来自基底膜的胶原蛋白α3（IV）的NC1结构域调节支持细胞血-测试屏障动力学

哺乳动物重组Colα3（IV）NC1结构域蛋白的制备

由于发现TNFα诱导MMP-9，导致Col IV裂解生成NC1结构域(图1)这些发现与早先的报告一致，即Col IV是MMP-9的假定底物。^38,39此外，如在其他上皮细胞中所示，源自这种切割的NC1结构域被发现具有生物活性，能够调节细胞粘附、细胞增殖和凋亡；²⁵因此，我们试图检查NC1结构域是否对BTB具有任何生物学作用。以往的研究表明，Colα3（IV）是生精小管基膜表达的主要链之一。^30,32因此，我们尝试使用细菌细胞产生重组Colα3（IV）NC1结构域，该结构域被纯化到明显的同质性，如图2A.发现细菌中产生的重组Colα3（IV）NC1的溶解度和产率较差，这可能是由于大肠杆菌尽管如此，我们通过用培养在Matrigel-coated双室单元上的细胞对支持细胞上皮的TER进行定量，测试了该重组蛋白破坏支持细胞BTB的能力(图2B). 也许是由于重组NC1结构域蛋白缺乏糖基化，使其调节BTB功能的效率降低，我们在多个实验中没有观察到TJ通透性屏障的统计显著性破坏，其中一个实验如本文所示(图2B). 这些发现还表明，重组Colα3（IV）NC1结构域蛋白在大肠杆菌根据三个单独的实验，不同批次的纯化NC1蛋白没有生物活性。接下来，我们在哺乳动物293T细胞中生产重组Colα3（IV）NC1结构域蛋白。使用如图所示的引物，在Colα3（IV）NC1结构域的5′末端对BM40信号肽（SP）和Flag标签进行基因工程表2并在材料和方法中进行了描述。SP的存在允许将重组蛋白分泌到条件培养基中，而Flag标签通过使用反Flag M2琼脂糖珠促进其纯化。使用这种基于在条件培养基中获得的分泌重组蛋白的方法与使用细胞裂解物的方法相比，也提供了处理可溶性蛋白的优势，而不是处理由大肠杆菌系统。在使用抗Flag M2树脂进行亲和层析后，重组Colα3（IV）NC1蛋白被纯化至考马斯兰染色凝胶显示的明显均匀性(图3A). 纯化的蛋白质被抗旗帜抗体识别(图3B)和抗Colα3（IV）NC1抗体(图3C)(表1).

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图2。重组Colα3（IV）NC1蛋白在细菌中的表达、纯化及其对Sertoli细胞TJ-通透性屏障功能的影响。(A类)BL21（DE3）合格大肠杆菌用0.1 mM IPTG诱导pET46 Ek/LIC-Colα3（IV）NC1载体转化的细胞表达重组蛋白。当将未诱导的总细胞蛋白（TCP）与诱导的总细胞蛋白（TCP）进行比较时，注意到Colα3（IV）NC1结构域（28kDa）的强表达，如代表性考马斯蓝染色凝胶（a:a）所示。Ni纯化重组蛋白²⁺-重组蛋白N末端的组氨酸（His，H）标记与Ni-column特异性结合的Sepharose色谱法。洗脱后的蛋白质被纯化到明显的同质性（A:b），并被抗-His（A:b）和抗Colα3（IV）NC1抗体（A:c）识别（参见表1). (B类)原代Sertoli细胞在1.2×10⁶细胞/厘米²在时间0时，在Matrigel-coated双腔装置上，以允许组装功能性TJ-渗透屏障。如材料和方法中所述，将纯化的细菌Colα3（IV）NC1重组蛋白重新折叠并针对PBS进行透析，并在第2天将其以30μg/ml（~1µM）的浓度包含在F12/DMEM培养基中。与PBS对照组（Ctrl）相比，观察到Sertoli细胞BTB轻度但无统计学意义的扰动(图2B). 培养2天后去除细菌重组Colα3（IV）NC1蛋白。每个数据点有n=3个两院制单位。使用不同批次的Sertoli细胞和重组蛋白重复此实验三次，得到了类似的结果。

