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.2009年11月；41(11):2302-14.
doi:10.1016/j.bicel.2009.05.016。 Epub 2009年6月2日。

双酚A在体外破坏血睾屏障完整性：这是研究血睾障碍动力学的合适模型吗？

米歇尔·W·M·李 1, 多洛雷斯·D·姆鲁克, 威尔·M·李, C严成
附属公司

双酚A在体外破坏血睾屏障完整性：这是研究血睾障碍动力学的合适模型吗？

米歇尔·W·M·李等。 国际生物化学杂志-细胞生物学. 2009年11月.

摘要

双酚A是一种雌激素环境毒物，对人类和啮齿动物的生殖健康有危害。然而，关于其对男性生殖功能的影响，文献中有相互矛盾的报道。在这项研究中，研究表明，在接受急性剂量双酚A治疗的成年大鼠中，睾丸中曲精小管的一小部分显示出生殖细胞丢失的迹象，但在统计上不显著，这与早期的一些报道一致。它也未能破坏体内的血液-试验屏障。这可能是由于体内循环中游离双酚A的生物利用度低。然而，当给20天大鼠喂食双酚A时，双酚A破坏了幼鼠的血液-试验屏障，这与早先关于幼鼠对双酚A更敏感的报道一致。使用体外培养的原代支持细胞证实了这一观察结果，这些细胞建立了紧密的连接通透性屏障，模拟体内的血液-消化屏障。双酚A对支持细胞紧密连接屏障的可逆破坏与ERK的激活以及紧密连接、基础胞质特化和血-睾屏障缝隙连接处所选蛋白水平的下降有关。双标记免疫荧光分析和生物素化技术的研究也表明，双酚A处理后，细胞-细胞界面上的闭塞素、连接蛋白43和N-钙粘蛋白水平下降。总之，双酚A在体外可逆地干扰支持细胞中血睾丸屏障的完整性，这也可以作为研究血睾丸屏障动力学的合适模型。

