先并入自噬体并通过自噬降解(Björkoy等人，2005年；水岛和吉森，2007年). 因此，p62的量可以作为自噬活动的良好指标。ULK1中p62的基础水平上调K46N公司-转染细胞与模拟转染细胞的比较。尽管模拟转染细胞的p62水平在饥饿期间下降，但ULK1的下降受到适度抑制K46N公司-转染细胞。这些数据表明，激酶头ULK的表达减弱了自噬通量。

FIP200作为ULK相互作用蛋白的鉴定

在酵母中，Atg1与包括Atg13和17在内的多种蛋白质形成复合物。然而，在哺乳动物中报告了一组不同的ULK相互作用蛋白，包括GABARAP、GATE-16(Okazaki等人，2000年)、SynGAP和Syntenin(Tomoda等人，2004年)但不是其他Atg同源物。为了更好地理解ULK的作用，我们寻找了额外的ULK相互作用蛋白。小鼠ULK1-FLAG和FLAG-ULK2在HEK293细胞中表达，并用抗FLAG抗体免疫沉淀。我们通过高灵敏度直接纳米流液相色谱/串联质谱分析了免疫沉淀物(夏目漱石等人，2002年)并在ULK1和2沉淀中鉴定出FIP200，也称为RB1CC1。我们使用共表达FLAG-FIP200和HA-ULK1或-ULK2的HEK293T细胞进行免疫沉淀分析，确认FIP200与ULK1和2的相互作用(图3 A). 此外，我们生成了针对FIP200的抗体，并检测了野生型MEF中内源性ULK1和FIP200之间的相互作用(图3 B). 如果我们使用第200页−/−MEF公司。ULK1和FIP200之间的相互作用不受营养条件的影响，这表明ULK1与FIP200在营养丰富和饥饿条件下相互作用(图3 B).

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ULK1与FIP200相互作用。（A） 用FLAG-FIP200和HA-ULK联合转染HEK293T细胞。使用FLAG抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀（IP）。用所示抗体通过免疫印迹（IB）分析检测产生的沉淀物。星号表示非特定波段。（B） MEF的裂解物用抗ULK1或抗FIP200抗体或免疫前兔血清进行免疫沉淀，所得沉淀用针对ULK1和FIP200的抗体进行免疫印迹分析。（C） D.（D）HEK293T细胞中使用的ULK1突变体的示意图表示与FLAG-FIP200和各种ULK1变异体共同转染，并使用抗HA和抗FLAG抗体进行分析。（E） 稳定表达GFP-ULK1（左）和GFP-ULK1的NIH3T3细胞ΔC（右）在饥饿培养基中培养120分钟。Bar，20μm。

接下来，我们使用几个ULK1突变体确定与FIP200相互作用需要ULK1的哪个区域(图3 C). 尽管kinase-dead ULK1K46N公司可以与FIP200，C末端缺失突变体（ULK1）相互作用1–427和ULK11–828)无法(图3 D). C末端缺失突变体ULK11–828也无法累积到标点符号(图3E). 因此，ULK1的C末端区域（829–1051 aa）对于ULK-FIP200相互作用和puncta形成都是必需的。

FIP200定位于隔离膜

FIP200，一种广泛表达的蛋白质(Bamba等人，2004年)最初被鉴定为Pyk2（富含脯氨酸的酪氨酸激酶2）相互作用蛋白(Ueda等人，2000年). FIP200结合抑制Pyk2激酶活性，从而抑制Pyk2诱导的细胞凋亡。FIP200还将FAK作为负调节因子(Abbi等人，2002年). 此外，FIP200与多种蛋白质如TSC1相互作用(Gan等人，2005年)，p53(Melkoumian等人，2005年)、ASK1和TRAF2(Gan等人，2006年). FIP200还诱导RB1表达(Chano等人，2002a). 因此，FIP200是一种多功能蛋白，参与细胞迁移、增殖、细胞大小调节、细胞死亡和肿瘤抑制。然而，其参与自噬或膜贩运的情况尚未见报道。

为了研究FIP200在自噬体形成中的功能相关性，我们首先检测了FIP200的亚细胞定位。FIP200以前曾被报道定位于细胞核(Chano等人，2002a)，细胞质(Ueda等人，2000年)和细胞外围的焦点接触(Abbi等人，2002年). 当我们观察到NIH3T3细胞在营养丰富的条件下转染编码GFP融合FIP200的逆转录病毒载体时，大多数GFP信号在细胞质中弥漫检测到，只有少数点状点(图4 A). 然而，在氨基酸和血清饥饿后，这些点的数量增加了。这些GFP-FIP200阳性点几乎与Atg16L1完全共定位(图4 B). 此外，我们观察到GFP-ULK1和内源性FIP200之间几乎完全共定位(图4C). 所有这些数据表明，FIP200定位于与ULK一起伸长的隔离膜。

