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细胞死亡疾病。2015年6月；6（6）：e1788。
2015年6月18日在线发布。 数字对象标识：10.1038/cddis.2015.157
预防性维修识别码：项目经理4669836
PMID：26086961

组织蛋白酶D通过损伤线粒体的自噬非依赖性降解保护大肠癌细胞免受乙酰乙酸诱导的凋亡

C S F奥利维拉,1,2 H佩雷拉,1 S阿尔维斯,1 L卡斯特罗,1 F巴尔塔扎尔,三，4 S R Chaves系列,1 一个Preto,1,5和M Corrte-Real公司1,5,*
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补充资料

摘要

醋酸盐是由丙酸杆菌从人体肠道分泌的一种短链脂肪酸，已知可诱导结直肠癌（CRC）细胞线粒体凋亡死亡。我们之前已经证实，乙酸盐也诱导CRC细胞中的溶酶体膜透化，与溶酶体蛋白酶组织蛋白酶D（CatD）的释放有关，后者在线粒体凋亡级联中具有公认的作用。出乎意料的是，我们发现CatD在这一过程中具有抗凋亡作用，因为胃蛋白酶抑制素A（CatD抑制剂）增加了醋酸盐诱导的凋亡。这些结果与我们之前在酵母系统中的数据相类似，表明乙酸激活线粒体依赖的凋亡过程，该过程与哺乳动物CatD的同源物空泡蛋白酶Pep4p的液泡膜渗透和释放有关。事实上，这种蛋白酶是细胞生存所必需的，依赖于其催化活性，并独立于自噬进行有效的线粒体降解。因此，在本研究中，我们评估了CatD在乙酸酯诱导的线粒体改变中的作用。我们发现，与酵母中的乙酸类似，醋酸盐诱导的凋亡与CRC细胞中的自噬诱导无关。此外，用小干扰RNA或胃蛋白酶抑制素A抑制CatD可增强与线粒体功能障碍和线粒体质量增加相关的细胞凋亡。这种效应似乎是特异性的，因为用E-64d抑制CatB和CatL没有效果，在乙酸酯诱导的细胞凋亡过程中，这些蛋白酶也没有显著释放到胞浆中。利用酵母细胞，我们进一步表明，Pep4p在线粒体降解中的作用取决于其蛋白酶活性，并由CatD补充，表明这一机制是保守的。总之，酵母模型提供的线索揭示了一种新的CatD功能，在自噬受损时降解受损的线粒体，从而保护CRC细胞免受醋酸盐诱导的凋亡。因此，CatD抑制剂可以增强乙酰乙酸介导的癌细胞死亡，为CRC的预防或治疗提供了一种新的策略。

大肠癌（CRC）是世界上最常见的癌症之一。1,2在欧洲，它是最常见的恶性肿瘤，也是男女癌症死亡率的第二大原因，2强调需要采取新的策略来预防和治疗CRC。短链脂肪酸（SCFA），即丁酸盐、丙酸盐和醋酸盐，是人体结肠中未消化纤维厌氧细菌发酵的主要副产物。据报道，它们是诱导CRC细胞系分化、生长停滞和凋亡的抗增殖和抗肿瘤药物，三,4,5,6在CRC预防和治疗中开发这些天然产品的兴趣日益浓厚。SCFAs的抗肿瘤作用源于其能够诱导细胞死亡，包括线粒体介导的结肠癌细胞凋亡（caspase依赖/独立）或坏死。三,4,6我们之前还暗示了乙酰乙酸诱导的凋亡中的另一个细胞器，溶酶体。事实上，溶酶体膜通透性（LMP）和组织蛋白酶释放到胞浆中可以以线粒体非依赖性的方式启动溶酶体凋亡途径，或者通过线粒体失稳介导，随后释放凋亡因子。7,8在LMP释放的组织蛋白酶中，组织蛋白酶D（CatD）最初被认为是“家政酶”9自噬所必需的10可作为抗凋亡或促凋亡介质，具体取决于细胞类型和环境。10,11,12然而，癌细胞LMP后CatD触发的确切机制，以及线粒体的信号传递和/或来自线粒体的信号，仍有待阐明。

