ULK1·ATG13·FIP200复合物介导mTOR信号传导对于自噬^*S公司⃞

摘要

大自噬（以下简称自噬）是一个分解代谢过程由此，长寿命蛋白质和受损的细胞器被运送到溶酶体用于降解。这个过程在所有真核生物中都是保守的。正常情况下生长条件自噬存在内务水平。在压力下，比如随着营养素的缺乏，自噬被强烈诱导，导致吞噬细胞溶质成分和细胞器双膜结构称为自噬体。在融合带溶酶体的外自噬体膜、内膜及其细胞质物质被降解和再循环(1–三).最近的研究表明，自噬在许多疾病的病理学中都有作用，包括癌症、神经变性以及清除细胞内病原体(4–8).

自噬的形态学最初是在50岁以上的哺乳动物细胞中描述的几年前(9). 然而，它是直到最近，通过酵母基因筛选，多重自噬与（ATG）基因已被鉴定(10–12).酵母ATG蛋白分为四大类：Atg1蛋白激酶复合物，Vps34磷脂酰肌醇3-磷酸激酶复合体、Atg8/Atg12共轭系统和Atg9再循环复合体(13). 即使许多ATG目前已知的基因，其中大多数在哺乳动物细胞中具有功能同源性(14，15)，分子机制他们通过它来感知最初的触发因素，并随后进行指令自噬特异性细胞膜事件尚不清楚。

在酵母中，最早的自噬特异性事件之一被认为是涉及Atg1蛋白激酶复合物。Atg1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶与关键的自噬调节因子(16). Atg1在处被复合到在自噬过程中，至少还有另外两种蛋白质，即Atg13和Atg17，它们都是正常Atg1功能和自噬体生成所必需的(17–19).经典信号通路，如cAMP依赖性激酶（PKA）通路或者Tor激酶途径似乎聚合在这个复合物上，将Atg1在自噬体生物发生的早期阶段(20–22).PKA对Atg1的磷酸化阻断其与形成的关联自噬体(21)，而Tor途径使Atg13过磷酸化，导致Atg13对Atg1，导致自噬抑制(17，19). 相反，营养Tor的饥饿或抑制导致Atg13去磷酸化，因此增加Atg1复合物形成和激酶活性，导致刺激自噬(19).令人惊讶的是，Atg1激酶的生理底物已识别；因此，Atg1如何传递上游自噬信号未定义。最近，Atg1的哺乳动物同源物被鉴定为ULK1和ULK2（类似Unc-51激酶）²(23–25).ULK1和ULK2普遍表达并定位于隔离区营养素饥饿时形成膜或自噬体(25); RNAi介导的耗竭HEK293细胞中ULK1的表达损害自噬(23，24). ULK1的确切作用与ULK2在自噬中的作用尚不清楚，可能有一些两种亚型之间存在冗余(26).

考虑到酵母菌对人类的自噬保持不变注意，没有发现与酵母Atg13或Atg17对应的哺乳动物直到最近。蛋白质FIP200(（f）局部粘附激酶家庭-我相互作用第页蛋白质200kDa）是确定为ULK1和ULK2的自噬重要结合伙伴(25)，而且一直如此推测FIP200可能相当于酵母Atg17，尽管其含量很低序列相似性(25，27).

在本研究中，我们深入研究了ULK1对更好地了解哺乳动物信号通路如何影响自噬启动。我们在这里描述了由ULK1、FIP200和Atg13的哺乳动物等效物。这个综合体是不仅需要将ULK1定位到隔离膜上，而且还需要以获得最大的激酶活性。此外，ATG13和ULK1都是激酶mTOR途径中的底物，因此可能具有感知营养物质的功能饥饿。因此，本研究确定了哺乳动物的作用ULK1-ATG13-FIP200复合物在介导初始自噬触发和把信号传给核心自噬机器。

实验程序

试剂和抗体-兔抗ULK1（A7481）和小鼠抗FLAG（克隆M2）购自Sigma，兔抗FIP200购自ProteinTech Inc.，小鼠抗Myc克隆9E10是从单克隆抗体中获得的斯隆-凯特琳纪念癌症中心的抗体设施，小鼠抗GFP来自Roche Applied Sciences，老鼠抗T7和老鼠抗S标签来自诺瓦根。雷帕霉素购自西格玛公司。

克隆和蛋白质表达-cDNA购自ATCC：OpenBiosystems的小鼠ULK1（克隆ID 6834534）：小鼠LOC51897/ATG13（克隆ID 5359944），人类FIP200（克隆ID 3908134）。在MEF细胞中表达，将ULK1亚克隆到pBabe/puro中，其中包含N末端FLAG和S标记；将ATG13亚克隆到含有N末端GFP标记的pBabe/blast中。对于在293T细胞中表达，将ULK1亚克隆到pCMV-Tag4（Invitrogen）中含有C末端FLAG标签，并且ATG13和FIP200都被亚克隆包含N末端Myc标记的pCMV-Tag3（Invitrogen）。第194页（N终端mCherry）是路德维希研究所Iain Cheeseman博士的一份礼物加利福尼亚州圣地亚哥癌症研究中心。哺乳动物表达载体编码Myc-tagged mTOR和Myc-tag kinase-dead mTOR来自Addgene，由怀特黑德生物医学研究所萨巴蒂尼实验室提供研究。对于重组蛋白表达，亚克隆ULK1和FIP200包含N末端His标签的pFastBac，而ATG13被亚克隆到pFastBac包含N端His和FLAG标签。此外，ATG13是亚克隆到pET28a中，用于表达大肠杆菌.