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饥饿处理后FIP200定位于吞噬细胞。（A） 将稳定表达GFP-FIP200的NIH3T3细胞在完全培养基或饥饿培养基中培养120分钟，观察GFP信号。（B） 稳定表达GFP-FIP200的NIH3T3细胞在饥饿培养基中培养120分钟，然后使用抗Atg16L1抗体和Alexa Fluor 568结合二级抗体进行免疫荧光显微镜检查。棒材，20μm。90%以上的GFP-FIP200点对Atg16L1呈阳性。（C） 将稳定表达GFP-ULK1的NIH3T3细胞饥饿120分钟，然后使用抗FIP200抗体和Alexa Fluor 568结合二级抗体进行免疫荧光显微镜检查。黑色方块表示插图中显示的放大区域。棒材，20μm。

自噬需要FIP200

FIP200的分离膜定位促使我们进一步研究其在自噬中的作用。已知FIP200对胚胎发育至关重要。FIP200型−/−由于心脏和肝脏发育缺陷，小鼠在胚胎期（E）13.5至16.5天出现胚胎致死(Gan等人，2006年). 因此，我们检测了来源于FIP200型−/−胚胎。在野生型MEF中，1小时的氨基酸和血清饥饿诱导LC3转化，而在添加10%FCS的完整二甲醚中再培养1小时可恢复LC3转化(图5 A). 相反，饥饿诱导的LC3转化在年几乎完全被废除FIP200型−/−MEF公司。此外，p62在FIP200型−/−MEFs，表明在没有FIP200的情况下自噬被严重抑制。然而，应注意的是，在FIP200型−/−MEF与营养状况无关。这种表型与附件5−/−MEF中从未检测到LC3-II(图5 A). 这些结果表明，低水平的自噬组成性地发生在FIP200型−/−MEF或LC3转换独立于自噬发生。

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FIP200是自噬所必需的。（A）FIP200型+/+，FIP200型−/−，附件5+/+、和附件5−/−MEF在完全培养基或饥饿培养基中培养60分钟。在恢复实验中，饥饿的MEF在新鲜完全培养基中再培养60分钟（补充）。用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析。（B） 野生型和FIP200型−/−MEF在完全培养基或饥饿培养基中培养指定时间，添加或不添加100 nM巴非霉素A1用抗LC3抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析。（C） 野生型和FIP200型−/−用编码GFP-Atg5或GFP-LC3的逆转录病毒载体转染MEF。结果细胞在饥饿培养基中培养120分钟。细胞固定并通过荧光显微镜检查。棒材，20μm。（D–G）野生型（D和E）和FIP200型−/−（F和G）MEF在完全培养基（D和F）或饥饿培养基（E和G）中培养120分钟，然后固定并进行EM分析。图示为自噬体样结构（开放箭头）和自溶体（闭合箭头）。棒材，1μm。（H） 通过形态计量分析测定D-G细胞自噬体（AP）和自溶体（AL）的总面积与总细胞质面积的比值。

监测自噬能力第200页−/−更准确地说，我们通过LC3周转测定法确定了这些细胞中的自噬流量(Tanida等人，2005年；水岛和吉森，2007年). 因为LC3-II存在于自噬体的内外膜上，所以LC3-II在自噬体液溶体融合后自身降解。如果自噬体-溶酶体融合被液泡H阻断+ATP酶抑制剂巴非霉素A1(山本等人，1998年)，应该抑制LC3-II的自噬降解。这种处理确实导致了2小时和4小时饥饿野生型MEF中LC3-II的积累(图5 B). 然而，巴非霉素A的这种作用1在中未观察到FIP200型−/−即使在饥饿4小时后，MEF也显示这些细胞中的自噬降解几乎完全被抑制。

