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.2008年8月25日；182(4):685-701.
doi:10.1083/jcb.200803137。

富含磷脂酰肌醇3-磷酸并动态连接到内质网的膜室形成自噬体

伊丽莎白·L·阿克斯 1, 西蒙·沃克, 玛丽亚·马尼瓦瓦, 普丽亚·钱德拉, H卢埃林·罗德里克, 安贾·哈伯曼, 加雷思·格里菲斯, 尼古拉斯·蒂斯塔基斯
附属公司

富含磷脂酰肌醇3-磷酸并动态连接到内质网的膜室形成自噬体

伊丽莎白·L·阿克斯等人。 J细胞生物学. .

摘要

自噬是指细胞溶质和细胞器被称为自噬体的双膜小泡吞噬。已知自噬体的形成需要磷脂酰肌醇3-磷酸（PI（3）P），并且发生在内质网（ER）附近，但其确切机制尚不清楚。我们发现，双FYVE结构域蛋白1是一种PI（3）P-结合蛋白，在内质网和高尔基体膜上具有异常定位，在氨基酸饥饿的反应下，易位到与自噬体蛋白部分共定位的点状隔室。移位取决于Vps34和beclin函数。其他靶向内质网的PI（3）P结合探针显示出同样的饥饿诱导易位，这依赖于PI（3P的形成和识别。实时成像实验表明，这种点状小室在含有Vps34的小泡附近形成，与内质网处于动态平衡状态，为自噬蛋白质的积累、自噬膜的扩张和完全形成的自噬体的出现提供了一个膜平台。这种富含PI（3）P的小室可能参与自噬体的生物发生。其与内质网的动态关系与内质网可能为自噬体的形成提供重要成分的观点一致。

