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.2009年7月；150(7):3336-44.
doi:10.1210/en.2008-1741。 Epub 2009年2月12日。

血-睾丸屏障上的occludin局灶性粘附激酶蛋白复合物：镉模型的研究

艾丽卡·R·肖 1, Elissa W P Wong女士, 多洛雷斯·D·姆鲁克, K L Sze公司, 卡塔琳娜·S·波尔图, C严成
附属公司

血-睾丸屏障上的occludin局灶性粘附激酶蛋白复合物：镉模型的研究

艾丽卡·R·肖等。 内分泌学. 2009年7月.

摘要

迄今为止，已知哺乳动物睾丸，特别是啮齿动物睾丸中构成血睾屏障（BTB）的几种完整膜蛋白。这些包括紧密连接（TJ）蛋白（例如，闭塞素、连接黏附分子A、克劳丁）、基础胞质特化蛋白（例如N-钙粘蛋白）和缝隙连接蛋白（例如连接蛋白43）。然而，影响这些蛋白质的调节因子（如蛋白激酶和磷酸酶），如它们与细胞骨架肌动蛋白的相互作用，进而使细胞在TJ粘附，仍基本未知。我们在本文中报道了黏着斑激酶（FAK）是闭塞素的假定相互作用伙伴，而不是克劳丁-11或结合黏着分子a。免疫组织化学和荧光显微镜研究表明，FAK在成年大鼠睾丸生精上皮中的表达具有阶段特异性。在生精上皮细胞周期的几乎所有阶段，FAK与闭塞素在BTB共定位，但在第VIII-IX阶段，在BTB重组时显著减少，以促进初级精母细胞的转运。利用体外培养的支持细胞（具有已建立的TJ通透性屏障和TJ超微结构）、基础外质特化和桥粒样连接（模拟体内BTB），FAK显示在支持细胞界面与闭塞素和闭塞小带-1（ZO-1）共定位。当用CdCl（2）处理这些支持细胞培养物以干扰TJ-屏障功能时，闭塞素与FAK和ZO-1同时进行了胞内介导的内化。因此，这些发现表明FAK是闭塞蛋白-ZO-1蛋白复合物的整合调节成分，表明可以进行功能研究来研究FAK在BTB动力学中的作用。