我们还检测了野生型和FIP200型−/−通过监测细胞溶质GFP-Atg5和GFP-LC3在膜结构中的再分配，MEF稳定表达GFP-Atg 5（隔离膜标记物）或GFP-LC3（自噬体标记物）。在缺乏氨基酸和血清的培养基中培养2小时后，在野生型MEF中观察到几个GFP-Atg5和GFP-LC3点(图5 C，左）。在FIP200型−/−然而，这些GFP-Atg5阳性点完全缺失(图5 C，右侧，顶部）。GFP-LC3点的数量大大减少，但在FIP200型−/−单元格(图5 C，右侧，底部）。然而，这些圆点形状不规则，饥饿处理后其数量没有变化（未公布的数据）。因此，这些结构可能代表由FIP200缺乏引起的GFP-LC3蛋白的一些异常结构或聚集。为了进一步证实FIP200缺失对自噬体形成的影响，我们进行了EM分析。在饥饿2小时后的野生型MEF中，我们可以检测到许多自噬空泡，它们占据了总细胞质体积的～3%（～2%的自噬体和～1%的自溶体；图5、D、E和H). 相反，自噬体样结构在FIP200型−/−即使在氨基酸和血清饥饿条件下，MEF(图5、F、G和H). 这些结果表明FIP200是自噬体形成所必需的。

FIP200在自噬中的作用与FAK无关

FIP200可以结合FAK并抑制FAK的功能。FAK是一种局灶性黏附成分，包括多种蛋白质，如vinculin、paxillin和talin(卡拉格和弗雷姆，2004年). 此外，当我们准备这份手稿时，据报道帕西林也起到了调节自噬的作用(Chen等人，2007年). 在此基础上，我们研究了FAK在自噬中的潜在作用FAK（传真）−/−MEF公司(伊利奇等人，1995年). 据我们测试，FAK（传真）−/−MEF显示无与自噬相关的异常。含或不含巴非霉素A的饥饿诱导LC3转化1饥饿诱导的p62在溶酶体中降解是正常的(图6 A). 饥饿诱导的GFP-LC3点形成在FAK（传真）+/−和FAK（传真）−/−MEF公司(图6 B). 此外，GFP融合的FAK定位于局灶性粘连，但不定位于Atg16L1阳性自噬相关结构(图6 C). 这些结果表明FAK不参与自噬，FIP200在自噬中的作用独立于FAK。

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自噬不需要FAK。（A）FAK（传真）+/−和FAK（传真）−/−MEF在完全培养基或饥饿培养基中培养指定时间，添加或不添加100 nM巴非霉素A1用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析。（B）FAK（传真）+/−和FAK（传真）−/−稳定表达GFP-LC3的MEF在完全培养基或饥饿培养基中培养120分钟。固定细胞并用荧光显微镜检查。（C） 稳定表达GFP-FAK的野生型MEF在完全培养基或饥饿培养基中培养120分钟。固定细胞并使用抗Atg16抗体进行免疫荧光显微镜检查。黑色方块表示插图中显示的放大区域。棒材，20μm。

FIP200在哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）下游的自噬体形成中发挥作用

FIP200与TSC1相互作用并抑制其功能(Gan等人，2005年). TSC1-TSC2异二聚体通过Rheb失活抑制mTOR功能(Inoki和Guan，2006年；Wullschleger等人，2006年；Guertin和Sabatini，2007年). 自噬受mTOR信号负调控(Meijer和Codogno，2004年)，我们研究了自噬缺陷FIP200型−/−MEF是TSC-mTOR信号异常的结果。如果是这种情况，则应用mTOR抑制剂雷帕霉素治疗可诱导自噬。在野生型MEFs中，雷帕霉素在巴非霉素A不存在和存在的情况下诱导LC3转化1然而，雷帕霉素诱导的LC3转化在FIP200型−/−MEF公司(图7 A). 我们还观察到雷帕霉素能够在野生型MEF中诱导GFP-Atg5和GFP-LC3斑点形成，但在FIP200型−/−MEF公司(图7 B). 此外，mTOR在FIP200型−/−血清和氨基酸饥饿后的MEF，根据4E-BP1去磷酸化判断，尽管自噬受到抑制(图5 A). 总的来说，这些数据表明自噬体形成的缺陷FIP200型−/−MEF是由mTOR下游FIP200功能丧失引起的，而不是由包括TSC复合物在内的异常营养信号传导引起的。

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FIP200在自噬体形成中发挥mTOR下游的作用。（A） 野生型和FIP200型−/−在存在或不存在100 nM巴非霉素A的情况下，用100 ng/ml雷帕霉素（rapa）或载体（DMSO）处理MEF 120分钟1用抗LC3抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析。（B） 野生型和FIP200型−/−稳定表达GFP-Atg5或GFP-LC3的MEF在100 ng/ml雷帕霉素存在下培养120 min。荧光显微镜检查GFP-Atg 5（顶部）和GFP-LC2（底部）点状物的形成。棒材，20μm。（C） 野生型和FIP200型−/−MEF用10 mM氯化锂处理24小时或100μM C2-神经酰胺2小时。