ULK1、FIP200和ATG13的重组蛋白在Sf9中表达细胞使用Invitrogen的Bac-to-Bac表达系统。细胞颗粒在缓冲区T中重新悬浮（20 m米Tris，pH 8.0，50 m米氯化钠，2米米β-巯基乙醇）并在镍上纯化列。在大量洗涤后，在缓冲液T中逐步洗脱蛋白质含10-250 m米咪唑。混合纯馏分并在25米内透析米Tris，pH 7.5，100 m米氯化钠和1米米DTT，snap冷冻前和-80°C下储存。在这种情况下ULK1和FIP200的蛋白质通过离子交换进一步纯化在SP-Sepharose柱和Q-Sepharose柱上进行色谱分析，分别进行透析和snap冷冻。T7-ATG10表达在细菌中，如前所述进行纯化(28).

细胞培养-所有哺乳动物细胞均在Dulbecco’s培养基中培养改良Eagle's培养基（DMEM），补充10%胎牛血清和青霉素/链霉素并在37°C、5%CO下培养₂。对于诱导自噬，细胞通常生长到75%的汇合处洗涤两次并在无氨基酸DMEM中培养1小时（或完全培养基作为控制），除非另有说明。雷帕霉素500n米包含在中完整的生长培养基（如指示）。

转染和转导-293T细胞和U2OS细胞根据制造商的建议和典型的转染后24小时分析。使用Moloney小鼠白血病稳定转导MEF细胞以293T细胞为包装细胞的逆转录病毒pBabe系统行。

ULK1-binding Partners的串联亲和纯化—4015×cm MEF细胞板，稳定表达低水平的FLAG和将S标记的ULK1或仅表达载体的对照细胞置于冰上，在冷PBS中洗涤两次，并在IP缓冲液（50 m）中溶解米HEPES，pH7.4，150米米氯化钠，1米米乙二胺四乙酸（EDTA），0.5米米DTT，10%甘油，0.5%Triton X-100）加蛋白酶抑制剂。当时的裂解液5000×离心10分钟克，4°C，然后是10万倍的额外旋转克在4°C下保持1小时。已澄清然后将裂解产物与抗FLAG-琼脂糖珠（Sigma）孵育过夜在4°C下旋转。洗涤后，结合蛋白在IP中洗脱含200μg/ml 3×FLAG肽（Sigma）的缓冲液冰。然后将洗脱液与抗S标签珠（Novagen）在4°C，旋转。在IP缓冲区中进行四次清洗，在PBS中进行一次清洗，样品在SDS样品缓冲液中洗脱，蛋白质通过质量鉴定光谱分析。

RNA干扰-针对小鼠FIP200构建shRNA和ATG13是使用pSuperRetro载体根据制造商程序（OligoEngine）。FIP200 DNA序列用于RNAi构建物为：GAGAGAACTTTTGAAA和ACATGAAGTCTAGAAA。ULK1序列：GAGCAAGAGCACAGAAA和AGACTCCTGTGACACAT。ATG13序列：GAGAGAATGTCCGAGAAT和ACAGGAGACTTGGACAA。转染后和嘌呤霉素选择，选择了多个稳定的克隆，没有蛋白质敲除相关表型的显著差异。

逆转录聚合酶链反应-生长在使用Total RNA Mini试剂盒（Bio-Rad）采集6×cm平板。总计测量RNA，并将每个样品的0.5μg用于第一链cDNA合成（iScript cDNA合成试剂盒，Bio-Read）。总cDNA的十分之一反应作为PCR反应的模板。两个ATG13的底漆和GAPDH被设计为扩增约500 bp的3′-区这两种基因。按照常规使用Taq聚合酶进行PCR协议。

免疫沉淀-自噬诱导后，细胞生长在10×-cm的平板上，放在冰上，在冰柜中清洗两次PBS，然后在IP缓冲液和蛋白酶抑制剂中进行裂解。当时的裂解液在4°C的台式微型离心机中以最大速度离心10然后将澄清的裂解物与小鼠抗GFP孵育1小时在室温下旋转，然后添加蛋白质G-Sepharose珠子（GE Healthcare）在IP缓冲液中预洗30分钟。珠子然后在IP缓冲液中洗涤三次，然后在PBS中洗涤一次在SDS样品缓冲液中洗脱，并通过SDS-PAGE和免疫印迹进行分析。

