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.2008年7月15日；105（28）：9657-62。
doi:10.1073/pnas.0801527105。 Epub 2008年7月10日。

Par3/Par6极性复合体协调精子发生过程中顶端胞质特化和血液测试屏障重建

Elissa W P Wong女士 1, 多洛雷斯·D·姆鲁克, 威尔·M·李, C严成
附属公司

Par3/Par6极性复合体协调精子发生过程中顶端胞质特化和血液测试屏障重建

Elissa W P Wong女士等。 美国国家科学院程序. .

摘要

Par3/Par6/aPKC和CRB3/Pals1/PATJ极性复合物参与调节睾丸的顶端胞质特化（ES）和血睾屏障（BTB）重组。Par6是心尖ES和BTB的组成部分。然而，在周期的第八阶段，这两个地点的水平都大大降低了。在正常睾丸中，Par6还与Pals1和JAM-C（心尖ES的成分）形成稳定的复合体。在不影响BTB的情况下，用调节蛋白诱导大鼠心尖ES重构时，在失配精子细胞耗尽前，Par6染色在心尖ES处几乎消失。此外，Par6/Pals1复合物与Src激酶紧密结合，导致Par6/Pals复合物与JAM-C失去结合，从而破坏顶端ES的稳定性，促进精子细胞的丢失。接下来，使用具有功能性BTB但没有心尖ES的原始支持细胞培养物，根据BTB动力学评估基于Par6的复合物。当Sertoli细胞上皮中的Par6或Par3被RNAi敲除时，与对照组相比，检测到细胞中相应蛋白的显著损失约为60%，并且在Par6敲除后aPKC下降，但Par3没有下降。这种Par3或Par6的敲除也导致细胞-细胞界面上选定的BTB蛋白暂时丢失，从而损害BTB的完整性。这些发现表明，基于Par6/Par3的极性复合体可能协调精子发生期间在生精上皮中相邻支持细胞的相反端同时发生的顶端ES和BTB重组事件。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
Par6定位于成年大鼠睾丸的顶端ES和BTB。(A类) (a–h)冷冻睾丸切片用抗Par6抗体染色（参见表S1)与控制(我)用正常兔血清染色。(一)图示成年大鼠睾丸的低倍切片。(b–e类)上皮周期不同阶段代表性小管的放大图，如上部Insets放大倍数较低。Par6定位于心尖ES（参见c（c）和放大面积c插入)在几乎所有阶段，除了在精子形成之前的第八阶段晚期，精子数量都大大减少了（参见天与。c（c）).下部插入在里面b–d段是方框区域的放大视图。(f–h)Par6也在BTB站点显著本地化（参见克和小时)但在第八阶段，BTB处的Par6染色也减弱了（参见一和天和（f）与。克和小时)。(j)用抗Par6抗体检测80μg睾丸（T）、支持细胞（SC）和生殖细胞（GC）裂解物蛋白的免疫印迹。[比例尺：一（也适用于上部Insets在里面b–e类)，100微米；b条（也适用于c–h)，20微米；b下嵌入（也适用于下部插入在里面c（c）和天)，10微米；和我，40微米。](B类)Par6（红色）与顶端ES蛋白连接蛋白-3的结肠化(a–d，绿色）和BTB蛋白(e–h)，N-钙粘蛋白(i–l)，和γ-连环蛋白(百万英镑)（绿色）]。细胞核用DAPI（蓝色）染色。[比例尺：一（也适用于b–d段)，10微米；e（电子）（也适用于f–h)，5微米；和我（也适用于j–p)，10微米。]
图2。
图2。
调节蛋白诱导锚定连接重组过程中定向错误精子细胞顶端ES的Par6缺失(A类) (左侧)用抗Par6抗体对正常睾丸进行免疫染色。如示意图所示，Par6与ES顶端的伸长/伸长精子细胞有关，精子细胞头部均匀指向基底膜(赖特)。黑色箭头描绘了由顶端ES维持的精子细胞头部的正确方向(B类)在佐剂处理后12小时，观察到伸长/伸长的精子细胞组变得定向不良，其头部指向小管管腔（示意图中的红色箭头，赖特)。在随机选择的四个区域（用黑色箭头表示）中，与精子细胞定向错误相关的Par6染色显著减少，这些区域扩大并显示在i–iv用于正确比较(我)或不正确(ii–iv)定向精子细胞。(C类)在adjudin处理后2天，几乎所有伸长/拉长的精子细胞都从上皮细胞中耗尽，并在腔中发现Par6仍与精子细胞相关。(D类)对照组用正常兔血清代替抗Par6抗体。(E–G公司)正常睾丸的代表性VI期小管的半薄睾丸切片(E类)调整蛋白处理后12小时(F类和G公司)。在小管腔内发现精子（见F类和G公司)但在正常睾丸中不存在(E类与。F类和G公司)上皮中发现了排列不齐的精子细胞（参见F类和G公司)。[比例尺：A类（也适用于B–D类)，80微米；我（也适用于ii–iv)，10微米；和E类（也适用于F–G公司)，8μm]