FIP200型−/−MEF对各种自噬诱导试剂（如氯化锂）也有抵抗力(Sarkar等人，2005年)和神经酰胺(图7 C；Scarlatti等人，2004年). 因为锂的作用与mTOR无关(Sarkar等人，2005年)，FIP200应在mTOR依赖性和独立性自噬中发挥作用。

FIP200是ULK斑点形成所必需的，对ULK的稳定性和正确磷酸化很重要

鉴于FIP200与ULK1和2相互作用，我们假设ULK和FIP200一起起作用。我们首先检测了野生型和FIP200型−/−MEF公司。正如我们在图1，GFP-ULK点状物在饥饿期间在野生型MEF中形成。这些点代表隔离膜(图8 A，左）。然而，这些圆点在FIP200型−/−MEF，表明ULK1和2的点状形成依赖于FIP200(图8 A，右侧）。然而，这一观察结果可能仅仅反映了在缺乏FIP200的情况下隔离膜形成的损害，因为即使GFP-Atg5斑点形成在FIP200型−/−MEF公司(图5 C). 为了探索ULK和FIP200之间更直接的功能联系，我们接下来检查了ULK1在野生型和FIP200型−/−MEF公司。ULK1的表达水平FIP200型−/−在两种营养丰富的情况下，MEF都远低于野生型MEF(图8 B)以及饥饿（未描述）情况。饥饿后ULK1 mRNA表达增强，但野生型和野生型之间没有差异FIP200型−/−电池（图S4 A，可从http://jcb.org/cgi/content/full/jcb.200712064/DC1). 然而，我们观察到ULK1蛋白在FIP200型−/−经环己酰亚胺处理后的细胞，表明在没有FIP200的情况下ULK1不稳定（图S4 B）。此外，我们发现，ULK1被检测为一条涂抹带，在FIP200型−/−MEF公司。如前所述(Yan等人，1998年，1999），我们观察到ULK1的流动性K46N比野生型ULK1更快，这表明ULK1是自磷酸化的(图3 D). 与此一致，当我们用λ磷酸酶处理野生型细胞的ULK1免疫沉淀时，ULK1迁移到较低的位置，该位置在磷酸酶抑制剂的存在下受到抑制，证实ULK1被磷酸化(图8 C). 同样，ULK1的磷酸酶处理FIP200型−/−细胞裂解物产生具有相同迁移率的条带(图8 C，对比车道2和5），表明内源性ULK1在FIP200型−/−MEFs代表磷酸化减少，而不是蛋白质加工等其他修饰。因此，FIP200可能对维持ULK1激酶活性很重要。所有这些结果表明，FIP200和ULK1在功能上是相连的，并且这种复合物在自噬体的形成中起着重要作用。

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膜靶向和ULK的正常功能需要FIP200。（A）FIP200型+/−和FIP200型−/−稳定表达GFP-ULK1或-ULK2的MEF在饥饿培养基中培养120分钟。固定细胞并用荧光显微镜检查。棒材，20μm。（B）FIP200型+/+和FIP200型−/−MEF在完全培养基中培养。用ULK1或HSP90抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析（负荷控制）。（C） ULK1的磷酸酶敏感性。FIP200型+/+和FIP200型−/−MEF在完全培养基中培养。从细胞裂解物中免疫沉淀ULK1，并在30°C下用λ磷酸酶处理30分钟，不存在或存在磷酸酶抑制剂（1 mM Na2VO（旁白）4，50 mM KF，15 mM Na4P（P）2O（运行）7和1 mM EGTA）。

讨论

我们已经鉴定出一种新的ULK相互作用蛋白FIP200，并证明ULK1、ULK2和FIP200定位于隔离膜。由于FIP200缺陷细胞几乎没有自噬体，我们认为ULK–FIP200复合体对于自噬小体形成的早期步骤，而不是后期或完成步骤至关重要。

酵母Atg1与哺乳动物ULK自噬途径的比较

虽然酵母Atg1和哺乳动物ULK具有几个共同特征，但也存在一些差异。一个不同之处是，尽管这两种蛋白都以自噬结构为靶点，但精确定位可能并不相同。已知酵母Atg1定位于PAS(铃木等人，2007年). 然而，因为Atg1被输送到液泡(Suzuki等人，2001年)它应该存在于自噬体的内膜上或捕获在自噬体内。相反，我们仅在分离膜上检测到ULK1和2，这表明ULK1与2主要与自噬体的外膜有关，如Atg12–Atg5结合物(水岛等人，2001年). 因此，ULK1和FIP200在溶酶体中都没有降解，因为这些蛋白质的表达水平在巴非霉素A1处理后没有改变（图S5，可在http://jcb.org/cgi/content/full/jcb.200712064/DC1).