结合分析-100℃下纯化的重组蛋白n个米在结合缓冲液（25 m）中培养米Tris，pH值7.5，100米米氯化钠，0.5米米DTT，0.5 mg/ml牛血清白蛋白，0.1%Triton®声波风廓线仪X-100）在室温下旋转1h。对于ULK1下拉分析，反应与兔抗ULK1孵育30分钟，然后是蛋白A-琼脂糖珠，在结合缓冲液中预洗，用于另外30分钟。然后在结合缓冲液中清洗珠子四次然后在样品缓冲液中洗脱，并通过SDS-PAGE和免疫印迹进行分析。对于ATG13下拉分析，样品用预先洗涤的T7-琼脂糖培养珠子（Novagen）在结合缓冲液中清洗前1小时，并进行分析ULK1下拉。

凝胶过滤-所示重组蛋白，100n个米，在凝胶过滤缓冲液（25m米Tris，pH 7.5，100 m米氯化钠，1米米DTT）和0.5 mg/ml将50μl牛血清白蛋白加载到SMART-FPLC系统前1小时重叠6柱，在凝胶过滤缓冲液中预先平衡。100微升收集各组分并通过SDS-PAGE和免疫印迹分析。

激酶分析-通常为10 n米净化的重组ULK1和指定量的FIP200或ATG13在激酶缓冲液（25 m米HEPES，pH 7.4，50 m米氯化钠，5米米氯化镁₂，1米米DTT，0.5 mg/ml牛血清白蛋白），含0.3 mg/ml髓磷脂碱性蛋白，30μ米寒冷的ATP和0.5μCi的[γ³²-P] ATP在30°C下持续10分钟。通过加入样品缓冲液、随后进行SDS-PAGE来停止反应，转移到硝化纤维素，并通过phosphorImager进行分析。

免疫荧光-已为处理单元格免疫荧光基本如所述(29). 幻灯片已可视化在尼康Eclipse TE2000-U显微镜上，使用Adobe处理图像Photoshop。

结果

ULK1与ATG13和FIP200形成三重复合物-收件人了解ULK1在自噬启动中的确切作用，我们筛选使用串联亲和标记免疫沉淀（IP）的ULK1相互作用伙伴方法。我们稳定地生成了小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞系用N端FLAG和S标记（F/S-ULK1）表示ULK1构造。在使用抗FLAG和抗S标签抗体进行连续IP后，通过质谱鉴定ULK1相关蛋白。两种蛋白质鉴定为FIP200和假设蛋白LOC51897。在这项研究发表了两份报告，将FIP200描述为ULK相互作用蛋白质(25)和一个人ULK相互作用蛋白与酵母Atg13的远相关(30)，曾经是之前在生物信息学分析中确定为潜在等效物至酵母Atg13(31). 这个后一种蛋白质是发现的小鼠LOC51897的同源物在这里。此外，尽管LOC51897和酵母Atg13之间的序列相似非常有限，我们发现LOC51897和秀丽隐杆线虫ATG13（数据未显示）。基于这些下面描述的观察结果和功能分析，我们现在参考LOC51897为ATG13。

虽然FIP200和ATG13已被鉴定为ULK1的结合蛋白，他们如何调节ULK1尚不清楚。因此，在本研究中，我们寻求了解FIP200和ATG13对ULK1功能的影响。我们假设ULK1可以与这两种蛋白质形成复合物，类似于酵母Atg1·Atg13·Atg17复合物。使用表达GFP-ATG13的MEF细胞，我们证实了ULK1和ATG13之间的相互作用。重要的是，IPGFP-ATG13和抗GFP不仅导致内源性ULK1的co-IP，而且内源性FIP200，而GFP单独未能协同IP ULK1或FIP200(图1A类).有趣的是，我们发现ULK1和GFP-ATG13在SDS-PAGE和饥饿时这两种蛋白质都会降低到快速迁移表单(图。1A类，比较车道3具有4). 这是表明饥饿导致的去磷酸化事件，事实上，用磷酸酶处理细胞裂解物可使ULK1和ATG13（见下文和图。5). 此外，ULK1之前已被证明是细胞内磷酸化(25，30). 自噬的诱导氨基酸饥饿未能显著改变ULK1或FIP200与GFP-ATG13关联(图。1A类，比较11号车道具有12)，意味着ATG13在自噬之前与ULK1和FIP200相互作用归纳。

