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.2012年10月15日；303（8）：C843-53。
doi:10.1152/ajpcell.00218.2012年。 Epub 2012年8月8日。

柯萨奇病毒和腺病毒受体对血睾屏障的调节

苏林林（Linlin Su） 1, 多洛雷斯·D·姆鲁克, C严成
附属机构

柯萨奇病毒和腺病毒受体对血睾屏障的调节

苏林林（Linlin Su）等。 美国生理学杂志细胞生理学. .

摘要

血睾屏障（BTB）将生精上皮分为基底隔室和管腔隔室。它限制支持细胞之间分子的细胞旁扩散，赋予细胞极性，并在精子细胞发育的腔室内创造独特的微环境。然而，它在上皮周期中发生重组，因此，与基底室中的B型精原细胞分化的前精蛋白精母细胞可以在周期的第八阶段穿过BTB，同时保持免疫屏障。其中，柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）是睾丸、多上皮和内皮细胞中的紧密连接（TJ）整体膜蛋白，除作为结构粘附蛋白外，还作为BTB的调节蛋白发挥作用。RNAi介导的CAR在支持细胞上皮中的敲除，该支持细胞上皮具有已建立的模拟体内BTB的TJ通透性屏障，导致TJ屏障的破坏和TJ蛋白封闭蛋白的内吞作用增加。此外，闭塞素内吞作用的增强伴随着闭塞素中Thr-磷酸化的下调，以及内吞闭塞素与早期内体抗原-1的相关性增加。这些发现通过在支持细胞中过度表达CAR得到证实，发现CAR可以“拉紧”支持细胞TJ屏障，促进BTB功能。这些发现支持了一个新的概念，即CAR不仅是一种结构蛋白，它还可能通过与非受体蛋白激酶的结构相互作用介导BTB处其他粘附蛋白（如闭塞素）的磷酸化状态，从而调节内吞囊泡介导的蛋白运输。