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图1
图1。评估双酚A对成年大鼠体重、睾丸重量和精子发生状态影响的研究
本研究中使用的五种方案以及每个方案的大鼠数量如（A）所示。成年Wistar大鼠体重从275克到350克，用玉米油中的双酚a以每只大鼠约600微升的理想浓度灌胃。正常未经处理的大鼠作为对照。（B） 记录并分析体重和睾丸重量。对照组和治疗组的两个参数均无统计学意义的变化。（C） 通过用曙红和苏木精对治疗组和正常大鼠选定时间点的睾丸石蜡切片进行染色进行形态学研究，如（C:a–h）所示。C:a和C:f中的方框区域分别放大并显示在C:b和C:g中。通过小管管腔中生殖细胞（包括伸长精子细胞、圆形精子细胞和精母细胞）的存在来评估受损小管的百分比，不包括发生精子形成的第八阶段（C:i）。在每个时间点评估每个睾丸的整个横截面上的生精小管。C中的比例尺：a=300μm，适用于C:C–f和h；比例尺（单位：C:b=150μm），适用于C:g。
图2
图2。免疫印迹分析评估BPA治疗后生精上皮中不同连接类型的稳态蛋白质水平的变化
采用免疫印迹法评估两个BPA治疗组（10 mg/kg体重和50 mg/kg体重）睾丸样品中各种连接蛋白的稳态水平。（A） 显示了紧密连接、胞质特化和缝隙连接的完整膜蛋白水平以及这些连接处的外周衔接蛋白。（B） 分析了3只不同大鼠睾丸中的蛋白质水平。检测到TJ蛋白结合蛋白和心尖ES蛋白连接蛋白3的蛋白水平轻度下降，但具有统计学意义。使用单向方差分析测试和Dunnett程序进行统计分析，以比较治疗组和对照组。除非另有规定，否则所有治疗组与对照组无显著差异。*，对< 0.05.
图3
图3。双酚A治疗后睾丸BTB连接蛋白分布的免疫荧光显微镜研究
使用免疫荧光显微镜研究BTB连接蛋白的定位。在首次使用BPA（50 mg/kg体重）治疗4周后处死的大鼠睾丸横切面上的荧光染色与未治疗的对照组进行了比较。（A） 在对照组（A:A–h）的生精上皮周期的几乎所有阶段，检测到N-钙粘蛋白（FITC）和闭塞素（CY3），并在BTB共同定位。在BPA治疗组中没有检测到可观察到的差异（A:i–p）。occludin染色显示为BTB处的一个环，围绕着整个曲精小管（a:b）。然而，在BPA治疗组（A:n与f） ●●●●。（B） 治疗组和对照组的β-连环蛋白（FITC）和JAM-A（CY3）部分共同定位于BTB（B:A–h与i–p）。虽然β-catenin在几乎所有阶段（B:a，d）都在BTB检测到，但JAM-a在第八阶段晚期到第十四阶段（B:B，d）在BTB大量表达。JAM-A还被发现与脱落的细长精子细胞（即精子）有关（参见B:B，d，注意小管管腔中的JAM-A荧光染色）。这里显示的显微照片是一个典型实验的结果。该实验在每组中使用3只不同的大鼠重复进行三次。A:A和B:A=120μm中的比例尺，适用于A:B–d、i–l和B:B–d、i–1；A:e和B:e=25μm中的比例尺，适用于A:e–h、m–p和B:e–h、m–p。
图4
图4。双酚A治疗后体内BTB完整性检测的研究
BTB的完整性通过（A）生精上皮中丝状肌动蛋白（F-actin）的定位和（B）BTB阻止荧光示踪剂进入管腔室的能力来评估。（A） 正常大鼠上皮细胞中F-actin在BTB的定位（A:A，b）与使用BPA（A:c–l）治疗的大鼠没有发现明显差异。（B） BTB的完整性通过其阻止菊糖-FITC（约4.5 kDa）从体循环扩散至心尖室并限制其扩散至BTB区域（B:a）的能力进行评估。当BTB在CdCl后损坏时2治疗（5mg/kg体重，静脉注射，持续4天），几乎在整个上皮细胞（b:g）中检测到荧光示踪剂（阳性对照）。在BPA治疗组（10 mg/kg体重和50 mg/kg体重）（b:b–f）中，荧光示踪剂也受到BTB的限制，无法进入上皮细胞的顶端室，与对照组（b:a）相似。这里显示的显微照片是两个实验的代表性结果，其中n个=每个治疗组3只大鼠。对于BPA（10 mg/kg体重）治疗组，所示数据是每个时间点使用一只大鼠的结果。在使用2 mg/kg体重（见图1）的治疗组中获得了类似的观察结果n个=每个时间点2只大鼠。A中的比例尺：A=100μm，适用于（A:b–l）；B中的比例尺：a=200μm，适用于B:B-g。
图5
图5。双酚A对幼年大鼠BTB完整性的影响
大鼠从20日龄到25日龄每天灌胃给予BPA（50 mg/kg体重）、17β-雌二醇（E20.2 mg/kg体重）或玉米油中的乙醇（2.5%）（溶媒对照）连续服用6次。对于阳性对照，大鼠接受单剂量氯化镉治疗225日龄时（5 mg/kg体重，i.p.），已知在此后第3天诱导BTB破坏（Wong等人，2004）。当大鼠28天大时，使用菊糖-FITC作为示踪剂评估BTB的完整性。白色括号表示示踪剂从基底膜扩散到生精上皮的距离。在BPA（c）和CdCl中观察到菊糖-FTIC向生精上皮的管腔室扩散2（b） 和E2（d） 当与载体对照组（a）相比时。这表明幼犬的BTB更容易接触BPA。a中的比例尺=75μm，适用于b–d。
