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.2009年4月；20（7）：1981-91。
doi:10.1091/mbc.e08-12-1248。 Epub 2009年2月11日。

营养依赖性mTORC1与自噬所需的ULK1-Atg13-FIP200复合物的关联

细川直男 1, 太极原野, Kaizuka武士, Chieko Kishi先生, 高村明仁, 资深技术分析师三浦丰, 家村顺一, 托鲁·夏目漱石, Kenji Takehana先生, 山田直树, 关俊林, 诺里科·大弘（Noriko Oshiro）, Noboru水岛
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营养依赖性mTORC1与自噬所需的ULK1-Atg13-FIP200复合物的关联

细川直男等。 分子生物学细胞. 2009年4月.

摘要

自噬是一种细胞内降解系统，通过该系统可降解溶酶体中的细胞质内容物。自噬是由营养物质耗竭动态诱导的，在细胞内提供必要的氨基酸，从而帮助细胞适应饥饿。尽管有人认为mTOR是自噬的主要负调控因子，但它如何控制自噬尚未确定。在这里，我们报道了一种新型哺乳动物自噬因子Atg13，它与ULK1和FIP200形成稳定的约3-MDa蛋白复合物。Atg13位于自噬隔离膜上，对自噬体的形成至关重要。与酵母对应物相比，ULK1-Atg13-FIP200复合物的形成不受营养条件的影响。重要的是，mTORC1以营养依赖的方式通过ULK1结合到ULK1-Atg13-FIP200复合物中，并且mTOR磷酸化ULK1和Atg13。ULK1通过雷帕霉素处理或饥饿来脱磷酸。这些数据表明，mTORC1通过直接调节约3-MDa-ULK1-Atg13-FIP200复合物抑制自噬。