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图3。在哺乳动物细胞中生产重组Colα3（IV）NC1结构域蛋白。从Lenti-X 293T哺乳动物细胞中稳定转染的pTracer-CMV2-Colα3（IV）NC1表达重组Colα3（Ⅳ）NC1结构域蛋白。收获无血清条件培养基，并使用抗Flag M2树脂纯化Colα3（IV）NC1结构域。重组Colα3（IV）NC1结构域蛋白在亲和层析洗脱的组分2和组分3中检测到，当用考马斯蓝染色SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析其纯度时，一步纯化到明显的均匀性(A类)以及使用反标记进行免疫印迹(B类)和抗Colα3（IV）NC1抗体(C类). 这些发现是使用不同批次重组蛋白的三个不同实验的代表性数据，不包括建立最佳条件的中试实验，在2年的时间内得出了类似的结果。

抗Colα3（IV）NC1结构域抗体的产生

使用pET30 Ek/LIC载体试剂盒在BL21（DE3）细菌（EMD Millipore）中产生重组Colα3（IV）NC1结构域。以90日龄大鼠睾丸cDNA为模板，通过5′-GACGAGACAGAGAGAGACACAGAGATAGAGAGAGGCTTCATTCA-3′和5′-GAGGAGAGCCCGGTGTCTTTTTCTTCACACCTGA-3′反义引物扩增Colα3（IV）NC1结构域。这对应于大鼠全长Colα3（IV）（NM_001135759）的4321–5010 nt，即NC1结构域。由于载体中存在帧内终止密码子，原始全长序列中的终止密码子被省略。重组蛋白表达的纯度大肠杆菌亲和层析分离得到的菌株经SDS-PAGE鉴定，凝胶经考马斯蓝染色~使用200µg用弗氏完全佐剂乳化的纯化蛋白免疫一只雌性新西兰白兔，然后注射两次用弗氏不完全佐剂乳制的纯化蛋白（每个200µc）。此后约4周采集血液（约20–50 ml），然后在约10周内每10天采集一次。通过离心获得血清（2000克，10分钟，4°C，两次）。通过硫酸铵沉淀和DEAE亲和层析分离IgG。⁶¹

细菌产Colα3（IV）NC1结构域重组蛋白的纯化

使用pET46 Ek/LIC表达载体（EMD Millipore）在细菌中产生Colα3（IV）NC1。以pET30 Ek/LIC-Colα3（IV）NC1为模板，分别用5′-GACGAGACAGAGACACAGAGAGAGAGGCTTCATTCA-3′和5′-GAGGAGAGCCCGGTTAGTGTTCTTCATGCACA-3′的正、反义引物扩增Colα3（Ⅳ）NC1编码序列。pET46 Ek/LIC-Colα3（IV）NC1的真实性通过直接核苷酸测序（在Genewiz）确认，并转化为BL21（DE3）（EMD Millipore）用于重组蛋白生产。使用5 ml过夜细菌培养物接种500 ml LB，补充100µg/ml羧苄青霉素（生命科技）。允许细菌生长，直到OD600达到~0.65，并使用0.1 mM异丙基β-D-1硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在37°C下诱导生产重组蛋白3.5小时。在6000×g 10分钟下收获细菌。在包涵体（不溶性部分）中发现所有细菌表达的Colα3（IV）NC1。根据制造商协议，使用BugBuster Plus Lysonase试剂盒（EMD Millipore）溶解细菌并提取包涵体。使用6M胍HCl、0.1M NaH2PO4和10mM TRIS HCl（pH 8.5）来溶解包涵体。镍²⁺-使用Sepharose高性能树脂（GE Healthcare）在填充柱（Bio-rad）中纯化组氨酸（His）标记的Colα3（IV）NC1结构域。为了清洗树脂，使用8 M尿素、0.1 M NaH2PO4和10 mM TRIS-HCl（pH值为8）中的咪唑（10 mM和25 mM）。Colα3（IV）NC1结构域用250 mM咪唑、8 M尿素、0.1 M NaH2PO4和10 mM TRIS-HCl洗脱，pH为8，并根据Gu等人。⁶²简单地说，针对尿素浓度的降低对洗脱蛋白进行透析：1）4 M尿素、0.1 M氯化钠和20 mM TRIS-HCl，pH值为6，在4°C下过夜；2） 2 M尿素、0.1 M氯化钠、2 mM还原谷胱甘肽、0.2 mM氧化谷胱甘苷、1 mM EDTA和20 mM TRIS-HCl，4°C下8小时pH值6.5，以及3）PBS（137 mM氯化钠，2.7 mM KCl，8.1 mM Na2HPO4和1.47 mM KH2PO4）在4°C条件下过夜，pH值7.4。