图6
图6。BPA对体外支持细胞紧密连接通透性屏障功能和连接蛋白定位影响的研究
（A） Sertoli细胞在1.0×106细胞/厘米2在Matrigel涂布的两院制单元上，并且通过TER测量来监测TJ屏障组件。第3天，用0.1%乙醇（载体对照，VeCtrl）、BPA或CdCl处理细胞2对于BPA（200μM）和CdCl2治疗组在24小时后清洗细胞，并补充无毒物的F12/DMEM。CdCl处理的细胞2显示出明显且不可逆的TJ屏障破坏。BPA在200μM时对TJ屏障造成轻微的可逆损伤，但在40μM时没有，对<0.01。（B） 使用0.1−0.2×10培养的Sertoli细胞进行免疫荧光显微镜检查6细胞/厘米2第3天，用200μM BPA或载体对照处理细胞24小时。显示连接蛋白43（Cx43，FITC）和ZO-1（CY3）（B:a–f）、N-钙粘蛋白（FITC）以及闭塞蛋白（CY3:g–l）的定位。白色箭头表示细胞-细胞界面上相应的连接蛋白消失。BPA治疗后，细胞-细胞界面的连接蛋白，即连接蛋白43、ZO-1、N-钙粘蛋白和闭塞蛋白水平下降（B:A–c和g–i）与。d–f和j–l）。（A）和（B）中显示的结果是三个实验的代表性结果。（C） 使用电子显微镜评估第5天用0.1%乙醇（C:a和b）或200μM BPA（C:C和d）处理24小时的细胞中细胞-细胞界面的超微结构。（C:a）建立了细胞-细胞连接和模拟体内生精上皮的完整细胞上皮。微绒毛（见星号）是培养的支持细胞顶端的典型细胞结构。Nu，支持细胞核；LD，脂滴。（C:b）这是在培养的支持细胞之间发现的BTB的放大视图。紧密连接表现为两个相邻支持细胞（SC）之间的“接吻”（见白色箭头）。基底ES的典型特征是肌动蛋白纤维束（见黑箭头）夹在内质网（ER）和SC质膜之间。（C:C）显示了BPA治疗后支持细胞之间细胞-细胞界面的典型超微结构。放大（C:C）中的方框区域，如（C:d）所示。值得注意的是，用BPA处理支持细胞后，SC之间的细胞间隙变宽（见“+”），典型的TJ“吻”消失。相反，有细胞连接中断的迹象（见灰色箭头）。B中的比例尺：a=20μm，适用于B:B–l；C中的比例尺：a=2μm；C中的比例尺：b=0.2μm，适用于C:d；C中的比例尺：C=0.5μm。
图7
图7。利用培养的原代支持细胞评估BPA对连接蛋白影响的研究
（A） BPA对0.5×10培养的Sertoli细胞的细胞毒性6细胞/厘米2被评估。在第5天将BPA以所需浓度添加到细胞培养物中。XTT细胞毒性试验按照材料和方法本研究表明，BPA在40μM和200μM时无细胞毒性。（B） 对大鼠BTB处发现的选定靶蛋白进行免疫印迹分析，以验证BPA对原代Sertoli细胞培养物中TJ-屏障功能的剂量依赖性影响。将免疫印迹结果进行分析并绘制在（C）中。研究了不同连接类型及其相关适配器的完整膜蛋白的蛋白质水平。在所有研究的标记物中都可以检测到显著下降（C:a–C）。还研究了所选信号激酶的蛋白质水平。磷酸化ERK1（C:d）水平显著增加。（A）和（B）中的结果是三个独立实验的代表性数据n个（C）=3。使用单向方差分析测试和Tukey/Kramer程序进行统计分析。除非另有规定，否则所有治疗组均无显著差异。a、，对< 0.05与车辆控制和40μM BPA；b、，对< 0.05与车辆控制和对< 0.01与40μM双酚A；c、，对< 0.01与车辆控制和对< 0.05与40μM双酚A；日期：，对< 0.01与车辆控制和40μM BPA。
图8
图8。双酚A处理后细胞表面连接蛋白周转率的研究
（A） 采用0.5×10培养的Sertoli细胞进行研究6细胞/厘米2在第5天吃Matrigel-coated菜肴。在4°C下，使用磺化NHS-SS-生物素对支持细胞表面的蛋白质进行生物素化。非结合生物素被猝灭。然后在35°C的200μM BPA或0.1%乙醇（载体对照，VeCtrl）中培养细胞，使生物素化细胞表面蛋白在指定的时间段内发生内吞和降解。获得细胞裂解物。使用UltraLink固定化中性抗生物素蛋白Plus从细胞裂解液中分离生物素化蛋白，并在SDS-PAGE中进行解析。用免疫印迹法检测细胞中残留的生物素化蛋白的数量。用BPA处理细胞后，生物素化闭塞素和N-钙粘蛋白的水平降低与车辆控制。这表明BPA可以提高闭塞素和N-钙粘蛋白的周转率，从而破坏细胞粘附。
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