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.2013年2月；27(2):464-77.
doi:10.1096/fj.12-212514。 Epub 2012年10月16日。

分泌型Frizzled-related protein 1（sFRP1）通过黏着斑激酶和粘连蛋白-3复合物的去磷酸化调节睾丸精细胞黏附

Elissa W P Wong女士 1, Will M Lee先生, C严成
附属公司

分泌型Frizzled-related protein 1（sFRP1）通过黏着斑激酶和粘连蛋白-3复合物的去磷酸化调节睾丸精细胞黏附

Elissa W P Wong女士等。 美国财务会计准则委员会J. 2013年2月.

摘要

成年哺乳动物睾丸在精子发生过程中精子的发育涉及广泛的细胞迁移和分化。位于生精上皮基底室的精原细胞分化为更高级的生殖细胞类型，向顶端室迁移，直到在精子形成过程中细长的精子细胞释放到小管腔中。顶端胞质特化（ES；睾丸特异性锚定连接）是唯一锚定并维持上皮中伸长/伸长精子细胞（步骤8-19精子细胞）极性的细胞连接。关于在精子形成时触发顶端ES分解的信号通路，目前知之甚少。这里，我们表明分泌型Frizzled-related protein 1（sFRP1）是一种推测的肿瘤抑制基因，在多种肿瘤中经常下调，是一种重要的精子生成调节蛋白。sFRP1在成年大鼠睾丸中的表达受到严格调控，以控制精子形成时的精子细胞粘附和精子释放。睾丸发育过程中sFRP1的下调与产后约45天左右第一波精子形成的开始相一致，这意味着sFRP2可能与精子形成前心尖ES产生的精子细胞黏附延长有关。事实上，将sFRP1重组蛋白注射到活体睾丸中会延迟精子形成，伴随着磷酸化（p）-焦黏附激酶（FAK）-Tyr（397）的下调和连接蛋白-3黏附蛋白在ES顶端的滞留在Sertoli生殖细胞共培养系统中，我们使用慢病毒载体过度表达sFRP1。与体内研究结果一致，sFRP1的过度表达导致p-FAK-Tyr的下调（397），导致连接蛋白-3的磷酸化下降。总之，本报告强调了sFRP1通过其对FAK信号转导和连接蛋白-3粘附复合体在心尖ES的滞留的影响在调节精子形成中的关键作用。