在之前的一项研究中，我们证明CatD被释放到细胞液中，并保护接受醋酸盐诱导的凋亡的细胞。5这些结果与我们的数据一致，即人类CatD的酵母同源物Pep4p在线粒体介导的乙酸诱导细胞凋亡过程中从液泡转运到胞浆酿酒酵母,13并且它在这个过程中具有保护作用，这取决于它的催化活性。14然而，CatD保护CRC细胞免受乙酸盐暴露的机制仍然未知。研究表明，SCFAs（即丁酸盐和丙酸盐）在CRC细胞中诱导自噬，这是一种延迟线粒体介导的凋亡细胞死亡的适应性策略。15,16,17相反，我们发现酵母CatD独立于自噬参与乙酸诱导的线粒体降解。13因此，我们假设CRC细胞对醋酸盐的反应也会发生同样的情况。在这项工作中，我们评估了CatD如何影响醋酸诱导的CRC细胞系线粒体改变，并具体评估了其在线粒体降解中的作用。我们的结果表明，醋酸盐的抗肿瘤机制以活性氧（ROS）的积累以及线粒体质量和线粒体膜电位（ΔΨm）的变化为特征。我们进一步表明，CatD（而非CatB或CatL）参与了功能失调线粒体的降解，以提高CRC细胞对醋酸盐的存活率，而醋酸盐会损害自噬。因此，我们的数据表明，醋酸盐诱导的细胞凋亡涉及溶酶体和线粒体之间的相互作用，并支持使用益生菌和抑制CatD作为CRC的预防或治疗策略。

结果

醋酸导致CRC细胞氧化应激、ΔΨm变化和线粒体质量增加

醋酸诱导的凋亡与线粒体功能障碍有关，包括ROS增加和ΔΨm改变，尽管仅在HT-29细胞中。三,4我们之前还发现，接触生理浓度醋酸盐的CRC衍生细胞HCT-15和RKO显示出特征性的凋亡标记。5然而，正如我们在酵母中的研究所表明的那样，对线粒体质量的影响，13从未被描述过。因此，我们试图全面测定醋酸如何影响HCT-15和RKO细胞的线粒体功能，特别是ROS的积累以及ΔΨm和线粒体质量的变化。为此，用二醋酸二氢二氯荧光素（H2DCF-DA）或二氢乙硫酸氢钠（DHE），用于检测过氧化氢（H2O（运行）2)或超氧阴离子（O2−)分别是。在12和24天后，HCT-15和RKO细胞中的ROS水平持续增加，以剂量依赖的方式响应醋酸盐 暴露h后，48小时后略有下降 小时（h2O（运行）2HCT-15中(图1a)和RKO电池（未显示），以及O2−在RKO单元中(图1b)). 为了确定乙酸酯诱导的ROS积累是否是由于细胞抗氧化防御的抑制，我们使用定性分析来测量过氧化氢酶活性。18我们发现暴露于半最大抑制浓度（IC50)乙酸盐略微降低HCT-15和RKO细胞中的过氧化氢酶活性，尽管后者更明显(补充图S1).

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醋酸盐诱导CRC细胞氧化应激和线粒体功能障碍。(一和b条)HCT-15和RKO细胞与醋酸盐（70、100或140 HCT-15细胞的mM；110、140或220 12、24和48的RKO电池为mM h.HCT-15-和RKO-阴性对照细胞与新鲜完全培养基孵育相同时间，而阳性对照细胞与500 μM和1 mM小时2O（运行）2分别是。(一)H的积累2O（运行）2HCT-15细胞中检测到H2DCF-DA使用荧光微孔板阅读器。(b条)超氧阴离子（O）的积累2−)用DHE检测RKO细胞，并用流式细胞术定量。(c（c）——e（电子）)使用MitoTracker Green FM和MitoTracker Red CMXROs双重染色检测RKO细胞中的线粒体功能障碍。用110、140或220培养细胞 mM醋酸盐，最多48 h，然后用400染色 nM MitoTracker绿色和200 nM MitoTracker红30码 37时最小值 ºC黑暗中(c（c）)接触110、140或220的细胞线粒体功能障碍的代表性直方图 48 mM醋酸盐 h.绿色平均荧光强度显著增加（MitoTracker green），表明线粒体质量增加，而红色平均荧光强度减少（MitoTracker red CMXRos），表明ΔΨm发生变化。(d日)醋酸盐处理导致平均绿色荧光强度增加，在时间0时归一化为绿色平均荧光强度(T型0），表明线粒体质量增加(e（电子）)醋酸盐处理导致ΔΨm标准化为线粒体质量的变化，通过平均红色荧光强度（FL-4）和平均绿色荧光强度（FL-1）之间的比率进行评估，标准化为T型对于每个时间点，表示至少三个独立实验的值。邦费罗尼试验*P（P）≤0.05; **P（P）≤0.01和***P（P）与阴性对照细胞相比≤0.001。在(c（c）——e（电子）)，用新鲜的完整培养基或50 μM CCCP，分别用作阴性和阳性对照