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数字

图1。
图1。
DFCP1中ER靶向结构域的鉴定和部分表征。（A） DFCP1的连续截断确定了一个内部域，这对于在ER中指定本地化是必要的，也是足够的。ER本地化需要用红色和下划线表示的残留物。（B） GFP-[416–543]结构定位于HEK-293细胞中的内质网，而该结构域内的突变体（此处显示的是W543A结构）是细胞溶质的。如图所示，在ER靶向中重要的选定残基也在全长蛋白中被诱变。全长DFCP1（myc-DFCP1）定位于ER，而DM（myc-dmDFCP1。关键残基的突变导致细胞质重新分布（此处显示为W/A突变）。所有样本均含有钙连蛋白（CLNX）抗体，钙连蛋白是一种内质网蛋白。（C） 将416–543结构域的WT或W/A突变体纯化为GST融合蛋白（输入），并与大鼠肾脏微粒体混合。结合材料通过离心回收。注意，野生型衍生蛋白与微粒体结合，而W/A突变体则没有。（D） 在用GST-[416-543]结构域孵育和离心之前，用指示单位的胰蛋白酶在冰上处理C中的微粒体。注意，微粒体上发现的外周蛋白β-COP几乎完全被胰蛋白酶消化；在这些条件下，DFCP1片段与微粒体的结合没有改变。
图2。
图2。
饥饿诱导的和PI（3）P依赖的DFCP1向点状结构的易位，部分与自噬体共定位。（A） 表达WT DFCP1或DM的细胞的裂解液用与PI（3）P偶联的亲和凝胶珠培养；WT DFCP1与PI（3）P结合，而DM没有。in，输入的5%。（B） 表达WT DFCP1或DM的稳定HEK-293细胞系未经处理或缺乏氨基酸90分钟。然后固定细胞并对其进行DFCP1染色。正常情况下，WT和DM DFCP1都局限于ER/Glgi；饥饿后，只有WT易位为点状结构。（C） 如DFCP1固定和染色前所示，稳定表达WT DFCP1的HEK-293细胞单独饥饿或在3-甲基腺嘌呤（MA）或沃特曼（麦芽）存在下饥饿。（D） 表达DFCP1的饥饿HEK-293细胞与内质网标记物（如calnexin和KDEL）共染。（E） 用GFP-MAP-LC3转染稳定表达WT-DFCP1的HEK-293细胞，并饥饿90分钟。请注意，在表达WT DFCP1的细胞中，MAP-LC3和DFCP1在饥饿时都易位到点状结构，其中一些是共定位的。棒材：（A–C和E）20μm；（D） 0.5微米。
图3。
图3。
FYVE结构域在依赖PI（3）P的途径中与内质网易位外周连接到饥饿诱导的点状结构。（A） 来自FENS-1的GFP-FYVE结构域与PI（3）P-偶联的脂珠结合，而DFCP1的GFP-ER靶向结构域显示出很少的结合（前四个通道；输入的5%；3P，与PI（3）P-偶联的珠结合的部分）。FENS-1 FYVE结构域融合到DFCP1的ER结构域（GFP-ERFYVE*）的构建物维持PI（3）P结合，而FYVE-结构域中点突变的构建物（GFP-ERFYVE**）的结合明显减少。（B） 表达A中所示四种结构的稳定细胞系在固定和荧光显微镜检查前未经处理或饥饿45分钟。请注意，GFP-ERFYVE结构在饥饿时转移到点状结构。（C） 将表达GFP-ERFYVE的细胞单独饥饿或在所述的沃特曼宁或BFA存在下饥饿。（D） 表达GFP-ERFYVE并饥饿45分钟的细胞要么使用KDEL抗体进行ER复染（顶部），要么与mRFP-MAP-LC3共转染（底部）。请注意，GFP-ERFYVE点状结构经常位于ER上，并显示与LC3部分共定位。右侧面板显示了左侧装箱区域的放大视图。棒材，10μm。
图4。
图4。
ER-anchored FYVE结构域在依赖PI（3）P的途径中转位到饥饿诱导的点状结构。（A） 三个基于GFP的构建物装配有一个连接区、一个跨膜结构域（TM）和一个短的细胞质尾部：GFP单独（GFP-TM）、GFP融合到FENS-1的WT FYVE结构域（GFP-TM-FYVE），以及GFP融合至无法结合PI（3）P（GFP-FYVE*-TM）的FENS-1 FYVE-结构域的点突变。所有三种构建体都在HEK-293细胞中瞬时表达，并在氨基酸饥饿或不饥饿的情况下检测它们的定位60分钟，如图所示。请注意，GFP-TM-FYVE在饥饿期间易位到点状结构。（B） 用GFP-FYVE-TM和mRFP-LC3转染HEK-293细胞，并饥饿60分钟。注意，两名报告人的点状细胞共定位，GFP结构经常环绕mRFP-LC 3膜（箭头所示）。总的来说，细胞中GFP-FYVE-TM比mRFP-LC3点多，平均80%的LC3点与GFP-FYVE-TM颗粒共定位。插图显示了装箱区域的放大视图。（C） HEK-293细胞共存GFP-FYVE-TM和dsRED-ER并饥饿60分钟的实时成像。另请参阅视频1（可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1). （D） C（底部中间，方框）中显示的区域在饥饿期间展开并显示28-40分钟。注意环状粒子的形成和坍塌。箭头标记处于早期阶段的粒子。棒材：（A–C）20μm；（D） 1微米。
图5。
图5。
表达GFP-DFCP1的稳定HEK-293克隆的分离和鉴定。（A） 筛选了四个克隆以检测GFP-DFCP1的表达（插图显示了内源性DFCP1和GFP-DFCP 1的印迹，以β-COP作为负荷控制；标记的DFCP1在内源性DFCP 1上的过度表达也显示了折叠），并通过GFP-MAP-LC3向点状结构的易位来检测饥饿的良好反应（如图所示）或获得内源性LC3-II形式（插图的最后一条车道）。高水平的DFCP1抑制饥饿反应（克隆206尤其明显）。误差条显示了三个独立实验的标准偏差。（B） 如图所示，克隆201细胞未经处理或在没有或存在沃特曼（wortmannin）或BFA的情况下饥饿45分钟，并通过荧光显微镜检查GFP-DFCP1的分布。注意，沃特曼抑制易位，而BFA则没有作用。（C） 用抗Vps34或beclin-1的siRNA或如图所示的对照siRNA处理克隆201细胞，饥饿60分钟，并用荧光显微镜检查。注意，Vps34和beclin-1减少的细胞中点状结构水平降低；这是针对D中的三个独立实验进行分析的（误差条显示标准偏差）。（D，插图）siRNA处理后Vps34和beclin-1的水平。这项工作的外围关注点是，在beclin-1的siRNA治疗期间，Vps34的减少是可重复的。（E） 克隆201细胞饥饿60分钟。成像速度为每20秒1帧，显示整个序列中选定的帧。另请参阅视频2（可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1). （F） 对于选定的时间间隔（大约在饥饿后35分钟开始），显示了一个显示omegasome形成和崩溃的序列（箭头）。棒材（A–C和E）20μm；（F） 2微米。
