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.2012年1月；64(1):16-64.
doi:10.1124/pr.110.002790。 Epub 2011年10月28日。

血睾屏障及其对男性避孕的影响

C严成 1, 多洛雷斯·D·姆鲁克
附属公司
审查

血睾丸屏障及其对男性避孕的意义

C严成等。 药理学修订版. 2012年1月.

摘要

血-睾屏障（BTB）是哺乳动物体内最严密的血-组织屏障之一。它将生精上皮分为基底区和顶端区（adluminal）。减数分裂I和II、精子生成和精子形成都发生在顶端隔室中BTB后面的特定微环境中，但精原细胞更新和分化以及细胞周期进展到精母细胞前体阶段发生在上皮基底隔室中的BTB之外。然而，BTB并不是一个静态的超微结构。相反，在第八阶段生精的生精上皮周期中，它经历了广泛的重组，以允许精原细胞在BTB转运。然而，在上皮周期中，BTB所赋予的免疫屏障不能被破坏，即使是暂时的，以避免产生针对减数分裂和减数分裂后生殖细胞的抗体。研究表明，一些不太可能的伙伴，即粘附蛋白复合物（例如，粘着蛋白-ZO-1、N-钙粘蛋白-β-连环蛋白、克劳丁-5-ZO-1）、类固醇（例如，睾酮、雌二醇-17β）、非受体蛋白激酶（例如，黏着斑激酶、c-Src、c-Yes）、极性蛋白（例如，PAR6、Cdc42、14-3-3），内吞囊泡蛋白（例如，网格蛋白、小窝蛋白、动态蛋白2）和肌动蛋白调节蛋白（例如Eps8、Arp2/3复合物）协同工作，显然受到细胞因子（例如，转化生长因子-β3、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1α）的总体影响。简而言之，在传递过程中，精母细胞后面会产生一个“新”的BTB，而传递细胞上方的“旧”BTB会适时退化，因此，当精母细胞穿过BTB时，可以保持免疫屏障。我们还讨论了有关环境毒物（如镉、双酚A）通过其在BTB的初始作用诱导睾丸损伤的分子机制的最新研究结果，从而导致生殖细胞丢失、精子数量减少和男性不育或生育能力低下。此外，我们还对睾丸药物转运蛋白研究领域的发现进行了批判性评估，并讨论了这些流入和流出泵如何调节潜在的非激素男性避孕药进入顶端室以发挥其作用。总的来说，这些发现说明BTB存在多个潜在目标，用于创新避孕药具开发和更好地提供药物，以缓解男性中毒诱导的生殖功能障碍。

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数字

图1。
图1。
BTB在成年哺乳动物睾丸生精上皮中的位置及其与精子发生过程中生殖细胞发育的生理关系。显微照片是成年大鼠睾丸的横截面，显示了生精上皮周期第V、VII和VIII晚期的三个生精小管（上皮周期的详细描述见图2）。绿色方框区域是生精上皮的一部分，放大后用下面的示意图表示，说明了支持细胞和生殖细胞之间的密切关系以及BTB的相对位置。注意到间质空间（in）中发现的产生睾酮（通过类固醇生成）和微血管（例如，微血管内的红细胞由两个绿色箭头表示）的莱迪格细胞（红色箭头）。BTB位于固有膜的基底膜附近，固有膜也将上皮分隔成基底和顶端（或管腔）隔室。BTB由共存的TJ、基底ES、桥粒和缝隙连接构成，其超微结构特征以肌动蛋白纤维束夹在内质网池和两个并列支持细胞（即基底ES）的质膜之间为典型图3所示的电子显微照片中可以看到此处所示。顶端ES也与基底ES具有类似的超微结构特征，只是夹在内质网池和对生支持细胞和伸长精子细胞的质膜之间的肌动蛋白纤维束（步骤8-19）受到限制只有至支持细胞（另见图2和图3中的显微照片）。如文中所述，心尖ES、BTB和半桥粒之间存在串音。这三个超微结构也形成了一个功能轴，在精子发生过程中调节和协调连接重组事件。比例尺，60μm。