除抗氧化防御能力下降外，ROS积累可能是凋亡过程的早期事件，与其他线粒体功能障碍相关。19因此，我们评估了醋酸盐是否会导致CRC细胞进一步线粒体改变。我们发现醋酸盐类似于CCCP（羰基氰化物米-氯苯腙）降低了ΔΨm，因为它降低了DiOC的线粒体积累6（3） RKO细胞和DiOC中的MitoTracker Red CMXRos6（3） HCT-15细胞中(补充图S2)同时增加探针的胞浆荧光。由于ΔΨm的变化可能是由线粒体质量的变化引起的，因此我们通过流式细胞术在用MitoTracker Red CMXRos和MitoTracher Green FM染色的RKO细胞中同时定量评估了这两个参数。除了平均红色荧光降低外，还表明ΔΨm降低(图1c)，醋酸盐增加了平均绿色荧光，表明线粒体质量增加(图1c和d). 将乙酰乙酸诱导的ΔΨm变化归一化为线粒体质量后，与时间零点相关(图1e)很明显，短时间接触醋酸盐会导致ΔΨm小幅增加(图1e). 12岁后，这种超极化现象明显 接触110和140小时 mM但不到220 mM醋酸盐。对于较长的暴露时间，所有浓度的该比率均显著降低，表明ΔΨm耗散（对照CCCP处理验证）。我们还研究了乙酸盐对线粒体蛋白水平的影响，即凋亡诱导因子（AIF）、电压依赖性阴离子通道（VDAC1）和线粒体外膜转运子（TOM22）的一个亚基。我们发现，所有剂量的醋酸盐和足叶乙甙都会增加RKO和HCT-15细胞中AIF和VDAC1的水平(补充图S3). 此外，乙酸盐而不是依托泊苷导致TOM22水平升高。

我们的结果表明，醋酸盐导致线粒体功能障碍，增加ROS积累，扰动ΔΨm，并以时间和剂量依赖的方式增加线粒体质量，表明醋酸盐损害有害线粒体的周转。

醋酸盐抑制基础自噬并损害自噬诱导

为了确定醋酸暴露引起的线粒体质量增加是否是由于自噬抑制所致，我们监测了它如何影响Beclin-1水平，Beclin-1是一种众所周知的自噬因子，是III类PI3K复合体的一部分。醋酸盐降低了RKO和HCT-15细胞中的Beclin-1水平，这与抑制自噬一致，并可能解释了醋酸盐处理细胞中线粒体蛋白水平增加的原因(图2a). 接下来我们确定醋酸盐是否影响自噬诱导。我们通过评估自噬标志：LC3-I转化为LC3-II来监测饥饿诱导的自噬（在HBSS培养基中）20（在存在和不存在bafilomycin A1（Baf.A1）的情况下，Bafiloymycin A1是一种H型液泡的特异性抑制剂+-ATP酶用于抑制自噬体与溶酶体的融合）。21HCT-15和RKO细胞系具有高的基础自噬水平，并且不诱导对饥饿的自噬反应，在Baf存在下LC3-II的积累增加证明了这一点。A1已经存在于对照细胞中，并没有因饥饿而改变(图2b–d). 因此，我们无法确定醋酸盐是否影响这些细胞的自噬诱导。为此，我们改用HCT116细胞系，该细胞系在饥饿时表现出增加的自噬流量(图2b–d). 我们发现一个48 h HCT116细胞暴露于IC50，中等浓度和2×IC50醋酸纤维(补充图S4)Baf存在时，LC3-I向LC3-II的转化率降低。A1，在饥饿条件下更为明显(图2e和f). 增加醋酸盐的剂量也会逐渐降低Beclin1和Atg5蛋白的水平，这是自噬体完成所必需的，22,23在完全培养基和饥饿培养基中(图2g). 综上所述，我们的结果表明，在我们的实验条件下，接触醋酸盐不仅不会诱导自噬，而且可以抑制基础自噬和自噬诱导。