另一个区别是Atg1/ULK点形成的Atg5依赖性。虽然酵母Atg1的PAS靶向性并不依赖于Atg5(铃木等人，2007年)，ULK1和2的点状形成依赖于哺乳动物细胞中的Atg5(图1). 酵母和哺乳动物Atg1/ULK之间这种明显差异的一个可能解释是，哺乳动物细胞中看不到PAS等效结构，并且Atg1/ULK在酵母和哺乳动物中定位到隔离膜应依赖于Atg5。解剖酵母中的PAS和隔离膜可以澄清这个问题。

在本研究中，我们没有观察到ULK1和2之间的任何差异，尽管据报道ULK2对自噬是可有可无的(Young等人，2006年；Chan等人，2007年). 因此，ULK2的功能尚不清楚。需要检查内源性ULK2。

FIP200，酵母Atg17的可能对应物？

先前的研究表明，FIP200与TSC1相互作用，在用FIP200 siRNA处理的细胞中，氨基酸刺激后S6激酶的磷酸化受到损害(Gan等人，2005年). 然而，这种影响在FIP200型−/−MEF公司(Gan等人，2005年). 在测试4E-BP1的磷酸化水平时，我们也未能检测到该途径中的明显缺陷(图5 A). 在永久性敲除的细胞中，可能存在对FIP200缺陷条件的适应。然而，我们目前的研究并不排除FIP200与TSC复合体作用的可能性。FIP200可能在mTOR的上游和下游都起作用，但在我们分析自噬时，下游效应可能占主导地位。

由于FIP200与ULK1和2相互作用并对自噬至关重要，人们可能推测该蛋白是酵母Atg13或17的对应物。事实上，虽然FIP200（1594 aa）比Atg17（417 aa）大得多，但FIP200与酵母Atg17有一些共同的特征。首先，Atg17和FIP200都有多个线圈域。其次，正如Atg17是Atg1激酶活性所必需的(Kamada等人，2000年；Kabeya等人，2005年)FIP200缺陷细胞中ULK1的磷酸化状态降低，这可能表明ULK1活性降低(图8). 因此，Atg17和FIP200可能分别支持Atg1和ULK的功能。我们还发现，每个细胞的ULK1激酶活性在FIP200型−/−单元格（未发布的数据）。然而，由于ULK1表达水平本身在FIP200型−/−细胞比野生型细胞(图8)，我们无法得出在缺乏FIP200的情况下ULK1的比活性降低了多少。第三，ULK1的C末端区域对FIP200相互作用和ULK1点状结构的形成都至关重要(图3；Chan等人，2007年)，表明与FIP200的相互作用对于膜靶向是重要的。这与先前的发现一致，即酵母Atg17是PAS靶向Atg1所必需的，这在第11天突变体(铃木等人，2007年；Cheong等人，2008年；Kawamata等人，2008年). 第四，FIP200具有除ULK1和2之外的多个绑定伙伴。类似地，通过双杂交分析和质谱法对酵母蛋白相互作用进行系统分析，确定了许多潜在的Atg17相互作用蛋白，其中一些与自噬无关(Ho等人，2002年；Gavin等人，2006年；Krogan等人，2006年). 因此，Atg17和FIP200都可以作为多种蛋白质的支架。最后，Atg17的同源物存在于乳克鲁维酵母和棉蚜，其中缺少FIP200同源物。另一方面，FIP200同源物在智人，小家鼠，五倍子、和D.黑腹果蝇，其中缺少Atg17同源物，但不在酿酒酵母。这种互斥性表明，这两类蛋白质可能具有相似的功能，其中一种蛋白质是必需的，但不是两者都需要。鉴定和分析哺乳动物Atg13的功能同源物，这是该复合物的关键因素，将进一步阐明酵母和哺乳动物Atg1复合物之间的功能关系。