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数字

图1。
图1。
sFRP1在睾丸中的表达在出生后的发育过程中下调，与第一波精子形成一致。A类)提取3-60天龄大鼠睾丸的RNA，逆转录，并通过实时定量PCR分析sFRP1 mRNA水平。sFRP1mRNA的稳态水平被标准化为GAPDH的稳态水平。将所有年龄段动物的sFRP1 mRNA水平与3日龄睾丸的sFRP mRNA水平进行比较，后者被任意设置为1。从30日龄睾丸开始，sFRP1 mRNA显著下降，达到最低水平，45日龄和60日龄睾丸保持相对不变，与45日龄第一波精子生成一致。每个年龄段的三只大鼠被用于通过qPCR测定sFRP1 mRNA的数量，每个样品分析三次。数据点为平均值±标准偏差属于n个=3只大鼠**对< 0.01.B类)用聚丙烯酰胺凝胶解析了4个代表性时间点的sFRP1和GAPDH的RT-PCR产物。GAPDH作为对照。C类)sFRP1 mRNA在成年大鼠睾丸（T）、支持细胞（SC；从20-d龄大鼠睾丸分离）和生殖细胞（GC；从成年大鼠睾丸分离）中检测到。S16用作加载控制。在Genewiz通过核苷酸测序评估证实睾丸和睾丸细胞中存在sFRP1的PCR产物的真实性。
图2。
图2。
sFRP1诱导排卵延迟。90天大鼠每个睾丸接受4μg sFRP1（2.5μg/ml，67.6μM；假设睾丸体积为1.6 ml，sFRP1M（M）第页37 kDa），在时间0时体积为～200μl通过用28克的针头进行睾丸内注射。大鼠在6 h和1、2和4 d后终止实验n个=～3-5只大鼠/时间点，包括对照组。对对照大鼠给予等量的BSA。将睾丸固定在Bouin’s固定剂中，嵌入石蜡中，用切片机切至5μm厚，并进行苏木精染色以进行组织学分析。A类,B类)来自控件的Testis节（Ctrl；A类)sFRP1治疗后1天(B类)。星号表示用sFRP1处理1天的睾丸中VIII期小管数量显著增加。比例尺=60μm。C类)对照组每个睾丸横截面中VIII期、VIII晚期和IX期小管的数量与。对sFRP1处理的大鼠进行评分，并用这些分段小管占每个横截面小管总数的百分比表示。晚期VIII被定义为小管，小管中有≥50%的细长精子细胞。通过比较不同治疗组大鼠睾丸横截面中每个阶段的小管百分比进行统计与。对照组大鼠。结果是来自的数据n个=3只大鼠，约800-900个小管/睾丸/动物。在sFRP1注射后1天和2天，在第VIII期出现了明显更多的小管，这些小管未能进行精子形成。治疗后第4天，sFRP1代谢清除后，精子开始恢复，但第IX期小管数量仍显著减少与。由于排卵延迟而引起的控制。条形代表平均值±标准偏差. *对< 0.05, **对< 0.01.
图3。
图3。
sFRP1抑制FAK-Tyr的磷酸化397.A类)用免疫印迹法分析BSA或sFRP1处理的大鼠睾丸裂解物，并探测基础ES和顶端ES蛋白以及调节蛋白(例如，p-FAK-Tyr397)已知影响精子生成。基础ES（N-钙粘蛋白、α-连环蛋白和β-连环素）和顶端ES（连接蛋白-3、afadin和JAM-C）蛋白质的稳定水平保持不变。FAK-Tyr的磷酸化397在6小时、1天和2天后通过sFRP1处理被抑制。使用GAPDH确保蛋白质负载相等。B类)总结了来自3个以上独立实验的合成结果。取BSA对照大鼠睾丸裂解物的蛋白质水平平均值并设定为1，与sFRP1处理大鼠在指定时间点的睾丸裂解物进行比较。条形代表平均值±标准偏差. *对< 0.05, **对< 0.01.
图4。
图4。
sFRP1诱导的精子形成延迟是由顶端ES复合体的滞留介导的。A类)将BSA处理的对照组或sFRP1处理的大鼠冷冻睾丸切片固定1d，并对其进行连接蛋白-3（绿色）染色。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；蓝色）染色。a–d)在对照睾丸切片中，Nectin-3在VII期小管的ES顶端表达。e–h)就在第八阶段精子形成之前，ES顶端的连接蛋白-3染色显著减少，几乎无法检测到。i–l)sFRP1治疗1d后，VII期肾小管中的连接蛋白-3水平没有显著变化。百万英镑)然而，在sFRP1处理的睾丸中，第VIII期小管的顶端ES处仍然可以清楚地看到连接蛋白-3染色。B类)使用Arp3（红色）和F-actin（绿色）（左侧面板）或p-FAK-Tyr进行双标记免疫荧光分析397（红色）和连接蛋白-3（绿色）（右侧面板）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。a–c)Arp3（红色）与F-肌动蛋白（绿色）在VII期对照小管中伸长精子的腹侧（凹侧）共定位。b–f)在精子形成前不久，Arp3染色显著减弱，第VIII期小管中的F-actin随之消失，说明精子形成前心尖ES复合体的解体。g–i类)然而，在sFRP1诱导的精子形成延迟期间，Arp3和F-actin仍位于延长精子细胞的凹侧。j–l)对-FAK-Tyr397（红色）几乎只在顶端ES表达，与细长精子细胞背侧（凸侧）的连接蛋白-3（绿色）共定位。百万美元)在控制阶段VIII小管中，p-FAK-Tyr397在心尖ES处仍能检测到，而nectin-3染色几乎消失。对-对)相反，p-FAK-Tyr397与对照组相比，sFRP1处理的睾丸在第VIII期的ES在顶端明显较弱，但nectin-3染色明显强于相应的对照组。比例尺=60μm(澳大利亚,b条,e（电子）,（f）,我,j,米,n个); 20微米(交流电,天,克,小时,k个,我,o个,第页); 12微米(B类).