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醋酸损伤CRC细胞的自噬。(一)醋酸暴露48小时后细胞内Beclin-1水平 h（110和220 mM；70和140 RKO和HCT-15细胞分别为mM）(b条)HCT116、RKO和HCT-15细胞株中LC3-I/II的免疫印迹分析。细胞保存在完整培养基中或在HBSS培养基中孵育（饥饿）6 有无20时为h nM巴非霉素A1（Baf.A1）。HCT116细胞系对营养限制（饥饿）表现出最强的自噬反应，因此被选择来解决乙酸盐对饥饿诱导的自噬的影响。(c（c）)使用Quantity One软件（Bio-Read制造商）测定HCT116、RKO和HCT-15细胞的LC3-II/actin比率。(d日)自噬流量是通过减去Baf存在下的标准化LC3-II水平来确定的。在没有Baf的情况下获得的相应水平的A1。答：(e（电子）)LC3-I/II和(克)暴露于醋酸盐的HCT116细胞中的Beclin-1和Atg5。细胞未经处理（空白）或用100、150或200处理 42 mM醋酸盐 h.然后，将细胞保存在完整培养基或HBSS培养基（饥饿）中，再加上醋酸盐6次 有无20时为h nM巴法。A1.这些数据表明，醋酸盐以剂量依赖性的方式降低CRC细胞的自噬流量，如LC3-II向溶酶体的递送以及Beclin-1和Atg5蛋白水平的降低所示。(（f）)使用Quantity One软件（Bio-Read制造商）测定HCT116细胞的LC3-II/actin比率。肌动蛋白被用作加载控制。数值为平均值±S。三个独立实验的E.M。典型的免疫印迹如所示(一,b条,e（电子）和克). Bonferroni测试后的单向方差分析，##P（P）≤0.01和###P（P）与HBSS（饥饿培养基）处理的对照细胞相比≤0.001

活性CatD介导线粒体降解并保护CRC细胞免受乙酰乙酸诱导的线粒体功能障碍

决定癌细胞凋亡中线粒体降解是通过选择性或非选择性自噬还是通过自噬无关过程发生的细胞事件或信号，以及对细胞命运的影响，目前尚不清楚。在之前的研究中酿酒酵母，我们表明酵母CatD（Pep4p）在乙酸诱导的细胞死亡中具有抗凋亡作用，这取决于其蛋白水解活性，并且是线粒体降解独立于自噬所必需的。14因此，我们假设CatD与Pep4p类似，是有效降解受损线粒体所必需的。为了验证这一假设，我们评估了CatD如何影响醋酸诱导的CRC细胞线粒体功能障碍。

我们首先分析了已知的CatD特异性药理学抑制剂Pepstatin A（PstA）或靶向CatD的特异性RNA干扰（siRNA）转染是否干扰了醋酸盐诱导的RKO细胞ROS积累。我们发现PstA增加了总O2−和H2O（运行）2暴露于三种醋酸盐浓度下24小时的细胞内积累 小时(图3a和b). CatD的下调更为有效，因为它显著增加了总O和线粒体O2−110处理的细胞中的积累 mM醋酸盐（分别用DHE或MitoSOX检测）(图3c和d). 相反，抑制CatD对足叶乙甙诱导的ROS积累没有显著影响(图3c和d).