图2。
图2。
成年大鼠睾丸的横切面，显示精子发生的生精上皮周期的某些选定阶段。此处显示的生精上皮周期的各个阶段是V（A）、VIII（B）、X（C）、XI（D）、XII（E）和XIV（F）阶段的小管。这里的切片是用苏木精和伊红染色的石蜡切片。在精子发生过程中，生精上皮（由支持细胞和生殖细胞组成）随着生殖细胞的发育而发生周期性变化，表现为精子细胞（紫色箭头，如顶体形成、尾部伸长）的形态和相对位置发生显著变化，圆形精子细胞（白色箭头）和精母细胞（红色和绿色箭头），在人类、小鼠和大鼠中分别可分为6、12和14个阶段（Leblond和Clermont，1952；Parvinen，1982；de Kretser和Kerr，1988；Hess，1990；Hess和de Franca，2008）。当立体显微镜监测小管的特定部分以确定这些物种从I期到XII期和从I期至XIV期的变化时，小鼠和大鼠的完整生精上皮周期分别需要～8.6天（Oakberg，1956）和～12.8天（Clermont等人，1959）才能完成。但由于精子发生的某些阶段，如A型精原细胞更新及其随后的分化，需要更长的时间才能完成，在使用[3H] 胸腺嘧啶或32P-胸腺嘧啶掺入（de Kretser和Kerr，1988）（表2）。在V期小管（A）中，伸长精子细胞的头部几乎与位于固有膜基膜附近的支持细胞核（黄色箭头）接触（绿色星号）。黄色箭头，支持细胞；蓝色箭头，B型精原细胞；灰色箭头，A1精原细胞；绿色箭头，粗线期精母细胞；白色箭头，步骤5精子细胞；紫色箭头，步骤17精子细胞。在第VIII期小管（B）中，细长的精子细胞在上皮细胞的腔缘排列，为精子释放做准备。黄色箭头，支持细胞；蓝色箭头，A1，精原细胞；红箭头，精母细胞早发；绿色箭头，粗线期精母细胞；白色箭头；第8步精子细胞；紫色箭头，步骤19精子细胞；橙色箭头，间质中的Leydig细胞。X期小管（C），黄色箭头，支持细胞；蓝色箭头，A2精原细胞；红箭头、精母细胞；绿色箭头，粗线期精母细胞；紫色箭头，步骤10精子细胞；橙色箭头，莱迪格细胞。XI期小管（D），黄色箭头，支持细胞；蓝色箭头，A2精原细胞；红箭头、精母细胞；绿色箭头，粗线期精母细胞；紫色箭头，步骤11精子细胞。XII期小管（E），黄色箭头，支持细胞；蓝色箭头，A2型精原细胞；红箭头，合子精母细胞；绿色箭头，粗线期精母细胞；紫色箭头，步骤12精子细胞。在XIV（F）期，发生减数分裂I和II，可以看到减数分裂Ⅰ产生的两个次级精母细胞（红色星号）；也可以看到减数分裂II末期产生的两个第1步精子细胞（蓝色星号）。黄色箭头，支持细胞；蓝色箭头，A3精原细胞；绿色箭头，早期粗线期精母细胞；紫色箭头，第14级精子细胞；橙色箭头，莱迪格细胞。比例尺，25μm（A–F）。
图3。
图3。