图5。
图5。
支持生殖细胞共培养中顶端ES的特征。支持细胞培养在0.5×106细胞/厘米2在F12/DMEM中的Matrigel-coated 60-mm盘子上，按照材料和方法中的描述，在35°C下添加补充剂。大约36小时后，如前所述，低张处理细胞以溶解残余生殖细胞（33）。A类)这些高纯度的支持细胞单独培养4天，形成完整的上皮（SC-Nu，支持细胞核）。两个相邻的支持细胞（SC）与支持细胞质膜相对，用相对的灰色箭头标注。培养的支持细胞典型的细胞质过程在体外也可以看到（星号）。B类)紧密连接（白色箭头）的超微结构与基底ES共存[以肌动蛋白丝束（黑色箭头）的存在为代表，肌动蛋白丝束夹在支持细胞质膜（灰色箭头）的内质网池之间]，模仿支持细胞BTB体内试验。C–F类)在单独培养支持细胞4天后，将从成年大鼠睾丸中分离的总生殖细胞添加到支持细胞上皮上，并以1:5的支持细胞与生殖细胞的比例培养约2天，然后终止电子显微镜检查。C类)生殖细胞（见突出的生殖细胞核，GC-Nu）附着在2个支持细胞上。可见支持细胞胞质突起（星号）。D类)中方框区域的放大视图C类桥粒（白色箭头）的典型特征是在支持生殖细胞界面上存在电子密度物质（灰色箭头表示支持生殖细胞质膜相对）。E类)在伸长精子细胞和支持细胞之间发现功能性顶端ES（盒状区）；星号表示培养的支持细胞的典型细胞质突起体外试验。F类)中方框区域的放大视图E类顶端ES的典型特征是肌动蛋白纤维束（垂直于支持细胞质膜，白色箭头）夹在内质网池和支持细胞和精子细胞的对应质膜之间（灰色箭头）。Sp-Nu，精子细胞核。比例尺=5μm(A类); 1微米(B类); 3微米(C类); 0.5微米(D类); 2微米(E类); 0.5微米(F类).
图6。
图6。
sFRP1介导的FAK失活通过p-FAK-Tyr的下调397Sertoli生殖细胞共培养中的表达。A类)支持细胞（0.3×106细胞/厘米2)培养2天并用慢病毒载体转导（感染的多重性=2）以过表达lacZ或sFRP1。细胞在转导后培养2天，然后添加总生殖细胞（支持细胞：生殖细胞=1:5），包括伸长/伸长的精子细胞和支持细胞，以启动顶端ES组装，如材料和方法所述（另见图5）。2天后收获支持-生殖细胞共培养物，以获得细胞裂解物和条件培养基。在Sertoli生殖细胞共培养的细胞裂解液和条件培养液中均发现高水平的sFRP1蛋白，分别使用GAPDH和睾丸素作为蛋白质负荷控制。B类)左面板：支持细胞（0.5×106细胞/厘米2)在添加总生殖细胞（Sertoli：生殖细胞=1:5）和包含重组sFRP1（2.5μg/ml）之前培养4d。2天后在免疫沉淀裂解缓冲液中收集蛋白裂解产物，并探测基础ES(例如、N-钙粘蛋白、α-连环蛋白和β-连环素）和心尖ES(例如、nectin-3、afadin和JAM-C）蛋白，发现它们保持不变。右图：同样，在与sFRP1过度表达的Sertoli生殖细胞共培养物的蛋白裂解物中，这些蛋白水平没有显著变化与。lacZ公司。相反，FAK-Tyr的磷酸化397在重组或过度表达sFRP1蛋白的情况下显著下调。C类)条形图总结了3个独立实验的结果，其中每个靶蛋白针对GAPDH进行标准化，并与BSA或lacZ对照中的相对蛋白水平进行比较，该相对蛋白水平任意设置为1。条形代表平均值±标准偏差. **对< 0.01.
图7。
图7。
在支持生殖细胞共培养中，sFRP1降低了连接蛋白-3的磷酸化。A类)用重组sFRP1（2.5μg/ml；左图）处理的支持生殖细胞共培养物的蛋白裂解物或通过慢病毒转导过度表达sFRP1（右图）后的蛋白裂解液用连接蛋白-3抗体进行免疫沉淀，以获得总连接蛋白-3。此后，通过使用抗磷酸化-Tyr抗体（对-Tyr-nectin-3）的免疫印迹来评估免疫沉淀连接蛋白-3的相对对-Tyr含量。两个治疗组的总连接蛋白-3水平和GAPDH均无显著变化与。它们相应的控件。B类)直方图总结了3个独立实验的结果，表明sFRP1蛋白的存在降低了连接蛋白-3的酪氨酸磷酸化。BSA或lacZ对照中对-Tyr-nectin-3的相对蛋白水平任意设置为1，并与之进行统计比较。条形代表平均值±标准偏差. **对< 0.01.
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