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.2010年8月；6(6):764-76.
doi:10.4161/auto.6.6.12709。

哺乳动物Atg蛋白的层次分析表征自噬体形成位点

板仓英介 1, Noboru水岛
附属公司

哺乳动物Atg蛋白的层次分析表征自噬体形成位点

板仓英介等人。 自噬. 2010年8月.

摘要

自噬是一种细胞内降解过程，细胞溶质物质通过自噬传递到溶酶体。尽管最近发现了许多自噬相关基因，但自噬体是如何产生的尚不清楚。在这里，我们研究了哺乳动物Atg蛋白之间的等级关系。在饥饿条件下，ULK1、Atg14、WIPI-1、LC3和Atg16L1定位于同一隔室，而DFCP1定位于这些Atgproteins附近。就点刺形成而言，包括ULK1和FIP200的蛋白质复合物是最上游的单元，并且是含Atg14的PI3-激酶复合物的点刺形成所必需的。DFCP1和WIPI-1的点状形成需要FIP200和Atg14。Atg12-Atg5-Atg16L1复合体和LC3是这些因素中的下游单元。含有上游Atg蛋白（如ULK1和Atg14）的点状结构与ER紧密相关，其中ER蛋白空泡膜蛋白1（VMP1）也短暂定位。即使用沃特曼素处理细胞以抑制自噬体的形成，这些结构也会形成。这些层次分析表明，ULK1、Atg14和VMP1以PI3-激酶活性独立的方式定位于ER相关的自噬体形成位点。