哺乳动物睾丸生精上皮周期中血睾屏障（BTB）的细胞、功能和超微结构特征。A、 如图A所示，在三个相邻的生精小管中的每一个都发现了一个完整且功能正常的BTB，其中FITC(M（M）第页389.39）通过颈静脉给成年大鼠（约300 g b.wt.）注射时，无法通过位于固有膜基底膜附近的BTB（见折断的白线）进入每个小管的顶端室（见白色支架），即使FITC穿过了间质空间微血管中的TJ屏障（见白色箭头所示间质中的绿色荧光）（a）。在右侧面板中，这只大鼠接受了氯化镉治疗2在颈静脉给药FITC之前，（3 mg/kg体重）连续3天（b），这会破坏BTB的完整性。由于FITC“自由”进入顶端隔室，到达生精小管的管腔（见白色括号），睾丸横截面上的三个小管中的BTB均被破坏。标尺，50μm（a和b）。B、 BTB的解剖。在a中，这是一张电子显微照片，显示了BTB的典型超微结构特征，BTB由位于基底膜上的两个相邻支持细胞（黄色星号）产生。这里显示的是基础ES，其典型特征是肌动蛋白纤维束（绿色箭头）夹在内质网池（ER）和两个支持细胞（红色箭头）的并置质膜之间，TJ（黄色箭头）与基础ES共存。在b中，桥粒（用蓝色箭头表示），这也是BTB的组成部分，其典型特征是沿着两个相邻的Sertoli细胞存在电子致密物质，并且由于桥粒是一种基于中间基的细胞-细胞锚定连接类型，因此缺乏独特的肌动蛋白纤维束。在c中，电子显微照片显示了围绕着这个伸长精子细胞头部的顶端ES，其中肌动蛋白纤维束（绿色箭头）夹在ER池和支持细胞和伸长精子细胞的相对质膜（红色箭头）之间，与a中所示BTB的基础ES相似，但ES的这一典型特征限制了只有送到Sertoli牢房。比例尺，0.5μm（a）、1μm（b）和0.1μm（c）。Ac，顶体；Nu，核。
图4。
图4。
啮齿动物和人类精子发生涉及细胞分裂（有丝分裂、减数分裂）和细胞分化的示意图显示了BTB的重要性，BTB将生殖细胞分离在生精上皮的基底或顶端（管腔）隔室。每种生殖细胞类型下方括号内的数字表示通过有丝分裂（黑色箭头）、减数分裂[绿条，包括减数分裂I（蓝色箭头）和减数分裂II（绿色箭头）]或不涉及细胞分裂的转化/分化（红色箭头）从早期祖细胞衍生的子细胞的数量。理论上，4096个细长精子细胞（ES），因此精子是由单个a形成的单一的啮齿动物的精原细胞，但超过75%的生殖细胞（如精原细胞、精母细胞和精子细胞）发生凋亡和退化，因此单个精原细胞产生的精子数量要少得多。A、 A型精原细胞；In，中间精原细胞；B、 B型精原细胞；精母细胞；次级精母细胞；rS，圆形精子细胞，在大鼠和人类中分别经历1至19步和1至6步精子细胞的精子生成，形成细长精子细胞；ES，细长精子细胞，在精子形成前转化和分化为精子；A类秒，A单一的精原细胞；A类公共关系，A成对的，成对的精原细胞；A类铝，A对齐的精原细胞；A类1-A类4是分化的精原细胞。BTB将生精上皮物理上分为基底和顶端（管腔）隔室。当B型精原细胞分化为前钩端精母细胞时，精原细胞有丝分裂和分化的所有事件都发生在基底室，它们是在BTB转运的生殖细胞，因此减数分裂I/II和精子生成发生在顶端隔室的BTB后面，直到精子形成（即精子释放到小管腔中）。
图5。
图5。
成年大鼠睾丸生精小管中基于肌动蛋白的细胞骨架的分布。A、 成年大鼠睾丸的横截面，其中F-actin通过罗丹明结合的指骨样蛋白（Invitrogen，Carlsbad，CA）染色（红色荧光）显示，细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色，并显示在合并图像（B）中。B中的两个方框区域被放大并显示在C和D中，说明了BTB在C中的相对位置，如白色箭头所示，并且F-actin在与肾小管周围肌样细胞相关的固有膜（见白色箭头）中也占主导地位。在延伸精子细胞头部周围的顶端ES处也检测到广泛的F-actin网络，如D.标尺所示，80μm（A和B）和20μm（C和D）。