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图1。

ATG13与ULK1和FIP200相互作用体内.A类，GFP-ATG13免疫沉淀。MEF细胞，耗尽RNAi显示的蛋白质通过逆转录病毒转导表达GFP-ATG13。在完全生长培养基或氨基中培养1小时后无酸介质(饿死)，细胞被裂解，GFP-ATG13使用小鼠抗GFP免疫沉淀。共免疫沉淀蛋白按指示进行免疫印迹分析。B类，ATG13的RNAi缺失。琼脂糖凝胶描绘ATG13和GAPDH mRNA的RT-PCR显示了控制缺失和两个ATG13缺失细胞克隆（13-4和13-5）。C类ULK1复合蛋白的丢失抑制了自噬。MEF细胞，耗尽所指示的蛋白质并表达GFP-LC3的细胞在完全培养基或无氨基酸培养基培养1h，然后裂解，SDS-PAGE和抗GFP免疫印迹检测GFP-LC3。D类，相同中描述的单元格C类生长在玻璃盖玻片上在完全培养基或无氨基酸培养基中培养1h以及在荧光显微镜下观察到的GFP-LC3。E类、ULK1、，ATG13和FIP200在自噬刺激时共定位。U2OS细胞，生长于用mCherry-ULK1和GFP-ATG13转染玻璃盖玻片(顶部面板)或GFP-ULK1和mCherry-FIP200(底部面板). 24小时转染后，将细胞清洗并在无氨基酸培养基中培养1小时，然后在荧光下固定和可视化显微镜。箭头请举例说明mCherry-ULK1和GFP-ATG13(顶部面板)或GFP-ULK1和m樱桃-FIP200(底部面板).

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图5。

ULK1和ATG13受到mTOR介导的磷酸化作用。 A类，ULK1在自噬后保持部分磷酸化归纳。MEF细胞在无氨基酸培养基中培养(饿死)1h后进行裂解。然后用磷酸酶或模拟处理，然后用免疫印迹法分析流动性ULK1。B类，ATG13在自噬诱导后脱磷酸。来自稳定表达GFP-ATG13的MEF细胞的裂解液也经过处理或用磷酸酶模拟处理，然后进行SDS-PAGE和免疫印迹抗GFP。C类、ULK1和ATG13在自噬时脱磷酸归纳。表达GFP-ATG13的MEF细胞在完全培养基中孵育(控制)，含500n的介质米雷帕霉素(雷帕霉素)或无氨基酸介质(饿死)，后面是抗ULK1的裂解和免疫印迹(顶部面板)或抗GFP(底部面板). 样品一式两份。D类，百万TOR过度表达增加ATG13磷酸化。转染293T细胞单独或与Myc-tagged野生型结合使用类型(重量)或kinase-dead(死去的)mTOR，如图所示。24小时转染后的细胞在含有500牛顿米雷帕霉素或无氨基酸培养基(饿死)的1.5 h。然后裂解细胞，加载两份，并进行SDS-PAGE和抗Myc免疫印迹。

ULK1和FIP200与GFP-ATG13的联合IP表明ATG13同时与两种蛋白质相互作用或存在两个ATG13：一个只与ULK1交互，另一个与FIP200。在酵母中，Atg1被认为主要通过以下途径与Atg17相互作用附件13(17). 确定是否GFP-ATG13与ULK1的相互作用由我们进行的FIP200介导FIP200缺失细胞中ULK1的co-IP。我们发现类似数量的ULK1与GFP-ATG13在FIP200稳定耗尽的细胞中共沉淀shRNA与对照细胞的比较(图。1A类，比较车道11和12具有车道15和16). 相反GFP-ATG13和FIP200不受ULK1耗竭的影响(图1A类，比较车道11和12具有车道13和14),表明ATG13可以与ULK1和FIP200独立交互（尽管在ULK1-完成的情况下，我们不能排除ULK2作为更换）。可以认为，即使shRNA-介导的ULK1或FIP200有效（约90%的蛋白质消失）仍有微量FIP200（或ULK1）足以调节ULK1（或FIP200）与GFP-ATG13的相互作用。我们认为这不太可能，因为这些细胞的耗竭足以破坏饥饿诱导的自噬细胞，通过GFP-LC3的免疫荧光和Western blot测定(图1，C类和D类).

确认所有三种蛋白质都是饥饿介导的必需蛋白自噬，我们在缺乏ATG13、FIP200和ULK1的细胞中表达GFP-LC3。由于缺乏可用的ATG13抗体，我们使用mRNA水平和RT-PCR监测ATG13消耗。如图所示图1B类，ATG13 mRNA在两个稳定的MEF克隆（除非另有说明，克隆13-5用于下述实验。所有其他RNAi实验也使用两个具有相同功能的独立稳定细胞克隆结果），表示有效消耗。ULK1和通过Western blot监测FIP200（见图。​图1A类1A类和​和4C类4C类和补充图S2A类). 细胞溶质LC3（I型）与脂质的结合在自噬体膜上偶联的磷脂酰乙醇胺（II型）随着自噬体与溶酶体融合，其随后的降解是自噬的特征。当在对照组中监测GFP-LC3水平时-完成细胞，未结合的I型明显转化为脂蛋白形式II和氨基酸提取后GFP-LC3水平的总体降低，指示自噬诱导(图。1C类). 然而，在ATG13、FIP200和ULK1缺失细胞中，LC3转化为lipidated形式或水平降低被抑制，表明对氨基酸的自噬反应受阻剥夺(图1C类).细胞中GFP-LC3免疫荧光进一步支持了这一结果(图1D类)：处于控制中细胞在饥饿时GFP-LC3点状增加，表明自噬体形成大幅增加，与Western blot数据图。1C类; 相反，GFP-LC3没有显著增加在ATG13、FIP200或ULK1缺失的细胞中观察到点状，证实自噬阻滞了这些细胞。