图6。
图6。
通过活体成像和固定细胞中含PI（3）P的ω体和内质网和自噬体的关系。（A） 用mRFP-MAP-LC3（红色）和CFP-ER（蓝色）转染克隆201细胞并饥饿60分钟。以每10秒1帧的速度进行成像，并显示此序列中的选定间隔，从饥饿后33分钟开始。箭头表示首次出现可识别的ω体（绿色）和自噬体（红色）。放大的面板来自两个方框区域，按顺序表示（1）ER、（2）DFCP1、（3）MAP-LC3、（4）ER-MAPLC3、（5）DFCP1-MAPLC3和（6）MAPLC3-ER的视图。另请参阅视频3（可从http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1). （B） 利用TIRFM成像研究ω和ER的动态关系。注意，ω在含有ER的区域形成并在那里崩塌。另请参阅视频4。（C） 饥饿45分钟后解冻克隆201细胞冰冻切片，并双重标记抗GFP-DFCPI（箭头，10纳米金）和抗PDI（箭头、5纳米金）。请注意，在PDI标记的内质网膜附近，标记有DFCPI-GFP的自噬样空泡（星号）。这是多面板补充图的一个面板（图S4）。（D） 从GFP-DFCP1和mRFP-MAP-LC3在饥饿期间的实时成像中选择的帧，由此形成中间产物，其中MAP-LC3似乎从omegasome发芽，同时仍被DFCP1染色膜勾勒出来。每块面板的底部都是这些结构的线条图，使用了相关框架的放大照片。另请参阅视频6。（E） 利用外源性应用的PI（3）P-结合蛋白对ω体进行结肠化。克隆201细胞饥饿60分钟，用硝化纤维素穿孔，并用纯化的p40的GST-PX结构域染色凤凰（phox）大多数GSP-PX结构域对早期内体进行染色（未描述），但大量蛋白质也与DFCP1 omegasomes（F和G）结合。（F和G）ω体与自噬蛋白和ER的关系。如图所示，克隆201细胞用内源性ER和内源性MAP-LC3或Atg5抗体反染。放大面板1-5中显示了从这些细胞中选择的示例（除了显示的示例外），其中ER位于单层中，并且从胞浆中很好地分离出来，以便评估共定位。棒材：（A、B和D）1μm；（E–G）20μm。
图7。
图7。
欧米伽马体退出后的自噬体成熟。表达GFP-DFCP1和mRFP-MAP-LC3的细胞在指定的时间间隔内饥饿并成像。饥饿后30分钟，细胞也与2μM MDC孵育。请注意，自噬体首先从欧米伽小体中出现（标记为自噬小体形成的面板；箭头表示欧米伽小体），然后开始用MDC染色（标记为自吞噬小体成熟的面板），但似乎没有改变其外观或与另一个MDC阳性囊泡融合。
图8。
图8。
omegasome形成期间的Vps34动力学。（A） 用mRFP-Vps34转染克隆201细胞，选择一个稳定的群体表达这两种蛋白（最后三个通道）。注意，外源性mRFP-Vps34与内源性Vps34相当，并且在氨基酸饥饿期间是稳定的。（B） 将A中的细胞饥饿60分钟，固定，并染色Lamp-2。请注意，DFCP1点状结构经常靠近Vps34膜（左下角箭头所示），大多数但不是所有的Lamp-2囊泡（～80%）与Vps34共定位，而所有的Vps34囊泡与Lamp-2共定位（右下角箭头表示缺乏Vps34的Lamp-2-囊泡示例）。（C） 从mRFP-Vps34在细胞中的实时成像中选择的帧也表达CFP-ER。请注意，Vps34囊泡始终靠近ER，并且经常使用ER链进行远距离移动（底部箭头）。时间指的是氨基酸饥饿后的时期，但在没有饥饿的情况下，类似类型的运动也很明显。（D和E）氨基酸饥饿期间mRFP-Vps34、GFP-DFCP1和CFP-ER实时成像的选定帧。（D） 在Vps34粒子附近形成的欧米伽玛体。棒材，1μm。对于此视频的选定帧，如图所示（10–12和35–37），E显示了Vps34与DFCP1（顶部）、Vps34和ER（中部）以及所有三个帧（底部）的关系。另请参阅视频7（可从http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803137/DC1). （F） 另一个来自实时成像实验的示例显示，在Vps34粒子附近形成了一个欧米伽玛体。
图9。
图9。
ω体在自噬体生物发生中的潜在作用。我们的假设是，在氨基酸饥饿期间，含有Vps34的小泡与ER相互作用，并在与ER相连的膜上形成PI（3）P（步骤1，绿色）。该膜域与自噬体蛋白（红色）结合，形成一个混合膜域，该混合膜域继续扩张，但与外部的PI（3）P和内部的自噬细胞膜保持空间分离（步骤1和2）。注意，该膜与ER的连接未完全显示，因此连接处有问号。一旦omegasome达到其最大尺寸，自噬体膜向内出芽（步骤2和3），产生完全形成的双膜自噬体（步骤4）。步骤3中间的PI（3）P外膜可能有助于融合反应。向内芽接将允许自噬体摄取细胞质物质和/或自噬体内的细胞器。在步骤2、3和4的底部，我们绘制了相关结构的剖切图，以指示双层的几何结构。
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中的注释

  • 从与ER相关的杯子中自食其力。
    Simonsen A，Stenmark H。 Simonsen A等人。 细胞生物学杂志。2008年8月25日；182(4):621-2. doi:10.1083/jcb.200807061。 细胞生物学杂志。2008 PMID：18725534 免费PMC文章。

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