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CatD保护CRC细胞免受氧化应激。(一和b条)CatD催化活性的特异性抑制剂PstA对醋酸处理的RKO细胞活性氧水平的影响。PstA（100 μM） 预孵16天 h，然后与醋酸共聚24小时 小时(一)超氧化物阴离子（O2−)用二氢乙硫酸氢钠（DHE）检测RKO细胞，并用流式细胞术定量。(b条)H的积累2O（运行）2在RKO细胞中检测到H2DCF-DA使用荧光微孔板阅读器。(c（c）和d日)CatD沉默对醋酸（110）处理的RKO细胞线粒体超氧化物和总超氧化物产生的影响 mM）或依托泊苷（50 μM） 用于48 h.作为对照，RKO细胞未转染（空白）、未转染干扰对照siRNA或未转染CatD siRNA2O（运行）2(1 mM）被用作ROS生成的阳性对照。(c（c）)用MitoSOX检测RKO细胞线粒体超氧化物的积累，并用流式细胞术定量。(c（c）)CatD的下调诱导线粒体超氧化物产生显著增加，标准化为时间0(T型0）在110处理的RKO细胞中 mM醋酸盐和(d日)总超氧化物的显著积累，归一化为T型0个单元格。数值代表平均值±S。至少三个独立实验的E.M*P（P）≤0.05, **P（P）≤0.01, ***P（P）≤0.001和****P（P）与对照细胞相比≤0.0001。#P（P）≤0.05和##P（P）醋酸处理与醋酸/PstA或醋酸处理与乙酸/CatD siRNA的比较≤0.001

接下来，我们测试了消耗CatD对线粒体质量的影响。转染CatD siRNA明显增加了醋酸和足叶乙甙处理的RKO细胞中线粒体蛋白AIF的水平，尽管在未经治疗的对照组中没有(图4a). 使用上述双染色方案，我们还发现乙酸酯处理的RKO细胞中CatD的耗竭显著增加线粒体质量并降低ΔΨm。相反，它对用足叶乙甙处理的细胞没有显著影响(图4b和c). 总之，这些数据表明CatD通过参与受损线粒体的降解，保护RKO细胞免受醋酸盐诱导的线粒体功能障碍。

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CatD参与CRC细胞自噬非依赖性线粒体降解。(一)CatD亚型（Pro-CatD、中间型和成熟CatD）和AIF的Western blot，在不存在或存在醋酸盐（110 mM）或依托泊苷（50 μM） ●●●●。作为对照，RKO细胞未转染（空白）、未转染干扰对照siRNA或未转染CatD siRNA。肌动蛋白用作负荷对照。(b条和c（c）)CatD沉默对醋酸（110）处理的RKO细胞线粒体功能障碍的影响 mM）或依托泊苷（50 μM） 用于48 小时(b条)CatD下调导致线粒体质量显著增加，时间0(T型0）在用110处理的RKO细胞中 mM醋酸盐和(c（c）)与T型0.对于每根棒材，表示至少三个独立实验的平均值。Bonferroni的测试*P（P）≤0.05; **P（P）≤0.01和***P（P）与阴性对照细胞相比≤0.001。#P（P）≤0.05,##P（P）醋酸盐处理与醋酸盐/CatD siRNA比较≤0.01(d日和e（电子）)特异性CatD抑制剂（PstA）和CatB和CatL抑制剂（E-64d）对醋酸（110和140）处理的RKO细胞线粒体功能障碍的影响 mM）或依托泊苷（50 μM） 用于48 h.E-64d（10 μM） 和PstA（100 μM） 被提前收治了1或16次 h、 分别与醋酸盐或足叶乙甙混合48次 h.用新鲜的完整培养基或50 μM CCCP分别作为阴性和阳性对照。然后用400双染细胞 nM MitoTracker绿色和200 nM MitoTracker红色CMXRos适用于30 37时最小值 在黑暗中ºC，并通过流式细胞仪进行分析。PstA抑制CatD活性导致线粒体质量增加(d日)膜去极化归一化为线粒体质量与T型RKO单元中为0(e（电子）). 对于每个棒，表示至少三个独立实验的平均值。邦费罗尼试验*P（P）≤0.05; **P（P）≤0.01, ***P（P）≤0.001和****P（P）与阴性对照细胞相比≤0.0001。#P（P）醋酸盐处理与醋酸盐/PstA比较≤0.05