图3。
图3。
伴随诱导的伸长精子细胞定向错误和ES顶端超微结构的变化(A类)正常大鼠睾丸的电子显微照片显示，一个伸长的精子细胞（Nu，细胞核；Ac，顶体）固定在支持细胞（SC）上，其中肌动蛋白纤维束（黑色箭头）夹在内质网池（ER）之间支持细胞和生殖细胞的两层质膜（见白色箭头）。(B类)调整素治疗12小时后，位于基底膜附近的支持细胞核（n）在睾丸中清晰可见，两个方向错误的伸长精子细胞的头部指向小管腔，其中一个被装箱放大C类(C类)ES顶端的肌动蛋白纤维束要么正在碎片整理（见黑色箭头），要么已经解体（见星号）。（比例尺：A类，0.1微米；B类，2微米；和C类，0.1微米）
图4。
图4。
调节蛋白诱导精子细胞定向错误期间Pals1与极性蛋白结合的变化。(A类)在指定时间点用调整蛋白治疗的大鼠的睾丸裂解物（700μg）用于带有抗JAM-C、抗Src激酶或抗Par6抗体的Co-IP，并用抗Pals1抗体进行免疫印迹。当伸长/伸长精子细胞开始发生定向错误时，在调整素处理后6小时，JAM-C和Pals1之间的蛋白质-蛋白质结合减少。分别在6小时和12小时检测到Par6–Pals1和Src激酶–Pals1的蛋白-蛋白结合增加。(B类)此直方图显示了三组独立实验的合成结果。0小时的蛋白质-蛋白质关联任意设置为1。每个bar为平均值±SD.*，对单因素方差分析结果<0.05。
图5。
图5。
Sertoli细胞中Par6的敲除导致aPKC和BTB相关蛋白的稳态蛋白水平发生变化。(A类和B类)支持细胞，如用于RNAi实验的细胞（见下文），与功能性BTB[箭头；指状细胞质突起（星号）一起培养3天，这是培养支持细胞的典型特征在体外(A类)]通过定量Matrigel-coated双腔单元上细胞上皮的TER证实(B类)。数据为的平均值±SDn个= 3. SC，支持细胞；LD，脂滴。(C类)通过转染具有针对Par6或Par3和对照siRNA双链的特异性siRNA双序列的细胞来敲除Par6或Par3，并在4天后通过免疫印迹分析，表明Par6或PA3与对照相比敲除了≈60%。请注意，Par6 siRNA双链仅针对37-kDa亚型，而Par3 siRNA双序列针对所有三种Par3亚型（100、150和180kDa）。(D类和E类)这些直方图是数据的合成结果，如C类对照肌动蛋白标准化。对照siRNA的相对蛋白水平被任意设置为1，并对其进行统计分析。每根钢筋的平均值为±SDn个= 3. *,对< 0.05; **,对< 0.01.
图6。
图6。
敲除Par3或Par6后，Sertoli–Sertoli细胞界面的正常蛋白质分布被破坏。用Cy3标记（红色）非靶向对照物转染原代支持细胞(左侧)，Par3 siRNA双链(居中)，或Par6 siRNA双链(赖特)。转染后两天，细胞首先在不含生长因子的DMEM中饥饿细胞进行钙离子转换1小时，然后在含有4 mM EGTA的培养基中培养3小时，然后恢复到含有生长因子的正常DMEM 7小时。细胞在BTB处用指示的TJ和基础ES标记物（绿色）染色。Par3和Par6的缺失导致细胞接触部位JAM-a和α-catenin的破坏。Par6和Par3的沉默也分别导致细胞接触部位的N-钙粘蛋白和ZO-1的丢失。（比例尺：5μm）
图7。
图7。
描述Par3/Par6在上皮周期第八阶段调节心尖ES和BTB重构的假设。(A类)在精子形成前的顶端ES，Par6/Pals1与JAM-C形成粘附复合物，以促进精子细胞与支持细胞的粘附。Par3/Par6/aPKC复合物的存在也通过稳定N-钙粘蛋白和JAM-C基粘附复合物促进BTB闭合。(B类)Par3和Par6可能在上皮细胞周期的第八阶段调节顶端ES和BTB的分解，如下所示：（1）在顶端ES，Pals1、Src激酶和Par6之间的紧密联系（也可能与Par6的短暂丢失和/或重新分布相耦合）可能将极性蛋白复合物从JAM-C隔离，破坏JAM-C粘附复合物的稳定性，导致精子生成。（2） 当BTB的Par6水平被细胞因子等下调时，这会导致aPKC水平下降。随后，N-钙粘蛋白、α-连环蛋白和JAM-A被降解或内吞，导致BTB短暂开放，以促进前钩端精母细胞（PS）穿过BTB。（3） 类似地，Par3的下调通过内吞或降解导致连接蛋白（α-catenin、ZO-1和JAM-A）的重新分布，从而破坏BTB的稳定性，导致其开放。未着色的靶蛋白代表降解或内吞的分子。Sp，细长精子细胞。
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