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数字

图1。
图1。
用于克隆全长大鼠睾丸CAR的柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）的一级核苷酸序列（GenBank登录号：NM_053570）。使用指定的CAR引物对通过PCR克隆大鼠睾丸CAR不包括CAR（见表2）基于本文所示的已知CAR序列，用“黑”框注释，利用大鼠支持细胞总cDNA作为模板，其从支持细胞RNA逆转录，循环参数如表2所示。然后使用大鼠睾丸CAR cDNA制备全长cDNA构建物并将其连接到哺乳动物pCI-neo载体中Xho公司我和不是通过使用指定的CAR引物对进行PCR，将I限制性位点分别添加到其5′端和3′端汽车（表2），并由“虚线”框注释。数字位于左边表示NM_053570的核苷酸序列。该大鼠睾丸CAR cDNA克隆在Genewiz（新泽西州南普莱恩菲尔德）通过直接核苷酸测序进行了验证。
图2。
图2。
体外研究评估RNAi敲除CAR对支持细胞紧密连接（TJ）通透性屏障功能的影响。支持细胞在Matrigel包被的培养皿上单独培养(A类和B类)，两院制单位(C类)或盖玻片(D类)持续3天，以组装功能性TJ通透性，具有TJ、基础外质特化（ES）、缝隙连接（GJ）和桥粒（DS）的超微结构，如前所述（27、28、53）。此后，用CAR特异性siRNA双链和非靶向对照siRNA双联转染细胞24小时，然后终止培养进行RT-PCR/免疫印迹（IB；A类)，免疫印迹(B类)Sertoli TJ-渗透屏障评估(C类)和双标记免疫荧光分析（IF；D类).A类：RT-PCR证实转染3天后终止的Sertoli细胞中使用CAR特异性小干扰（si）RNA双工体通过RNAi敲除CAR(一)和免疫印迹(b条). M、 碱基对中的DNA大小标记（bp）。B类：CAR下降约70%(一和b条)转染3天后，还通过免疫印迹法检测支持细胞血液测试屏障（BTB）处的TJ（例如，闭塞素、克劳丁-11、JAM-A和闭塞小带1（ZO-1））、基础ES（例如，N-钙粘蛋白、α-连环蛋白和β-连环素）和桥粒蛋白（例如，桥粒糖蛋白-2、桥粒collin-2和γ-连环肽）的水平。值得注意的是，除了ZO-1的水平在Sertoli细胞中CAR被敲低约70%后下调约30%外，其他BTB蛋白的水平保持相对不变(一). 针对肌动蛋白标准化的CAR和ZO-1免疫印迹数据的密度分析，其中对照组被任意设置为1(b条). 每根钢筋的平均值±SD为n个=3个实验。C类：体外研究发现，CAR的敲除会暂时扰乱支持细胞TJ屏障。转染后3天进行PCR、免疫印迹（IB）和双标记免疫荧光分析（IF）。D类：为了研究细胞-细胞界面蛋白分布/定位的变化，将培养在Matrigel-coated盖玻片上的Sertoli细胞与siGLO Red（转染指示剂）与非靶向或CAR特异性siRNA双工体共转染，并对CAR（绿色荧光）、闭塞素（绿色荧光，或ZO-1（绿色荧光）打开第3天转染后3天对支持细胞进行IF处理（即。，第6天文化方面）。在CAR敲除细胞中检测到支持细胞-细胞界面CAR表达缺失（参见b条与。一). 尽管CAR RNAi对闭塞素的稳态水平没有明显影响(B类)发现其敲除会导致闭塞素的错误放大，导致其从细胞表面附近移动到细胞胞浆中。与occludin类似，CAR敲除下调ZO-1的表达外，还损害了ZO-1在支持细胞界面的定位/分布。比例尺=20μm in一，适用于b–f. **P（P）< 0.01.
图3。
图3。
通过RNAi监测支持细胞CAR敲除过程中的离靶效应的研究。两个干扰素刺激基因（ISG），即OAS1（寡腺苷酸合成酶1）和STAT1（信号转导子和转录激活子1），被用作评估非靶向效应的标记物，因为已知这些基因在RNAi载体转染细胞进行基因沉默时非特异性上调。与对照组相比，CAR敲低后，支持细胞中OAS1和STAT1均未上调。M、 碱基对中的DNA大小标记（bp）。
图4。
图4。
RNAi通过建立TJ通透性屏障击倒支持细胞中的CAR，增强了闭塞素的内吞作用，并改变了闭塞素磷酸化状态。A类：支持细胞（0.45×106细胞/厘米2)在RNAi之前单独培养3天，通过将100 nM CAR特异性siRNA双工体与非靶向对照siRNA双倍体转染细胞24小时，CAR被敲除（见图2C类). 三天后，进行内吞试验。使用生物素化细胞表面总蛋白（如本文所示，来自对照组的总蛋白，与CAR siRNA组相似），不使用2-巯基乙磺酸盐剥离，以评估已被内吞的闭塞蛋白的百分比。使用等量的蛋白质（～300μg），通过使用Ultralink固定化NeutraAvidin Plus珠提取生物素化蛋白质（Pierce，包括相应肌动蛋白印迹所示的“Total”）。