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数字

图1
图1
ULK1、Atg14、WIPI-1、Atg16L1和LC3共同定位于同一隔间，该隔间非常靠近DFCP1结构。（A–H）在饥饿培养基中培养1小时，稳定表达GFP-ULK1（A）、GFP-ULK1和HA-Atg14（B）、HA-Atg 14和GFP-WIPI-1（C）、HA-WIPI-1。然后固定、渗透细胞，并使用抗HA（B、C、G和H）、抗Atg16L1（A、D和E）和抗LC3抗体（F）进行免疫荧光显微镜检查。由于低表达，GFP-ULK1和GFP-DFCP1被抗GFP抗体染色。箭头表示几乎完全的共同定位，箭头表示相邻的共同定位。用虚线表示的结构进行了线扫描分析（如J、K和补充图3所示）。信号颜色由字体的颜色表示。St.M.，饥饿培养基。比例尺，10微米（白色）和1微米（黄色）。（一） 饥饿1小时后，所示Atg蛋白对之间完整和相邻共定位的量化。数据表示十幅图像的平均值±SE。从具有代表性的点状结构中获得（J–K）线扫描，显示GFP-WIPI-1和Atg16L1（J）之间以及HA-WIPI-1与GFP-DFCP1（K）之间存在共定位。原始结构如（D和H）所示（用虚线表示）。（五十） Atg船形结构的三维重建。用激光共聚焦显微镜观察饥饿1小时的细胞，然后重建3D图像。还显示了从Z截面重建的侧面图像。比例尺，1µm。
图2
图2
GFP-LC3和内源性Atg16L1在Atg3 KO、Atg5 KO和FIP200 KO MEF中的定位。在Atg3 KO、Atg5 KO和FIP200 KO MEF以及沃特曼处理的细胞中评估GFP-LC3（A）和内源性Atg16L1（B）的点状形成。将野生型MEFs和缺乏稳定表达GFP-LC3的Atg3、Atg5和FIP200的MEFs在常规或饥饿培养基中培养2小时，加入或不加入0.2µM wortmannin。然后固定细胞并用荧光显微镜检查。为了检测Atg16L1，用抗Atg16L抗体对细胞进行染色。比例尺，10µm。图显示了点阳性细胞的量化结果（每个细胞超过20点（A）和5点（B））。所示结果代表含有100个以上细胞的三份样品的平均值±SE。常规培养基；St.M.，饥饿培养基；WM，沃特曼；WT，野生型。
图3
图3
在FIP200 KO MEF和沃特曼处理的细胞中，PI（3）P-结合蛋白WIPI-1和DFCP1的点状结构缺陷。将Atg3、Atg5和FIP200缺陷的MEF及其相应的野生型对照MEF稳定转化为HA-WIPI-1（A）或GFP-DFCP1（B），在常规或饥饿培养基中培养，添加或不添加0.2µM沃特曼素1小时。然后固定、渗透细胞，并使用抗HA（A）或抗GFP抗体（B）进行免疫荧光显微镜检查。图表显示了点阳性细胞的量化结果。Y轴表示%的单元格显示超过10个点。所示结果代表含有100个以上细胞的三份样品的平均值±SE。常规培养基；St.M.，饥饿培养基；WM，沃特曼；WT，野生型。比例尺，10µm。
图4
图4
WIPI-1和DFCP1的点状结构取决于Atg14和Vps34。如图所示，用Atg14、Vps34或对照siRNA寡核苷酸处理稳定表达GFP-WIPI-1（A）的HepG2细胞和稳定表达GFP-DFCP1（B）的HeLa细胞。细胞在饥饿培养基中培养2小时，然后使用抗GFP抗体进行免疫荧光显微镜检查。图形显示GFP点阳性细胞的量化结果（每个细胞超过5个点）。所示结果代表含有100个以上细胞的三份样品的平均值±SE*p<0.05，**p<0.01，学生t检验。常规培养基；St.M.，饥饿培养基。比例尺，10µm。
图5
图5
抗Wortmann-resistant ULK1和Atg14 punta在Atg3 KO和Atg 5 KO细胞中生成，但在FIP200 KO细胞内不生成。（A和B）缺乏Atg3、Atg5和FIP200的MRF及其相应的野生型对照MEF，稳定表达GFP-Atg14（A）或GFP-ULK1（B），在含有0.2µM沃特曼的常规或饥饿培养基中培养1小时。然后使用抗GFP抗体对细胞进行免疫荧光显微镜检查。图形显示GFP点阳性细胞的量化结果（每个细胞超过10点）。所示结果代表含有100个以上细胞的三份样品的平均值±SE。Reg.M.，常规培养基；St.M.，饥饿培养基；WM，沃特曼；WT，野生型。比例尺，10µm。（C） 哺乳动物Atg蛋白在点状结构方面的层次分析概述。“+”和“−”分别表示是否形成了punta。
图6
图6
ULK1穿孔与ER膜紧密结合。稳定表达GFP-ULK1（A）或Vps34-GFP（B）的（A和B）NIH3T3细胞与HA-Atg14一起在含有0.2µM沃特曼的饥饿培养基中培养1小时。然后固定、渗透细胞，并使用抗HA和抗GFP（针对GFP-ULK1）抗体进行免疫荧光显微镜检查。信号颜色由字体的颜色表示。St.M.，饥饿培养基；WM、沃特曼。比例尺，10µm（白色）和1µm（黄色）。（C） 稳定表达GFP-ER（含大鼠细胞色素b5跨膜区）和HA-ULK1的MEF在饥饿培养基中培养1小时，加入或不加入0.2µM沃特曼，然后使用抗GFP和抗HA抗体进行免疫荧光显微镜检查。显示了从在饥饿介质中稳定表达GFP-ULK1和mRFP-ER的MEF的延时电影中选择的（D和E）帧，包括（E）或不包括（D）0.2µM沃特曼。饥饿处理开始后30分钟（D）或90分钟（E）开始对细胞进行成像。GFP-ULK1的定位用箭头表示。请参阅视频1和视频2了解完整图像。信号颜色由字体的颜色表示。St.M.，饥饿培养基；WM、沃特曼。比例尺，10微米（白色）和1微米（黄色）。
图7
图7
VMP1定位于早期自噬结构。稳定表达VMP1-GFP和RFP-ER或HA-ULK1的（A和C–E）MEF在常规或饥饿培养基中培养1小时，添加或不添加0.2µM沃特曼。使用抗HA抗体对细胞进行免疫荧光显微镜检查。VMP1和ULK1之间的彩色化用箭头表示。（B） 稳定表达VMP1-GFP的MEF在常规培养基中培养，并按照材料和方法中的描述进行亚细胞分离。免疫印迹分析显示VMP1-GFP、Beclin 1、蛋白二硫键异构酶（PDI，ER标记）、突触蛋白6（高尔基标记）和HSP90（细胞质蛋白标记）的分布。（F） 图表显示了VMP1和ULK1之间共定位的量化结果。Y轴表示ULK1点的VMP1-正性（%）。所示结果代表10个细胞的平均±SE*p<0.01，学生t检验。（G） 在营养丰富的条件下，观察到野生型和FIP200 KO MEF稳定表达VMP1-GFP。（H） 用VMP1或对照siRNA寡核苷酸处理稳定表达HA-ULK1、GFP-WIPI-1和GFP-DFCP1的HeLa细胞。细胞在饥饿培养基中培养1小时，然后使用抗HA、抗GFP和抗Atg16L1抗体进行免疫荧光显微镜检查。信号颜色（A和C–E）由字体颜色表示。常规培养基；St.M.，饥饿培养基；WM、沃特曼。比例尺，10微米（白色）和1微米（黄色）。（一） 如图所示，用VMP1或对照siRNA寡核苷酸处理HeLa细胞。细胞在饥饿培养基中培养2小时，加入或不加入20 mM氯喹啉，然后通过免疫斑点分析测定饥饿诱导的p62降解和溶酶体依赖的LC3周转。
图8
图8
哺乳动物自噬体形成模型和自噬蛋白之间的等级关系。在初始阶段，ULK1和Atg14复合物定位于内质网上或附近的自噬体形成位点。VMP1也暂时与该结构相关。Wortmann处理导致ULK1-Atg14-VMP1结构的积累，这表明该结构的解离而非形成取决于PI3-激酶的活性。在这一步骤的下游，两个PI（3）P结合蛋白WIPI-1和DFCP1、Atg12-Atg5-Atg16L1复合物和LC3-PE起到适当延长隔离膜的作用。箭头表示哺乳动物Atg蛋白之间对点刺形成的相互依赖性。
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