LC3转换FIP200型−/−细胞

本研究的一个显著发现是，在FIP200缺陷细胞中可检测到大量LC3-II，这是最广泛使用的自噬指示剂。这可能表明即使在没有FIP200的情况下也会发生极低水平的自噬，这与小自噬体偶尔在酵母中生成的发现一致第17天突变细胞(Cheong等人，2005年；Kabeya等人，2005年). 然而，这种泄漏表型可能由Cvt特异性Atg11介导，而哺乳动物细胞中没有这种Atg11(铃木等人，2007年；Cheong等人，2008年；Kawamata等人，2008年). 事实上，自噬通量分析FIP200型−/−细胞表明自噬降解几乎完全消失(图5 B). 因此，在FIP200型−/−细胞可以以自噬无关的方式生成。在酵母中，即使在第17天突变细胞以及其他一些自噬突变体，如atg1处，2，6，9，13，14、和16突变体(Suzuki等人，2001年). Atg8–PE共轭仅在atg5型，10、和12突变细胞，并被完全阻断自动变速器组3，4、和7突变细胞(Suzuki等人，2001年). 最近有报道称，Atg12–Atg5共轭物对Atg8–PE共轭反应具有类似E3的酶活性(Hanada等人，2007年). 因此，Atg8–PE结合可以以自噬无关的方式发生。迄今为止报道的Atg敲除哺乳动物细胞是附件5−/−和第7页−/−虽然这些细胞中没有LC3-II形成，但这可能是由于Atg12和8结合缺陷引起的，而不仅仅是自噬缺陷。如中所述FIP200型−/−细胞，Beclin 1沉默阻断自噬体的形成，但不导致LC3转化的完全抑制(Zeng等人，2006年；松井等人，2007年). 因此，这并不矛盾FIP200型−/−细胞显示出一些LC3-II，即使自噬活性实际上受到抑制。相反，这些数据表明，我们应该测量自噬通量，而不是LC3-II的绝对量，以监测自噬(Tanida等人，2005年；水岛和吉森，2007年).

ULK/Atg1和焦点粘附组件

我们已经证明FIP200定位于自噬隔离膜，对自噬至关重要。我们不认为FIP200是一种自噬特异性蛋白。最明显的证据是FIP200型−/−小鼠在E13.5至16.5之间死亡，心脏和肝脏发育缺陷(Gan等人，2006年)，而自噬缺陷附件5−/−和附件7−/−小鼠在胚胎发育过程中存活下来（尽管它们在出生后一天内死亡）。事实上，FIP200参与了多种细胞过程，例如抑制Pyk2诱导的信号传导(Ueda等人，2000年)，通过FAK抑制抑制细胞迁移(Abbi等人，2002年)，肿瘤抑制(Chano等人，2002b)，诱导RB表达(Chano等人，2002a)，通过抑制TSC复合物调节细胞大小(Gan等人，2005年；Chano等人，2006年)，抑制p53介导的G1-S进展(Melkoumian等人，2005年)以及可能通过抑制ASK1和TRAF2抑制TNF诱导的凋亡(Gan等人，2006年). 这些数据表明FIP200是一种多功能蛋白质。

一个重要的问题是FIP200单独参与自噬还是FIP200及其相互作用蛋白参与自噬。当我们准备这份手稿时D.黑腹果蝇遗传分析揭示了Atg1和细胞骨架支架蛋白paxillin之间的遗传相互作用(Chen等人，2007年). 该研究进一步证明，在饥饿条件下，paxillin和vinculin从局部黏附重新分布到细胞内结构，并且paxillin-deficient MEF在自噬中有缺陷。相反，我们的分析表明FAK对自噬是不需要的，这表明局部黏附复合体本身并不参与自噬。FIP200和paxillin之间的FAK非依赖性通讯将成为自噬和局灶性黏附未来研究的主题。

鉴于至少有三个局部黏附成分在自噬中起作用，ULK也可能在细胞黏附中发挥作用，而这种作用与其自噬功能无关。事实上，GFP-ULK1和-ULK2偶尔在细胞外围检测到（图S2），野生型ULKs的过度表达导致细胞形态异常，如细胞圆形和突起（图S3）。到目前为止，一些研究表明Atg1/ULK在不同物种中具有自噬无关的作用，如轴突伸长和分支秀丽隐杆线虫(Ogura等人，1994年)和哺乳动物(Tomoda等人，1999年；Zhou等人，2007年). 这些功能可能与Atg1在粘连灶中的作用有关。