图6。
图6。
体外支持细胞BTB的形态和超微结构特征。支持细胞在～0.02×10培养6细胞/厘米2（A–C）或0.0125×106细胞/厘米2（D） 在Matrigel-coated玻璃盖玻片上放置4天。此后，将细胞固定在磷酸盐缓冲盐水（10 mM磷酸钠和0.15 M氯化钠，22°C时pH为7.4）中的4%多聚甲醛（w/v）中，在磷酸盐缓冲盐中的0.1%Triton X-100（v/v）渗透，并用针对ZO-1（a，TJ适配蛋白）、闭塞素（B，TJ完整膜蛋白）、，N-钙粘蛋白（C，一种基础ES整合膜蛋白），或使用FITC-结合的卵磷脂染色F-actin（西格玛-阿尔德里奇，密苏里州圣路易斯）（D）。用4,6-二氨基-2-苯基吲哚（Invitrogen）将细胞安装在ProLong Gold防褪色试剂中，以观察细胞核。在体外培养的这些支持细胞中建立了TJ和基础ES，通过测量支持细胞上皮的跨上皮电阻，证实了早期的发现，即在体外培养支持细胞中，建立了功能性TJ渗透屏障（Grima等人，1998年；Lui等人，2001年）。这些支持细胞中也发现了独特的肌动蛋白丝网络，如D·E至H所示，支持细胞的电子显微照片（0.5×106细胞/厘米2)在Matrigel-coated培养皿上体外培养4天，在体内检测到的BTB的超微结构特征也出现在这个Sertoli细胞上皮（F–H）中，说明已经建立了一个功能性BTB。E、 注意到两个相邻的具有独特细胞核（Nu）的支持细胞，还发现了微绒毛（黄色箭头），这是体外培养的支持细胞的典型特征。F、 注意到三个相邻的支持细胞（Nu），蓝色和黄色括号包围的功能性BTB分别放大并显示在G和H中。G、 基底ES以肌动蛋白丝束（黄色箭头）的存在为代表，肌动蛋白丝束夹在内质网池和附着的支持细胞质膜之间（见附着的绿色箭头），TJ（红色箭头）与基底ES共存。H，功能性桥粒（蓝色箭头），它的典型特征是相邻两个Sertoli细胞两侧都存在电子密度物质。H中显示的桥粒和G中显示的基底ES和TJ是F中相应区域的放大图像，显示了体外支持细胞BTB的超微结构。简而言之，这些观察结果表明，在体外培养的这些支持细胞中建立了功能性BTB，通过在体内发现BTB的超微结构来模拟体内的BTB。比例尺，20μm（A–D）、5μm（E和F）和1μm（G和H）。
图7。
图7。
说明BTB组成蛋白质分子结构的示意图。BTB的典型特征是肌动蛋白纤维束夹在内质网池和相邻两个支持细胞的相对质膜之间。BTB处的细胞粘附是由几个完整的膜蛋白及其适配器的存在所赋予的，例如TJ蛋白复合物（闭塞ZO-1、克劳丁-ZO-1和JAM-ZO-1）、基础ES蛋白复合物，和桥粒蛋白复合物（桥粒蛋白-2/桥粒结合蛋白-2-嗜血小板蛋白/血小板球蛋白）。这些蛋白质复合物中的适配器（例如，ZO-1、β-连环蛋白、afadin、嗜斑蛋白、斑球蛋白）也会招募额外的适配器[例如，zyxin、axin、Wiskott-Aldrich综合征蛋白（WASP）、桥蛋白]和调控蛋白到位点，包括非受体蛋白激酶[例如Src家族激酶（例如，c-Src、c-Yes）、Fer激酶、FAK]，极性蛋白[例如，PAR6、与Lin seven-1（PALS1）相关的蛋白、PALS1-associated tight-junction protein（PATJ）、非典型PKC（aPKC）]、GTPases（例如，Rab8B、Cdc42）和MAPKs[例如，p38 MAPK和JNK/应激激活蛋白激酶（SAPK）]。肌动蛋白网络也由肌动蛋白帽和捆绑蛋白Esp8和肌动蛋白核Arp2/3蛋白复合物维持。此外，在桥粒蛋白-去丝球蛋白复合体附近还有中间丝，在肌动蛋白丝附近有微管蛋白网络和运动蛋白（例如，肌球蛋白VIIA、动力蛋白、驱动蛋白），以促进精母细胞在该位点的前精粒转运。