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图4。

ATG13和ULK1刺激ULK1激酶活性。 A类，ATG13刺激ULK1激酶活性。10牛顿米重组ULK1是与指定量的重组FLAG-ATG13孵育0.3 mg/ml MBP和[γ-³²P] ATP如下所述“实验程序”。通过添加SDS样品缓冲液，然后进行SDS-PAGE并转移至硝化纤维素。这个上部面板显示的是³²P标记的MBP膜的Ponceau-S染色显示MBP总量如下所示。每个反应中ULK1和FLAG-ATG13的数量表示为免疫印迹下部面板。B类、ATG13和FIP200对刺激ULK1激酶活性。10牛顿米ULK1，200牛顿米FLAG-ATG13或200 n米hisFIP200单独或在如图所示，结合MBP和[γ-³²P] ATP和按中的方式处理交流，ATG13中ULK1激酶活性受损FIP200耗尽的细胞。MEF细胞，对照、ATG13-或FIP200耗尽在完全培养基或无氨基酸培养基中孵育1小时，然后通过FIP200的裂解和免疫印迹(顶部面板)和ULK1(底部面板). 重复样品的蛋白质负荷如下所示Ponceau-S染色下部面板.

如果ULK1、ATG13和FIP200在细胞内相互作用，则合理的做法是假设它们将通过免疫荧光显微镜共同定位在一起。ULK1和FIP200已被证明主要在静息细胞中是胞质的，但是用隔离膜标记物ATG5定位，刺激自噬（参见图3A类和参考。25). 最近报告详细介绍了人类ATG13的发现，一个带有FLAG标签的版本显示了一个与GFP-LC3部分共定位，标志着隔离膜和成熟的自噬体，饥饿时(30). 确定是否事实上，ATG13是专门定位于隔离膜的，我们用GFP-ATG13逆转录病毒转导F/S-ULK1稳定MEF。ULK1和GFP-ATG13在正常生长条件下呈胞浆染色模式条件。然而，它们广泛地共同定位于点状结构饥饿（补充图S1）。确认这些产品的共同本地化我们用mCherry-ULK1和在氨基酸保护条件下，GFP-ATG13或GFP-ULK1和mCherry-FIP200。如中所示图1E类，的大多数mCherry-ULK1点刺和GFP-ATG13点刺与每个点刺共定位其他（顶部面板），以及大多数GFP-ULK1穿孔和mCherry-FIP200 puntate（底部面板），而在正常培养基中蛋白质显示扩散的细胞溶质染色模式（数据未显示）。因此，大量ULK1、ATG13和FIP200在氨基酸饥饿时的隔离膜，支持假说这三种蛋白质在一个复合物中相互作用。

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图3。

将ULK1定位到隔离膜需要ATG13和FIP200。 A类，ULK1在自噬时定位于隔离膜刺激。单独稳定表达GFP-ATG5的MEF细胞(顶部面板)或GFP-ATG5加上标记有FLAG-S的ULK1(底部面板)成长于玻璃盖玻片，然后在无氨基酸培养基中培养1小时，固定并进行免疫荧光处理。内源性成本ULK1型(红色)如所示顶部面板与GFP一起荧光(绿色)，同时用抗S标签染色（用于FLAG-S-ULK1）和GFP荧光显示在底部面板。B类，ULK1在ATG13和FIP200缺失细胞中的定位被破坏。左侧面板显示1h氨基酸保护的MEF细胞RNAi耗尽的蛋白质，用抗ULK1染色(绿色)和DAPI(蓝色，标记细胞核）。右侧面板显示相同的表达FLAG-S标记ULK1的衰竭MEF细胞，按照左边面板，但被防S标签污染(红色)检测标记的ULK1和DAPI(蓝色).

获得ULK1、ATG13和FIP200可以相互作用的确切证据我们直接进行了在体外结合分析使用Sf9细胞中产生的纯化重组蛋白(图2). 我们在ULK1中发现下拉分析，ULK1直接与FIP200和ATG13相互作用（T7-标记），独立或组合(图。2A类). 重要的是，将FIP200添加到绑定反应没有改变ATG13与ULK1相互作用的量副的反之亦然; ATG13也没有改变FIP200与ULK1的相互作用，表明ULK1在不同的位点与FIP200和ATG13相互作用。作为一个对照，T7标记的ATG10被包括在所有结合反应中，并且未能与ULK1相互作用(图。2A类，底部面板). 类似地，在ATG13下拉列表中ATG13还与FIP200和ULK1相互作用，无论是独立的还是在组合(图2B类).为了进一步研究ULK1、ATG13和FIP200是否形成三重复合物，我们使用纯化的重组蛋白进行凝胶过滤分析(图2C类). 单独使用ULK1在大约14和15馏分洗脱，与观察到的粒径相关良好在150 kDa的SDS-PAGE中，ULK1主要是缺乏其他蛋白质。ATG13单独洗脱，对应于馏分15和16，表示单体或可能是同二聚体缺乏其他蛋白质。FIP200单独在分数10左右洗脱。鉴于FIP200的表观分子量为～200 kDa，FIP200可能是不含其他蛋白质的同低聚物。重要的是，当所有三个蛋白质一起孵育并通过凝胶过滤分解含有这三种蛋白质的大分子复合物在分数9和10。根据凝胶过滤分析这个蛋白质复合物的分子质量可能超过100万道尔顿(图2C类，顶部面板). 然而，由于凝胶过滤分离是基于分子形状而不是质量，需要在未来精确测量这种复合物的分子质量。它是有趣的是，当一起培养时，ULK1和ATG13的一部分被转换为分数13和14，可能反映了ULK1·ATG13复杂地层。