总之，我们已经鉴定出一种新的ULK相互作用蛋白，FIP200，其功能与酵母Atg17相似。ULK–FIP200复合物对自噬至关重要，但该复合物的确切作用尚不清楚。鉴定Atg1–ULK的生理相关底物是最直接的方法之一，尽管迄今为止尚未在任何研究物种中成功(Deminoff和Herman，2007年). 寻找额外的相互作用蛋白也将有助于理解Atg1-ULK复合物的作用以及自噬诱导和自噬体形成的调控。

材料和方法

质粒

IMAGE Consortium cDNA克隆（GenBank登录号。BC017556号)编码人RB1CC1/FIP200的基因来自Invitrogen。将编码FIP200的cDNA克隆到p3×FLAG CMV10（Sigma-Aldrich）中。野生型和kinase-dead小鼠ULK1和2的表达构建物是由N.Okazaki（日本Kisarazu，Kazusa DNA研究所）和M.Muramatsu（日本东京医学和牙科大学）赠送的。先前描述了激酶缺失ULK1突变体（保守的ATP结合Lys 46被Asn取代）和激酶缺失突变体ULK2（Lys 39被Thr取代）(Yan等人，1998年，1999). FAK cDNA构建物由S.Hanks（田纳西州纳什维尔范德比尔特大学）提供。

细胞培养和转染

附件5−/−(Kuma等人，2004年),第200页−/−(Gan等人，2006年)、和FAK（传真）+/−，FAK（传真）−/−（日本神户理化研究所S.Aizawa赠送；Ilic等人，1995年)MEF是以前生成的。MEFs和HEK293T细胞在添加有10%FBS和50μg/ml青霉素和链霉素的DME（完全培养基）中培养，培养基为5%CO2孵化器。用牛小牛血清代替FBS检测NIH3T3细胞。饥饿时，用PBS清洗细胞，并在不含FBS（饥饿培养基）的无氨基酸二甲醚中培养。采用Fugene 6试剂（Roche）和脂质体2000试剂（Invitrogen）进行转染。

抗体和试剂

用重组人FIP200（残基200–413和1–633）或小鼠ULK1（残基738–1052）的片段作为抗原，通过标准程序在兔子体内生成针对FIP200或ULK1的多克隆抗体。多克隆抗LC3(细川等人，2006年)和抗Atg16L1抗体(水岛等人，2003年)如前所述。多克隆抗ULK1抗体（A7481）、单克隆抗FLAG（M2）和抗α-微管蛋白（DM1A）购自Sigma-Aldrich。另一种多克隆抗ULK1抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.。一种单克隆抗HA抗体（HA11）购自Covance。单克隆抗HSP90和抗HSP70抗体购自BD Biosciences。4E-BP1多克隆抗体购自Cell Signaling Technology。p62的多克隆抗体购自美国研究产品公司（American Research Products，Inc.）。Alexa Fluor 488-、568-和660-结合山羊抗兔IgG（H+L）抗体（Invitrogen）用于免疫化学。雷帕霉素和氯化锂购自Sigma-Aldrich。巴菲尔霉素A1购自Wako Pure Chemical Industries，Ltd.C2-神经酰胺购自EMD。

相对长度单位

将MEF固定在2.5%戊二醛中的0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中2 h。细胞在含有1 mM甘氨酸的磷酸盐缓冲液中清洗三次，然后在1%OsO中固定4在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中放置1 h。用分级系列乙醇进一步脱水细胞，并将其嵌入环氧树脂中。超薄切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅双重染色，并用电子显微镜观察（7100；Hitachi）。对于形态分析，使用MetaMorph图像分析软件（6.2版；MDS Analytical Technologies）对每个样品的至少20个切片进行分析。

逆转录病毒表达系统

编码人类FIP200、野生型小鼠ULK1、ULK1的cDNAK46N公司，ULK1ΔCULK2、ULK2K39吨、Atg5和FAK以及大鼠LC3的N-末端与GFP片段融合。编码小鼠ULK1的cDNAK46N公司用HA表位N末端标记。这些cDNA被亚克隆到pMXs-puro或pMXs-IP中（由日本东京大学北村T.Kitamura提供）。所得载体用于转染Plat E细胞，从而产生重组逆转录病毒。用重组逆转录病毒感染MEF和NIH 3T3细胞，并在含有1μg/ml嘌呤霉素的培养基中进行筛选。将稳定表达重组蛋白的细胞汇集起来进行实验(Kamura等人，2004年).