图8。
图8。
图示非受体蛋白激酶FAK和Src的功能域的示意图。FAK和c-Src（转化肉瘤诱导基因罗斯肉瘤病毒）是基于整合素的信号传导介质，最显著的是在局灶黏附复合体（也称为局灶接触，这是一种以肌动蛋白为基础的细胞-基质锚定连接。在睾丸中未发现局灶接触。相反，FAK和c-Src是BTB的TJ和基底ES的组成部分，以及心尖室的心尖ES）。Src激酶家族中至少有九个成员：Src、Yes、Hck、Fyn、Fgr、Lyn、Lck、Blk和Yrk。c-Src和c-Yes在BTB中发现，并且在结构上与闭塞素-ZO-1和N-钙粘蛋白-β-连环蛋白粘附复合物相关。FAK由一个结合β1-整合素的N末端结构域组成，其次是FERM（带4.1，ezrin，radidixin，moesin同源性）结构域、催化激酶结构域和靠近其C末端的FAT（焦点粘附靶向）结构域。还存在三个前富区PRI、PRII和PRIII，它们还充当许多适配器和/或调节蛋白（如c-Src、PI-3K、PTEN、p130）的附着位点卡斯)通过其一个或多个假定磷酸化位点（例如，Tyr-397、-407、-576、-577、-861和-925）激活FAK后。Src激酶家族的成员，如c-Src和c-Yes，由四个Src同源（SH）结构域组成，即SH1到SH4（Xu等人，1997；Chong等人，2005）。Src激酶N末端附近的SH4结构域包含肉豆蔻酰化和膜定位位点，以及一个由50到70个氨基酸残基组成的独特结构域，在Src酶家族成员之间没有相似性，从而使每个Src蛋白激酶成员都是一个独特的蛋白质。SH2和SH3结构域分别参与与其他蛋白质和前富区磷酸化Tyr残基的相互作用。例如，FAK在其SH2域与c-Src/c-Yes交互。SH1结构域是催化激酶位点。c-Src与几种BTB蛋白相互作用：闭塞素、N-钙粘蛋白、CAR、桥粒蛋白-2、连接蛋白-43、嗜斑蛋白-2、β-连环蛋白（Lee和Cheng，2005；Wang等人，2007；Li等人，2009b；Lie等人，2010b）和肌管蛋白相关蛋白2（Zhang等人，2005），在BTB的许多完整膜蛋白中赋予适当的磷酸化状态，以调节细胞粘附。Src在其C末端附近的Tyr-530和Tyr-419有两个重要的磷酸化位点。Tyr-530磷酸化后，Src通过SH3和SH1（激酶）结构域之间的相互作用呈现非活性锁定构象；然而，催化激酶结构域内Tyr-530的去磷酸化和Tyr-419的自磷酸化诱导Src呈现活性开放构象，使其催化结构域激活以诱导其底物的Tyr磷酸化。Src和FAK形成功能性双激酶复合物，以影响多种细胞功能（Brunton和Frame，2008；Aleshin和Finn，2010；Bolós等人，2010；Cabodi等人，2010a，b），包括睾丸（Yan和Cheng，2006）。
图9。
图9。