MMP-9对胶原（Col）IV的切割

小鼠MMP-9（EMD Millipore）首先通过在37°C下用0.5 mg/ml TPCK-胰蛋白酶（Thermo Scientific）在活化缓冲液（50 mM TRIS-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2和0.05%Brij-35，22°C时pH值7.5）中处理30分钟而被激活。此后，通过向活化缓冲液中添加抑肽酶（Sigma-Aldrich）（1 mg/ml）抑制胰蛋白酶活性。然后使用0.5µg活化的MMP-9消化10 g重组小鼠Col IV[BD Biosciences，来源于Engelbreth Holm Swarm（EHS）的斑细胞性小鼠肿瘤，这是基底膜的主要成分，在1M Tris的缓冲液中（22°C时pH 8），主要含有170–180 kDa的Colα3（IV）和α4（IV）链使用或不使用200 mM EDTA，在37°C下保持3小时。消化后的蛋白质通过SDS-PAGE进行解析，并通过免疫印迹法检测Colα3（IV）NC1。

哺乳动物细胞中重组Colα3（IV）NC1结构域的产生

以AccuPrime Pfx Taq（Life Technologies）和pET30 EK/LIC-Colα3（IV）NC1为模板，通过PCR构建携带大鼠Colα3（Ⅳ）NC1结构域的pTracer-CMV2（Life Technologies）表达载体。进行四个连续重叠PCR，在Colα3（IV）NC1编码序列的5′端添加大鼠BM40（NM_012656.1）信号肽（SP）和Flag序列，以允许细胞外分泌并帮助纯化。用于制备cDNA结构的引物序列列于表2.在37°C下用EcoRV和XbaI消化产生的DNA片段7小时，并在15°C下连接性连接到pTracer-CMV2过夜。DNA测序（Genewiz）证实克隆正确。pTracer-CMV2-Colα3（IV）NC1载体在37°C下通过ScaI线性化16 h。利用人胚胎肾细胞系Lenti-X 293T细胞（Clontech）生产重组Colα3（IV）NC1结构域蛋白。细胞保存在补充有10%FBS（Life Technologies）、3.7 g/L NaHCO3、1 mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素、100 g/ml链霉素、2 mM谷氨酸MAX和0.1 mM MEM非必需氨基酸（Life Technologies）的高糖DMEM中，pH 7.4，37°C，湿度为10%CO2/95%空气（v/v）。以4×10接种细胞⁴细胞/厘米²根据制造商的方案，使用Fugene HD试剂（Roche）将1g线性化DNA转染到12孔培养皿中（每个孔含有约4ml培养基）。转染后一天，将细胞以1:4的比例分割成100-mm的培养皿，并在培养基中加入600µg/ml的zeocin（Life Technologies）。每3天更换一次新鲜培养基，直到形成病灶。将单个菌落进行胰蛋白酶化，并在含有50µg/ml玉米毒素的12孔培养皿中培养。阳性克隆通过RT-PCR使用感观引物1和反感引物进行筛选(表2)以及荧光显微镜检测载体中的GFP标签。将Colα3（IV）NC1结构域表达最强的克隆扩增成三个150mm培养皿，生长至汇合处，并用无血清高糖DMEM替换。在生产重组Colα3（IV）NC1结构域的过程中，省略了玉米霉素。培养40小时后，收集上清液并在2000 g下离心10分钟以去除细胞碎片。使用反标记M2亲和凝胶（Sigma-Aldrich）纯化重组Colα3（IV）NC1结构域通过在实验室摇床（Clay Adams Nutator）中加入0.2 M NaCl，在4°C温度下将清澈的上清液与树脂孵育3小时，以减少非特异性结合。然后将树脂填充到Econo柱（Bio-Rad）中，用TBS（50 mM TRIS-HCl，150 mM NaCl，pH 7.4）洗涤，用0.1 M甘氨酸HCl洗脱的重组Colα3（IV）NC1结构域蛋白，pH 3.5。用1 M Tris中和洗脱后的蛋白，pH值为8，并在PBS中平衡（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4和1.47 mM KH2PO4，pH值7.4），通过SDS-PAGE使用考马斯蓝染色凝胶进行纯化，表观Mr为30 kDa。在2年内生产了四批重组蛋白，结果一致。