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图1
图1
FAK在成年大鼠睾丸生精上皮中的阶段特异性定位及其与BTB处闭塞素的相互作用。Aa，与正常兔IgG孵育的成年大鼠（～300 g体重）正常睾丸的横截面，用于免疫组织化学。A、 b–h，FAK以红棕色沉淀物的形式出现，定位于上皮细胞的基底室，与它在BTB的定位一致。A、 e和f，在晚期VIII和IX小管中，FAK在BTB的定位明显减少（见e和f与b–d、g和h）。B、 在这些荧光显微照片中，FAK(绿色)与闭塞素（TJ蛋白）共定位(红色)在BTB（参见c–d、g和h中的合并图像）。在间质中也检测到一些FAK染色，可能是Leydig细胞，以及固有膜（a–h）中的肾小管周围肌样细胞和/或淋巴管内皮细胞。这个装箱区a–d分别放大，e–h显示。C、 使用成年大鼠睾丸裂解物（～700μg蛋白质）进行Co-IP，显示闭塞素在结构上与FAK相互作用。睾丸裂解物（50μg蛋白质，不含Co-IP）或Co-IP与正常兔IgG分别作为阳性和阴性对照。D、 使用睾丸（T）和生精小管（ST）的裂解物（～50μg蛋白质）进行免疫印迹分析，以说明抗体的特异性。比例尺in Aa为30μm，适用于A，A–h，in Ba为200μm，适合于B，B–d，in Be为40μm，适用于B，f–h。细胞核用DAPI染色(蓝色). A和B中显示的结果是四个独立实验的代表性数据。C中显示的Co-IP数据是10个独立实验的代表性数据。免疫沉淀；D、 染料前沿；M、 蛋白质标记物。
图2
图2
FAK的稳态水平和细胞定位与在组装Sertoli细胞（SC）TJ-通透性屏障期间选择BTB-相关蛋白。A–C，培养的Sertoli细胞在体外显示出典型的指状微绒毛(箭头，A）位于心尖室。类ds-结（A）(绿色括号)检测到，其典型特征是并置的Sertoli细胞质膜中存在电子致密物质；基础ES（装箱区以肌动蛋白丝的存在为代表(黑色箭头)夹在支持细胞质膜和内质网（ER）（C）之间。共存基础ES(蓝色支架)和TJ(红色箭头)构成BTB的细胞如C.D所示，这些细胞中TJ屏障的建立（1.2×106每厘米细胞数2)通过定量细胞上皮的TER证实。E、 免疫印迹分析评估BTB蛋白质稳态水平的变化。F和G，复合数据的直方图，如E中所示，并针对肌动蛋白进行归一化。目标蛋白在第0天的相对蛋白水平被任意设置为1，并对其进行统计分析。每个酒吧是平均值±标准偏差三个实验中的一个。*，对< 0.05; **,对<0.01。H和I，Sertoli细胞以0.05×10电镀6每厘米细胞数2将FAK（H、a和b）和p-FAK-Tyr染色到Matrigel-coated盖玻片上并培养4 d397（I、a和b）。荧光显微镜显示FAK（H、a和b）主要定位于细胞-细胞界面和细胞核，在胞质溶胶中几乎没有染色。相反，p-FAK-Tyr397（I、a和b）主要局限于胞浆，在细胞-细胞界面和细胞核处染色较少。使用大约30μg的支持细胞裂解物（Hc和Ic）蛋白通过免疫印迹证实抗体的特异性。比例尺A和B中为1μm，C中为200 nm，Ha和Ia中为20μm，适用于Hb和Ib。细胞核用DAPI染色(蓝色).
图3
图3
评估氯化镉影响的研究2支持细胞骨架F-actin、TJ-屏障功能和BTB-相关蛋白的稳态水平在体外.A，支持细胞以0.05×10电镀6每厘米细胞数2在Matrigel-coated盖玻片上培养4d，用3μ米氯化镉2在0、3和6小时后，使用罗丹明结合的指骨样蛋白对细胞进行F-actin染色(红色)和DAPI（细胞核染色，蓝色). Aa，正常支持细胞显示典型的F-actin丝的组织和排列。3小时后CdCl2观察到F-actin丝的暴露、紊乱和碎片化（Ab）；6小时后，这些变化被清楚地记录下来（Ac）（参见白色箭头在b和c中与.a）。比例尺in Aa为30μm，适用于A、b和c。支持细胞以0.5×10电镀6每厘米细胞数2在Matrigel-coated双腔单元（B）或12孔培养皿（C–G）上可以组装一个功能性TJ屏障，在d 4，CdCl2在这些培养物中，F12/DMEM中含有指定浓度的。B、 暴露于CdCl的培养物中支持细胞上皮的TER2（8 h）呈剂量依赖性下降，说明CdCl2-诱导TJ屏障破坏。C–G，在这些培养物中，第4天的Sertoli细胞用载体（0.9%NaCl，对照）或CdCl处理2（3μ米)，并在0、6、9和24小时后终止，以评估BTB不同蛋白质稳态水平的变化。由于所有对照组在0、6、9和24小时的目标蛋白稳态水平没有显著差异，因此我们只比较了CdCl后6、9、24小时的蛋白水平2治疗与.时间零点。D–G中所示的直方图是数据的结果，如C中所示，与肌动蛋白标准化。治疗组在时间零点的目标蛋白相对水平被任意设置为1，并对其进行统计分析。由于在对照样品和治疗组的时间零点未检测到p-p38 MAPK（n.d.），因此将6、9和24小时的p-p38 MAPK与各自时间点的总p38 MAPK进行比较（注：未检测到总p38 MAPK水平的差异），将其任意设置为1。每个酒吧是平均值±标准偏差至少三个不同的实验，对<0.05；**，对< 0.001.