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图2。

ULK1、ATG13和FIP200形成一个大蛋白复合物。 A类，ULK1与ATG13和FIP200相互作用。所示的等摩尔量重组蛋白(U型，ULK1；如果，FIP200；13，ATG13）在室温下一起孵育1小时ULK1与抗ULK1 IgG的沉淀。洗涤后，结合蛋白质用所示抗体进行免疫印迹。B类，ATG13与ULK1和FIP200相互作用。结合分析按照A类，但使用抗T7抗体沉淀T7标记的ATG13然后洗涤并用免疫印迹法分析结合蛋白。C类，ULK1、ATG13和FIP200形成一个大的蛋白质复合物。这个指示的蛋白质单独培养或在凝胶后混合培养在Superose 6色谱柱上过滤。所示馏分经过用相关抗体进行免疫印迹。凝胶过滤位置分子量标准(兆瓦)显示在顶部.

ULK1功能需要ATG13和FIP200-作为所有三个蛋白质可以在复合物中相互作用，我们研究了这两者是否ULK1功能正常需要FIP200和ATG13。我们首先看了ULK1在自噬刺激下的定位。ULK1以前显示在氨基酸饥饿时局限于隔离膜(25). 我们在此确认，通过显示内源性ULK1和F/S标记的ULK1从细胞溶质转移氨基酸饥饿、镜像、，几乎准确地说，GFP-ATG5本地化(图。三A类)而ULK1和ATG5均表现出扩散性，正常生长条件下的细胞溶质染色模式（数据未显示）。它可能只需要ULK1的两个绑定伙伴中的一个饥饿时其细胞移位。然而，我们发现ATG13或FIP200阻断内源性ULK1或F/S-ULK1的定位MEF细胞中的隔离膜(图3B类，比较中间的和底部面板具有顶部面板).因此，包含FIP200和ATG13的完整ULK1复合体是ULK1在感应自噬时定位到隔离膜所需的信号。

除了ULK1本地化的规定外，FIP200和ATG13也可能刺激ULK1的激酶活性。因为我们已经产生了净化ULK1、ATG13和FIP200的重组蛋白可以明确评估Atg1/ULK1酶活性的调节在体外与酵母Atg1一样，ULK1的激酶底物为未知，因此我们使用MBP作为激酶底物。如果没有ULK1，仅ULK1时，ATG13或FIP200不能磷酸化MBP（数据未显示）导致适度的MBP磷酸化(图。4A类). 重要的是，添加重组ATG13在缺乏FIP200和ATG13剂量依赖性。同样，仅FIP200也能刺激在缺乏ATG13的情况下，ULK1的激酶活性。两者的存在ATG13和FIP200导致ULK1活性的额外刺激(图4B类). 因此，最大ULK1激酶活性需要ATG13和FIP200在里面体外.

我们还获得了支持ATG13和FIP200增强ULK1的激酶活性。ULK1自动磷酸化之前已报告(25，30，32)，并由确认我们在表达ULK1的293T细胞中的实验表明激酶活性位点（K46R）或ATP结合囊（M92A）。两种突变体SDS-PAGE显示出比野生型ULK1和磷酸酶更快的迁移处理将野生型ULK1转换为更快的迁移带（参见补充图S2B类和数据未显示）。将其用作读数，我们评估了两种ATG13中ULK1的细胞自磷酸化活性-和FIP200耗尽的MEF细胞，并可重复地发现ULK1迁移更快在ATG13-或FIP200缺失细胞中，比在对照缺失细胞中(图4C类). 这样更快迁移与自噬刺激条件无关，但在氨基酸缺乏的细胞中尤其明显(图4C类，比较车道3和4具有7和8和车道11和12). 因此，ULK1激酶活性似乎是ATG13和FIP200缺失细胞受损，支持在体外这两种蛋白都是ULK1最大激酶活性所必需的数据。它是有趣的是，ATG13和FIP200缺失细胞中的ULK1水平是相对于对照缺失细胞减少(图4C类，中间面板). 之前已经表明，ULK1在FIP200耗尽细胞(25),现在似乎还需要ATG13，这支持了我们的假设ULK1存在于ATG13和FIP200的复合体中，并且适当的ULK1稳定性需要复杂地层。