原始支持细胞培养

从20天大鼠睾丸中分离原代支持细胞，并在补充有胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子（EGF）和杆菌肽的无血清F12/DEM培养基中培养。⁴⁰这些支持细胞分化并停止分裂⁶³除非培养基中存在血清（例如5%的胎牛血清）。⁶⁴根据早期研究，这些细胞在功能上与成年大鼠睾丸分离的支持细胞无关。^65,66但在我们早期的研究中，从成人睾丸分离出的支持细胞的纯度仅为~85%^65,66与之前的报告一致。⁶⁷然而，当使用相应的特异性引物和/或针对这些细胞独特标记物的特异性抗体通过RT-PCR和/或免疫印迹法评估细胞污染物时，从20天龄大鼠睾丸分离的支持细胞纯度大于98%，生殖细胞和莱迪格细胞的污染可以忽略不计。^40,68因此，我们在实验中使用了来自20天大鼠睾丸的支持细胞。为了研究TNFα（R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州）或TGF-α3（Calbiochem-EMD Millipore）对MMP-9的诱导作用，将Sertoli细胞接种在8×10⁴或0.2×10⁶细胞/厘米²在6孔培养皿中（不含Matrigel），在F12/DMEM中加入其他补充剂，但不含杆菌肽，放置2天。在处理后2天收集支持细胞条件培养基和细胞裂解物。为了提取Sertoli细胞沉积的细胞外基质，将细胞接种在不含Matrigel的100毫米培养皿上，并按照前面所述进行处理⁶⁹稍作修改。简言之，用含有1 mM苯甲基磺酰氟和氨基己酸（1 mg/ml）的PBS清洗Sertoli细胞三次，然后用清洗缓冲液和5 mM EGTA在37°C下连续孵育15分钟，以去除所有Sertoli电池。用PBS单独进行三次清洗，去除剩余的细胞碎片，然后用三次双重蒸馏水清洗。添加400µl SDS样品缓冲液[0.125M Tris，pH 6.8，22°C，含1%SDS（w/v）、1.6%2-巯基乙醇（v/v）和10%甘油（v/v）]，并使用橡皮警察将盘子彻底刮干净。为了研究重组Colα3（IV）NC1结构域对支持细胞BTB功能的影响，将原代支持细胞接种于0.5×10⁶细胞/厘米²在Matrigel-coated 12孔培养皿上（用于制备蛋白裂解物）或1.2×10⁶细胞/厘米²在Matrigel-coated双腔装置上[用于跨上皮电阻（TER）测量]，以评估TJ-渗透屏障功能。对于细胞染色，支持细胞为4.5×10⁴细胞/厘米²接种在Matrigel-coated盖玻片上，使细胞核均匀分布，用Colα3（IV）NC1结构域重组蛋白处理后，可以通过双标记免疫荧光分析轻松评估BTB蛋白在Sertoli细胞-细胞界面的分布和/或定位变化。在细胞分离后2天添加PBS中的重组Colα3（IV）NC1结构域蛋白（30µg/ml，1 M）。PBS被用作车辆控制。治疗后2天（用于蛋白裂解物和细胞染色）或3天（用于TER测量以评估TJ功能）去除重组蛋白。

支持细胞TJ通透性屏障功能的评估

如前所述，通过定量穿过支持细胞上皮的TER来监测支持细胞TJ通透性屏障功能。^40,70第0天，将支持细胞接种在Matrigel-coated双腔单元上。在~2d内，支持细胞建立了功能性TJ通透性屏障，电镜下可见TJ、基底ES、缝隙连接和桥粒的超微结构，^71,72它在体内模拟了Sertoli BTB，该系统已被其他研究人员用于研究BTB调节。^46,73-78在第2天，以1µM（30µg/ml）的浓度将重组Colα3（IV）NC1结构域蛋白添加到两房单位的顶部和底部隔室。该浓度是根据中试试验选择的。每天替换F12/DMEM，直到第5天，当使用不含重组蛋白的F12/MMEM时，替换培养基中还包括Colα3（IV）NC1结构域蛋白。治疗组和对照组的每个时间点都有三个双腔单位。每个实验使用不同批次的支持细胞重复至少三次。

我们感谢夏伟良博士在制备本报告中使用的抗兔抗Colα3（IV）NC1抗体方面的协助。