免疫沉淀和免疫印迹

细胞裂解物在裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM EDTA，0.5%Triton X-100，1 mM-PMSF，1 m M Na）中制备三VO（旁白）4和蛋白酶抑制剂混合物[完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂；罗氏]）。通过15000 rpm离心15 min澄清裂解产物，并使用特定抗体结合蛋白G–Sepharose（GE Healthcare）进行免疫沉淀。沉淀的免疫复合物在裂解缓冲液中洗涤五次，并在样品缓冲液中煮沸。随后用SDS-PAGE分离样品并转移到Immobilon-P聚偏二氟乙烯膜（Millipore）。使用所示抗体进行免疫印迹分析，并使用SuperSignal West Pico化学发光底物（Thermo Fisher Scientific）进行可视化。使用成像分析仪（LAS-3000 mini；Fujifilm）和Multi-Gauge软件（3.0版；Fujifilm）分析信号强度。使用Photoshop 7.0.1（Adobe）对整个图像进行对比度和亮度调整。

荧光显微镜

用配有电荷耦合器件相机（ORCA ER；哈马松光电）的荧光显微镜（IX81；Olympus）直接观察MEF或NIH3T3细胞表达融合到GFP的蛋白。使用60×PlanAPO油浸透镜（1.42 NA；Olympus）。使用MetaMorph图像分析软件版本获取图像。为了通过免疫荧光显微镜进行检查，将涂胶盖玻片上生长的细胞固定，并用前面描述的抗Atg16L1、抗FIP200或抗HA抗体染色(水岛等人，2001年).

激酶分析

用PBS清洗细胞，然后在提取缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH7.5，150 mM NaCl，10 mMβ-甘油磷酸，5 mM EGTA，1 mM焦磷酸钠，5 mM-NaF，1 mM-Na）中溶解细胞三VO（旁白）4和0.5%Triton X-100）添加蛋白酶抑制剂（胃蛋白酶抑制素A、凝乳抑素、亮氨酸蛋白酶和E64各10μg/ml[肽研究所有限公司]）。用抗ULK1抗体免疫沉淀ULK1，并在30°C条件下在γ-[32P] ATP（GE Healthcare）和髓磷脂碱性蛋白（Millipore）。反应产物通过SDS-PAGE分离32用BAS图像分析仪（Fujifilm）观察P标记的髓鞘碱性蛋白带。使用Multi-Gauge软件量化信号强度。使用ULK1抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）通过免疫印迹分析监测免疫沉淀ULK1的量。

实时PCR

使用SYBR预混料EX-Taq（Takara）对Thermal Cycler Dice（塔卡拉）进行实时PCR。使用的引物组合如下：小鼠ULK1正向，5′-TTACCAGCGCAT-3′；反向为5′-TGGGGAGAAGGTGTGTAGGG-3′；小鼠β-actin前向，5′-CTGGTATGGAATCTGTGG-3′；反向为5′-GTACTTGCGCTCAGGAG-3′。每个样本中的扩增子表达均归一化为其β-肌动蛋白mRNA含量。

在线补充材料

图S1显示了小鼠ULK同源物（ULK1-4）的结构比较。图S2显示了ULK1和2的外围定位模式。图S3显示了过表达野生型ULK但不在激酶死亡的ULK中的细胞的异常细胞形态。图S4显示了野生型和FIP200型−/−MEF公司。图S5显示了在100 nM巴非霉素A存在或不存在的情况下，MEF中ULK1和FIP200的内源性表达1。在线补充材料可在http://jcb.org/cgi/content/full/jcb.200712064/DC1.

补充材料

【补充材料索引】

致谢

我们感谢Shinichi Aizawa博士（物理和化学研究所）提供伪造−/−MEF、Steven K.Hanks博士（范德比尔特大学）负责FAK cDNA，Toshio Kitamura博士（东京大学）负责逆转录病毒载体和Plat E细胞。

这项工作得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部科学研究补助金的部分支持。作者还感谢加藤纪念生物科学基金会和东丽科学基金会的财政支持。

笔记

本文中使用的缩写：Cvt，胞浆-空泡靶向；E、 胚胎日；FIP200，FAK家族–200 kD的相互作用蛋白；MEF，小鼠胚胎成纤维细胞；mTOR，雷帕霉素的哺乳动物靶点；PAS，前吞噬体结构；PE，磷脂酰乙醇胺；ULK、UNC-51样激酶。

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文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社