虽然对于理解Atg1/ULK1如何介导自噬至关重要反应，其生理底物仍然未知。在本研究中，我们获得的证据表明FIP200是ULK1的底物（补充图S2）。在缺乏ULK1的细胞中，内源性FIP200迁移速度更快与对照完成的细胞相比，SDS-PAGE中的形式表明脱磷形式的FIP200（补充图S2A类). 此外，FLAG标记的ULK1在293T细胞中的过度表达与Myc-tagged FIP200导致FIP200迁移速度较慢（补充图S2B类). mycFIP200大小的增加取决于ULK1激酶活性，如激酶表达受损的K64R或M92A ULK1突变体未能修饰mycFIP200（补充图S2B类). 此外，用磷酸酶处理细胞裂解物可将mycFIP200大小降至在非ULK1-过表达细胞中观察到的水平（补充图。S2系列C类). 最后，重组ULK1可以磷酸化FIP200，以及ATG13，在体外（补充图S2D类). 应该注意到在自噬治疗后，我们无法观察到SDS-PAGE中的内源性FIP200。因此，FIP200磷酸化的作用自噬中的ULK1尚未确定。另一方面，这是可能的只有一小部分FIP200受到ULK1磷酸化的影响（因此迁移转移无法检测），因为FIP200显然是多功能蛋白质(33).

mTOR介导的ULK1复合物的调节磷酸化-我们发现ULK1存在于多个细胞中的磷酸化状态和自噬诱导导致ULK1移动性的提高(图。1A类，比较车道1具有2和三具有4; 图。​图4C类4C类和​和5C类).5C类). 如前所述如上所述，ATG13和FIP200缺失细胞中ULK1的迁移率增加（失去自身磷酸化），但在氨基酸饥饿时进一步增加(图4C类).重要的是，饥饿细胞提取物中ULK1的流动性也可以磷酸酶处理进一步增加，表明ULK1受多重磷酸化-去磷酸化过程(图5A类). 在添加，图1A类表明ATG13在SDS-PAGE凝胶中作为双链体运行自噬刺激的上带。事实上，这个ATG13上段是一个磷酸化形式作为磷酸酶处理细胞裂解物导致其消失(图。5B类). 在目前分析的所有真核生物中，TOR途径充当自噬的负调节器，并用雷帕霉素抑制TOR足以诱导自噬。在酵母中，已经证明处理雷帕霉素导致Atg13去磷酸化与自噬诱导密切相关。我们在哺乳动物细胞。氨基处理稳定表达GFP-ATG13的MEF细胞无酸介质或雷帕霉素导致GFP-ATG13和ULK1系列(图5C类). 这个表明mTOR参与哺乳动物的调节ULK1·ATG13·FIP200复合体，与Tor法规类似酵母Atg1·Atg13·Atg17复合物。我们始终发现野生型mTOR的过度表达导致ATG13的增加磷酸化(图。5D类; 比较车道1和2具有9和10). ATG13磷酸化的增加是因氨基酸饥饿或雷帕霉素治疗而废除(图5D类，车道3，4和5, 6分别）。正如预期的那样，ATG13的这一增长磷酸化依赖于mTOR激酶活性mTOR的kinase-dead形式导致ATG13上频带的丢失(图5D类，条车道8和9). 同样，初步数据也表明激酶活性mTOR过度表达可增加ULK1磷酸化（数据未显示）。因此ATG13和可能的ULK1是mTOR激酶途径的直接底物。

讨论

我们在这里描述了一个大的，哺乳动物自噬所必需的多蛋白复合物。这个综合体包括至少三种蛋白质：ULK1、ATG13和FIP200。各种线路在里面体外和体内这里提供的证据表明，这三个蛋白质以复合物的形式存在。(A类)所有三种蛋白质可以相互独立地进行交互，表示不同的、非竞争的结合。(B类)所有三种蛋白质都从同一凝胶过滤中洗脱分数仅当出现在一起时，表示它们是相同的大分子复合物。(C类)所有三种蛋白质在自噬刺激后的隔离膜。(D类)稳定性ULK1的丢失取决于FIP200和ATG13的存在一个结果是在稳定状态下ULK1水平降低。这种现象通常是用形成紧密的组成性相互作用的蛋白质观察一起。我们在ULK1中未检测到FIP200的任何显著丢失-或ATG13完成细胞；然而，FIP200被认为具有多重功能路径(33)，确实如此可能只有一小部分细胞FIP200与ULK1相互作用。最后(E类)最大ULK1激酶活性在体外只是当ATG13和FIP200同时存在时实现，表明在功能上，这三种蛋白质都是复合在一起的。