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数字

图1。
图1。
Atg13与ULK1和FIP200形成复合物，并在饥饿期间部分脱磷酸。（A） 用FLAG-Atg13和HA-ULK1或HA-FIP200共同转染HEK293T细胞。然后使用抗FLAG抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀（IP）。用所示抗体通过免疫印迹分析检测所得沉淀物。（B和C）HEK293T细胞被饥饿1小时或雷帕霉素（100 ng/ml）处理，其裂解物用抗ULK1（B）、抗Atg13抗体（C）或免疫前兔血清（Pre）免疫沉淀，并用指示的抗体进行免疫印迹分析。（D） HEK293T细胞、HeLa细胞和MEF在完全培养基或饥饿培养基中培养指定时间。将部分细胞裂解物（时间0）与λ-磷酸酶在有或无磷酸酶抑制剂的情况下孵育15分钟，然后使用抗Atg13抗体进行免疫印迹分析。星号表示非特异性免疫反应带。（E） Atg13在FIP200型−/−MEF公司。FIP200型+/+和FIP200型−/−MEF在完全培养基或饥饿培养基中培养60分钟。然后使用抗Atg13抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物。（F） Atg13在没有ULK1的情况下脱磷酸。用抗Atg13抗体的免疫印迹法分析经抗ULK1 siRNA处理的HeLa细胞。
图2。
图2。
Atg13在自噬诱导后定位于隔离膜。（A） 将稳定表达GFP-Atg13的NIH3T3细胞在常规DMEM（完全）或无氨基酸DMEM中培养3 h，无FBS（饥饿），然后在新鲜的完全培养基中再培养1 h（饥饿→完成）。（B） 将稳定表达GFP-Atg13的NIH3T3细胞在饥饿培养基中培养2 h。然后使用抗Atg16L1抗体和Alexa Fluor 660-结合二级抗体对细胞进行免疫荧光显微镜检查。比例尺，（A和B）20μm。
图3。
图3。
Atg13对自噬至关重要。（A和B）HeLa细胞转染两组不同的Atg13 siRNA或对照siRNA。2天后，再次转染相同的siRNA，并额外培养3天。然后将细胞培养在常规DMEM或饥饿培养基中，在有或无E64d（50μM）和胃蛋白酶抑制素A（50μg/ml）的情况下培养2小时（A）或在没有这些抑制剂的情况下持续4小时（B）。使用抗Atg13、抗LC3、抗p62和抗β-肌动蛋白抗体通过免疫印迹分析总裂解物。星号表示非特异性免疫反应带。（C） 用Atg13或对照siRNA处理稳定表达GFP-LC3的HeLa细胞。4d后，细胞在完全培养基或饥饿培养基中培养4h，然后通过荧光显微镜观察GFP-LC3.信号。比例尺，20μm。（D） 用E64d（50μM）和胃蛋白酶抑制剂A（50μg/ml）饥饿2 h，然后进行常规电子显微镜分析。箭头表示自噬空泡（自噬体+自溶体）。棒材，1μm。通过形态计量分析确定自噬液泡总面积与细胞质总面积的比值。
图4。
图4。
Atg13构成一个～3-MDa复合物，包括ULK1和FIP200。（A） 将MEFs在完全或饥饿培养基中培养60分钟。细胞裂解物的S100级分（以100000×克)在Superose 6柱上通过尺寸排除色谱分离。用抗Atg13、抗ULK1和抗FIP200抗体进行免疫印迹分析。显示了分子质量标准的位置（单位：kDa）。五、 空隙率。星号表示非特异性免疫反应带。（B） 野生型和FIP200型−/−在完全培养基中培养的MEF按A所述进行分析。星号表示非特异性免疫反应带。用对照或Atg13 siRNA处理（C和D）HeLa细胞。用所示抗体（C）对总细胞裂解物进行免疫印迹分析。然后通过凝胶过滤对S100组分进行分析，如A（D）所示。星号表示在人类细胞中发现的非特异性免疫反应带。（E） 用FLAG-FIP200、HA-ULK1和Atg13共同转染HEK293T细胞。使用抗FLAG抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀（IP），并使用抗Atg13、抗HA和抗FLAG的抗体进行免疫印迹（IB）分析。用抗Atg13抗体检测内源性和外源性Atg13。
图5。
图5。
在富含营养的条件下，mTORC1与～3-MDa复合物相互作用。（A） 用空载体或ULK1-FLAG转染HEK293T细胞。然后在所示的完全培养基或饥饿培养基中培养细胞。在再刺激实验（补充）中，饥饿细胞在新鲜完整培养基中额外培养指定时间。使用M2琼脂糖珠对细胞裂解物进行免疫沉淀（IP）。用所示抗体通过免疫印迹分析检测所得沉淀物。（B） 用FLAG-raptor和HA-ULK1共同转染HEK293T细胞，并按A所述进行分析（30分钟补充条件）。（C） 将NIH-3T3细胞在饥饿培养基中培养180分钟。在补充实验中，将饥饿细胞在新鲜完整培养基中再培养30分钟。如图4A所示，分离S100组分。指出了raptor-positive分数的移位。星号表示非特异性免疫反应带。（D） 转染FLAG标记的ULK1、Atg13和FIP200的HEK293T细胞接受3小时饥饿和30分钟补充治疗。用抗FLAG抗体免疫沉淀细胞裂解物，并用抗猛禽抗体分析内源性猛禽的共沉淀。（E） 用FLAG标记的ULK1突变体转染HEK293T细胞，并测定其与猛禽和Atg13的相互作用。
图6。
图6。
TOR磷酸化ULK1和Atg13。（A和B）从HEK293T细胞中免疫沉淀内源性mTOR，培养在含有抗mTOR抗体的完整培养基中，如材料和方法。作为对照，使用正常小鼠IgG进行免疫沉淀。使用FLAG标记的ULK1对所得沉淀物进行mTOR激酶分析K46N公司（激酶死亡突变体）（a）或Atg13（B）作为底物。GST-PRAS40和GST-4E-BP1用作阳性对照，GST单独用作阴性对照。（C） HEK293T细胞在饥饿培养基中培养指定时间。总细胞裂解物通过免疫印迹分析进行分析。（D） 用空载体或ULK1-FLAG转染HEK293T细胞。然后将细胞饥饿180分钟，然后在新鲜的完全培养基中培养指定的时间。如图5A所示，对细胞裂解物进行分析。（E） NIH3T3细胞在完全培养基或饥饿培养基中培养180分钟。在补充实验中，饥饿细胞在补充前用100 ng/ml雷帕霉素或载体（DMSO）预处理30分钟，然后在新鲜的完全培养基中再加上和不加雷帕霉素培养30分钟。
图7。
图7。
ULK1在体外磷酸化Atg13。（A和B）ULK1-FLAG（Wt）和扭结头ULK1K46N公司-从在饥饿培养基中培养1h的HEK293T细胞中免疫沉淀FLAG突变体（KD）。所得沉淀以GST-Atg13和GST（阴性对照）为底物进行免疫印迹分析（A）或ULK1激酶分析（B）。
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