“-ve”表示不含生物素化的细胞表面蛋白质（～300μg），但使用NeutraAvidin Plus珠进行提取，并使用抗闭塞素进行免疫印迹（见表1）。与对照细胞相比，支持细胞中CAR的敲除约70%可显著加速闭塞素（TJ整合膜蛋白）的内化(一). 肌动蛋白如所示一用作蛋白质负荷控制，代表NeutraAvdin下拉前支持细胞裂解产物中的肌动蛋白。此内吞实验的综合数据显示在b条其中每个数据点是的平均值±SDn个=3个独立实验。采用单因素方差分析进行统计分析**P（P）< 0.01.B类：首先对支持细胞裂解物（～300μg蛋白质）与免疫沉淀闭塞素抗闭塞素抗体进行联合免疫沉淀（Co-IP），非靶向对照组和CAR敲除组之间的样本中闭塞素水平相似（顶面板），与图1所示结果一致B类这也说明了两组之间的蛋白质负荷相等。然后用抗磷-Ser、-Thr或-Tyr抗体（见表1）探测这些印迹，并在随后的面板中显示(一). 对这些发现进行密度扫描，并与闭塞素水平进行标准化，对照组中的水平任意设置为1，并与之进行统计比较。每根钢筋的平均值±SD为n个=3-4个实验*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
图5。
图5。
CAR敲除对支持细胞上皮内吞囊泡介导的蛋白转运的影响。A类：用CAR特异性siRNA双链体（CAR siRNA）转染细胞3天后，通过双标记免疫荧光分析检测EEA-1（红色，内体标记物）和闭塞素（TJ整合膜蛋白）在支持细胞上皮中的细胞定位及其在CAR敲除后的变化与非目标控制双工（Ctrl-siRNA）的比较。在CAR敲低后，发现更多的occludin（绿色荧光）在支持细胞中被内吞，这与图1所示的结果一致。1D类此外，闭塞素和EEA-1（红色荧光）似乎在CAR击倒细胞中更广泛地共定位（见“白色”箭头，表示CAR击落后闭塞素与EEA-1共定位增加）。DAPI（蓝色）用于显示细胞核。比例尺=20μm，适用于其他显微照片。B类：培养3天的支持细胞用CAR特异性siRNA双工体转染，而非靶向对照siRNA双倍体转染24小时。细胞用新鲜的F-12/DMEM冲洗和培养48小时，然后终止培养并用于免疫印迹。CAR敲除对Sertoli细胞中EEA-1的稳态水平没有明显影响(一)，以及的合成结果n个=中显示了3个实验(b条); ns，无显著差异。C类：通过使用～300μg蛋白裂解物进行免疫沉淀，Co-IP用于评估CAR敲除后闭塞素与EEA-1之间蛋白-蛋白质相互作用的变化，如一无Co-IP的正常支持细胞裂解物（正常SC，40μg蛋白质）作为阳性对照(一).底部：IgG印迹H（H）和IgGL（左）链，说明此Co-IP实验中的蛋白质负载相等(一). 在支持细胞中CAR敲除后，检测到闭塞素与EEA-1之间的相互作用增加(一). 复合数据，每个条形代表的平均值±SDn个=中显示的3个实验b条其中，对照组闭塞素与EEA-1的相对关联度任意设置为1，并与之进行统计比较*P（P）方差分析结果<0.05。
图6。
图6。
CAR过度表达对体外支持细胞TJ通透性屏障和BTB组成蛋白稳态水平的影响。为了证实基于RNAi的CAR在调节BTB功能中的生理作用，用pCI-neo/CAR载体和空pCI-nee载体（对照）转染Sertoli细胞，以检测CAR瞬时表达后TJ-屏障功能的变化。A类：通过RT-PCR检测转染含有全长CAR结构的pCI-neo/CAR载体的Sertoli细胞与空载体（pCI-nee）的CAR表达的增加。B类：1.2×10时的支持细胞6细胞/厘米2单独培养3天以建立功能性TJ通透性屏障，然后用pCI-neo载体和pCI-no/CAR载体转染。通过量化支持细胞上皮的TER来监测TJ屏障功能的变化。每个数据点的平均值±SD为n个=代表性实验的3个重复，从3个独立实验中获得类似结果**P（P）通过单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett检验得出<0.01。C类：通过免疫印迹法进一步证实用pCI-neo/CAR载体转染Sertoli细胞后CAR表达增加(一). 还注意到ZO-1的上调，与图2所示的结果一致B类发现CAR的敲除与ZO-1的下调有关(一). 在Sertoli细胞中CAR过度表达后，持续检测到桥粒蛋白桥粒蛋白-2和桥粒collin-2上调，如一。免疫印迹数据总结在直方图中，如b条，说明ZO-1的显著上调(顶部)，桥粒蛋白-2，和桥粒蛋白-2(底部)CAR过度表达后的表达。每根钢筋的平均值±SD为n个=4–5个实验中，目标基因的表达与相应的肌动蛋白水平标准化，转染pCI-neo空载体的Sertoli细胞中的蛋白水平任意设置为1，并与之进行统计比较*P（P）< 0.05.
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