一个当前的模型说明了精子发生过程中精母细胞在BTB转运过程中免疫屏障完整性的维持。该模型是根据第四节中讨论的领域的最新研究结果制作的。左侧是上皮周期第七阶段的小管示意图，在从B型精原细胞分化而来的前精原细胞上方有一个完整的BTB，显示了TJ、基底ES、桥粒、，和缝隙连接。典型的肌动蛋白纤维束夹在内质网池和并置的支持细胞质膜（或并置的支撑细胞长精细胞）之间，也可见于BTB或顶部ES。在上皮周期的晚期VII至早期VII（中心），细胞因子（例如TGF-β3、TNFα）睾酮诱导完整膜蛋白（和/或其适配器）的内吞作用（可能也由FAK和/或Src诱导的磷酸化状态的改变介导），从而使这些蛋白内化，破坏旧的BTB位点的稳定性，为精母细胞转运打开TJ屏障。极性蛋白质（如PAR6、14-3-3、PAR3）的伴随作用以及Arp2/3蛋白复合物和Eps8的联合作用促进了这种内吞囊泡介导的蛋白质运输事件。一些内吞蛋白质将被靶向降解，但其他蛋白质将被转运并再循环到转运前精母细胞后面的新BTB位点。睾酮介导的BTB蛋白的从头合成也促进了新BTB的建立。此外，由于在这些生殖细胞（例如CAR）中也发现了BTB处的一些完整膜蛋白，因此促进了精母细胞穿过BTB的转运，因此这些蛋白可以在转运精母细胞和BTB处Sertoli细胞之间形成同型相互作用，以禁止打开的BTB（中心）。因此，如右图所示，在伴随精子形成的上皮周期第八阶段发生的这些BTB重组事件不会损害BTB所赋予免疫屏障的完整性。该模型还表明，男性避孕药具开发存在多个目标。例如，参与内吞囊泡介导的蛋白质运输事件的极性蛋白质的破坏将使BTB处的前精蛋白精母细胞的转运失效，从而阻止精子发生。这种作用可能产生最小的副作用，因为作用部位局限于BTB微环境，而不是全身性。
图10。
图10。
缝隙连接中连接蛋白、连接外显子、半通道和缝隙连接通讯通道的分子结构示意图。A、 典型的连接蛋白（例如，Cx43、Cx26、Cx33）由四个跨膜结构域、两个细胞外环、一个细胞内环以及细胞内N端和C端尾部组成。C末端区域赋予连接蛋白之间的大部分区别，连接蛋白还包含用于激活和失活以及与结合伙伴（例如ZO-1、C-Src）相互作用的磷酸化位点。B、 一个未偶联的功能性连接蛋白（也称为半通道）由六个连接蛋白组成，这些连接蛋白可以是相同的（同质）或不同的（异体）类型。C、 两个耦合且兼容的连接子在两个相邻的Sertoli或Sertoli生殖细胞之间创建了一个缝隙连接通信通道，这两个细胞可以是同型或异型的。
图11。
图11。
说明有毒物质（如镉、BPA）导致BTB破坏的分子机制的示意图。左侧，正常小管的生精上皮，BTB完整。然而，毒物并非通过BTB进入支持细胞，而是通过连接相关的“孔”和/或药物转运蛋白进入质膜。这些毒物可诱导氧化应激，进而调节其对激酶（例如FAK、c-Src）的影响，导致不需要的蛋白质内吞，从而破坏BTB的稳定性。或者，毒物也可以激活MAPK（例如p38 MAPK、ERK），这也可以诱导不需要的蛋白质内吞。这些影响也可以通过Eps8和Arp2/3蛋白复合物的稳态变化来介导，从而破坏最佳内吞囊泡介导的蛋白运输事件，破坏BTB处的细胞粘附。最终结果导致BTB断裂，进而影响生殖细胞在上皮基底和顶端的粘附，导致生殖细胞脱落。这些研究结果也说明了潜在的靶点，这些靶点可以用于治疗性管理毒素诱导的BTB破坏和随后的男性生殖功能障碍（例如精子数量减少）。例如，通过修改极性蛋白质（例如14-3-3、PAR3、PAR6）和/或Arp3/3复合物的作用来稳定BTB完整性，可以防止镉或BPA诱导的蛋白质内吞的不必要加速。现在可以基于该假设模型设计功能性研究，以阻止或治疗性管理毒素诱导的BTB破坏。
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