哺乳动物ULK1复合体与酵母Atg1的比较综合体-直到现在，人们还质疑哺乳动物系统关于Atg1/ULK1，自噬与酵母系统密切相关激酶。在酵母中，Tor激酶的抑制作用已经得到了很好的证实，通过营养饥饿或雷帕霉素治疗，导致Atg13的去磷酸化导致Atg1之间形成复合物，附件13和附件17。这种复合物的形成会刺激Atg1激酶活性，这被认为是Tor信号传导的机制控制自噬(19). 在哺乳动物细胞ULK1被发现是Atg1的酵母对应物(23)但没有Atg13的同源物或者Atg17很容易从序列数据库中识别出来，这表明哺乳动物ULK1在自噬中的功能可能与酵母Atg1。随着FIP200作为ULK相互作用蛋白的发现对自噬至关重要(27),尽管百分比序列与酵母Atg17相似身份非常低(25，27). 我们和其他人(30)，现已确定哺乳动物ATG13。我们在此进一步表明，该蛋白与FIP200相互作用以及ULK1，提供了令人信服的证据ULK1·ATG13·FIP200复合物相当于酵母Atg1·Atg13·Atg17复合物。

酵母Atg1和哺乳动物之间存在一些显著差异ULK1系统。首先，在酵母中，人们认为Atg13触发了Atg1·Atg13·Atg17复合物的形成，而在哺乳动物细胞中，ULK1·ATG13·FIP200复合物是在自噬诱导之前已经形成。我们看不到增长诱导形成ULK1·ATG13·FIP200复合物尽管看到ATG13去磷酸化，但氨基酸饥饿导致自噬（请参见图1A类). 的确，ULK1可以将磷酸化和去磷酸化形式的ATG13与类似程度（未显示）。我们还注意到，ULK1在类似于ATG13的方式。雷帕霉素治疗或饥饿会导致ULK1和ATG13的去磷酸化。此外活性mTOR降低293T细胞内源性ULK1的迁移率。以前在酵母中观察到Atg1的去磷酸化刺激自噬，尽管这是由于失去自动磷酸化(16). 我们现在表明这依赖于TOR途径，至少在哺乳动物中是这样，并且可能作为ATG13之外的另一个级别的监管去磷酸化。当ULK1和ATG13在氨基上脱磷酸时酸饥饿或雷帕霉素治疗，我们建议这就是事件，而不是复杂结构的形成哺乳动物细胞中的自噬。值得注意的是饥饿/雷帕霉素诱导的ULK1和ATG13去磷酸化发生在细胞耗尽了各自复杂的结合伙伴（图。​（图1A类1A类和​和4C类),4C类)，表明定位到隔离膜，在这些细胞中被抑制，在脱磷之后。雷帕霉素治疗对ULK1和ATG13的去磷酸化，我们建议像酵母系统一样，在正常生长条件下，mTOR磷酸化并抑制ULK1激酶复合物从而提供mTOR途径控制的机制高等真核生物中的自噬。其次，似乎没有一种蛋白质桥接ULK1·ATG13·FIP200复合体之间的相互作用。在酵母中，有人提出Atg1和Atg13之间的相互作用是由Atg17介导，如第17天Δ电池Atg1和Atg13未能通过联合IP进行交互(17，18). 在这里，我们可以在如果没有FIP200，ATG13仍可以以与对照相似的量联合IP ULK1同样，在没有ULK1的情况下，ATG13仍然可以与IP FIP200共存。更多重要的是，我们证明了在体外使用纯化、重组ULK1、ATG13和FIP200中任意两种可以相互作用的蛋白质独立于第三种蛋白质。

这些结果使我们得出了ULK1激酶复合物，与自噬有关。主要功能之一ATG13和FIP200的作用是调节ULK1激酶的活性：两者都可以单独进行因此，在没有另一种刺激的情况下，最大限度地刺激ULK1活性两者都需要。另一方面，ULK1需要ATG13和FIP200定位到隔离膜上，如果没有其中任何一个，则会阻止ULK1的正确定位。因此，它似乎是ULK1·ATG13·FIP200复合物对自噬诱导至关重要ULK1易位。此外，适当的复合物形成似乎是对ULK1蛋白稳定性很重要。

如果ATG13和FIP200的明确功能是刺激ULK1激酶活动，那么显而易见的、长期存在的问题是ULK1的生理底物及其后果磷酸化？这里介绍的工作使我们更接近于以下问题的答案这些问题。首先，ULK1不仅可以磷酸化ATG13和FIP200在体外而且ULK1可以磷酸化单元格中的FIP200（补充图S2）。我们目前正在进行识别ULK1磷酸化的FIP200和ATG13上的位点以确定它们对自噬的功能意义。其次，获得最大ULK1激酶活性，ATG13和FIP200都需要存在，而这两个蛋白可能参与ULK1底物的募集。因此，任何在体外ULK1基板的屏幕需要使用完整的ULK1·ATG13·FIP200复合物增加发现的机会生理相关底物。

补充材料

致谢

笔记

^*这项工作得到了National的全部或部分支持卫生研究院拨款R01CA113890（至X.J.）。

^S公司⃞本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图S1和S2。

脚注

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