图4
图4
FAK与闭塞素或ZO-1在Sertoli-Sertoli细胞界面的克隆化及其在CdCl后的重新分布2治疗。支持细胞以0.05×10接种6每厘米细胞数2在涂有Matrigel涂层的盖玻片上培养4d，形成完整的上皮，用3μ米氯化镉20、3和9小时。FAK(绿色)显示与闭塞素共定位(红色; A、 A–i）和ZO-1(红色; B、 a–i）在Sertoli-Sertoli细胞界面（a、a–c和B，a–c）和CdCl处均处于控制状态2-在合并图像（A、c、f和i，以及B、c、f和i）中观察到的处理细胞（A、d–i和B、d–i）。这些发现不仅说明FAK是支持细胞BTB的组成部分在体外，与体内研究结果（见图1），但FAK也是BTB处闭塞ZO-1蛋白复合物的组成部分。CdCl之后2暴露后，蛋白质定位错误，从细胞-细胞界面重新分布到细胞质中，早在3小时（A、d–f和B、d–f），9小时后更为明显（A、g–i和B、g–i）。DAPI公司(蓝色)用于细胞核染色。比例尺单位Aa为20μm，适用于A、b–i和b、A–i。
图5
图5
氯化镉2-诱导支持细胞中闭塞素分布的变化，以及闭塞素与早期内体标记物（EEA-1）和内吞小泡（网格蛋白）的关联。0.05×10镀膜支持细胞6每厘米细胞数2在Matrigel-coated盖玻片上，用3μ米氯化镉2在0、3和6小时内，在对照组中，大多数闭塞素在细胞-细胞界面检测到，几乎没有闭塞素的共定位(红色)和EEA-1(绿色)（A，A–c），以及闭塞素和氯氰菊酯(绿色，B，a–c）。然而，CdCl后3小时2处理后，闭塞素从细胞-细胞界面重新分布到细胞胞浆中，与EEA-1（A，d–f）和网格蛋白（B，d–f）共定位(白色箭头)9小时后，这些变化更加明显(白色箭头，A，g-i和B，g-i），表明CdCl后闭塞素的定位错误2治疗可能是蛋白质内吞作用增加的结果。免疫印迹法检测到治疗组和对照组之间EEA-1或氯氰菊酯的稳态水平没有变化（每车道约30μg蛋白质），但氯氰化镉24小时后氯氰菊酯的轻度下降除外2治疗（C和D）。D中所示的直方图与C中所示数据相对应，并与肌动蛋白标准化。由于对照组在0、6、9和24小时时的靶蛋白水平与治疗组在0时的靶蛋白水平没有显著差异，我们只比较了CdCl后6、9和24小时的蛋白水平2治疗与时间零点，任意设置为1，并对其进行统计分析。每个酒吧是平均值±标准偏差三个实验中的一个。*，对< 0.05.比例尺in Aa和Ba为20μm，适用于A、b–i和b、b–i。DAPI公司(蓝色)细胞核染色。
图6
图6
示意图说明了闭塞素/ZO-1/FAK是一种调节性蛋白复合物，可介导CdCl2-诱导的BTB断裂，睾丸可能利用它在上皮周期的第VIII-IX阶段重组BTB，以促进初级精母细胞的通过。顶部面板，BTB“关闭”，其中咬合蛋白/ZO-1/FAK蛋白复合物位于相互作用的支持细胞之间，以形成TJ屏障。中间面板，用CdCl处理支持细胞后2FAK改变了闭塞素（和/或ZO-1）的磷酸化状态，导致复合物在细胞-细胞界面上的定位错误，可能是通过甲氰菊酯介导的内吞途径，可能是靶向内切体介导的细胞内降解，破坏BTB的稳定；因此BTB“打开”，如下部面板氯化镉2还诱导肌动蛋白丝断裂，如本文所述。
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    1. de Kretser D，Kerr J 1988睾丸细胞学。收录：Knobil E，Neill J，Ewing L，Greenwald G，Markert C，Pfaff D，eds.生殖生理学。纽约：Raven出版社；837–932
    1. Russell LD，Ettlin RA，Sinha Hikim AP，Clegg ED 1990睾丸的组织学和组织病理学评估。佛罗里达州克利尔沃特：Cache River Press
    1. Wong CH，Cheng CY 2005血液测试屏障：其在精子发生中的生物学、调节和生理作用。当前顶尖开发人员简介71:263–296-公共医学
    1. Siu MK，Mruk DD，Lee WM，Cheng CY 2003睾丸中的粘附连接动力学由β1-整合素和局灶性粘附复合物相关蛋白的相互作用调节。内分泌144:2141–2163-公共医学

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