为了进一步分析CatD在线粒体降解中的作用是否取决于其蛋白水解活性，我们评估了PstA抑制对该参数的影响。PstA显著增加了接触110和140的RKO细胞的线粒体质量 48米醋酸纤维 h、 但减小了ΔΨm(图4d和e). 相反，暴露于依托泊苷的RKO细胞中CatD的抑制不影响线粒体质量或ΔΨm。此外，E-64d是CatB和CatL的抑制剂（也在CRC细胞中过度表达），24对乙酸盐或依托泊苷处理的细胞的线粒体质量或ΔΨm没有影响(图4d和e). 我们确认E-64d在我们的实验条件下是活性的，因为它降低了接触足叶乙甙（未显示）的细胞中caspase-3的活性，证实了之前描述的CatB和CatL在此过程中的促凋亡功能。25这些结果表明，CatD（而非CatL或CatB）参与了线粒体对醋酸盐的降解反应。因此，我们发现在醋酸盐处理后，只有CatD的活性形式被释放到胞浆中，而不是CatL和微量CatB(图5).

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醋酸盐诱导特异性CatD释放到CRC细胞的胞浆中。醋酸盐对RKO细胞中CatL、CatB和CatD的表达和向胞浆释放的影响。用110处理细胞 mM醋酸盐或50 μ美托泊苷48 h、 或用新鲜培养基作为阴性对照。显示了总组分和细胞溶质组分（Cyto）。肌动蛋白被用作加载控件

上述结果表明，CatD在线粒体降解中的作用取决于其蛋白水解活性。为了进一步支持这一结论并确定这一机制是否保守，我们评估了酵母CatD是否也是如此，以及人类和酵母CatD功能是否等效。为此，我们构建了表达空载体对照的缺乏Pep4p的菌株，构建了同等水平的FLAG标记的野生型Pep4p，一种缺乏蛋白水解活性的双点突变形式，以及人类CatD(图6a). 然后我们比较了它们对乙酸的敏感性和表达空载体的野生型W303细胞的敏感性。根据我们之前的数据，14野生型Pep4p的表达，而非催化失活突变体的表达，恢复了Pep4p-缺陷细胞对乙酸诱导的凋亡的敏感性。现在，我们进一步表明，人类CatD的表达也可以补偿Pep4p的损失，这表明这两种蛋白质在这一过程中具有类似的作用(图6b). 然后用表达线粒体GFP的质粒转化所有菌株，如前所述，通过估计保留绿色荧光的细胞百分比来评估线粒体对乙酸的降解。14虽然野生型Pep4p和CatD的表达恢复了暴露于乙酸的Pep4p-缺陷细胞线粒体降解的延迟，但双点突变型Pep4的表达没有(图6c). 虽然Pep4p在细胞生存和线粒体降解中作用的确切机制尚不清楚，但我们现在已经确定这两者都取决于其蛋白水解活性，并由CatD补充。综上所述，我们的结果表明，Pep4p/CatD参与了乙酸/乙酸酯诱导的线粒体降解，该降解独立于自噬，但依赖于其在酵母和CRC细胞中的催化活性。

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细胞存活和线粒体降解酿酒酵母醋酸处理期间的细胞。W303菌株用空载体（pESC）和第四人民党Δ应变，用空向量（pESC）转换，pESC-政治公众人物4（表达WT-Pep4p），pESC-DPM公司（表达DPM-Pep4p）或pESC-CTSD公司（表达人CatD），与120 mM乙酸最多180 最小值(一)全细胞提取物的免疫印迹分析第四人民党20天后，表达FLAG-tagged WT-Pep4p、FLAG-tagned DPM-Pep4p、FAG-tagging CatD和相应空载体的Δ细胞 生长h。Pgk1p被用作加载控制。(b条)时间为180时的细胞存活率 最小值由标准稀释平板计数确定，并表示为与时间0相关的菌落形成单位（CFU）的百分比。数据表示平均值±S。D(n=3). (c（c）)通过测量没有mtGFP荧光损失的细胞百分比来评估线粒体降解（100%对应于时间0时GFP阳性细胞的数量）。数据表示平均值±S。D(n=4). *P（P）<0.05, **P（P）<0.01和***P（P）<0.001

讨论

CRC是世界上最常见的实体肿瘤之一。2,26富含膳食纤维的饮食与CRC发病率的降低有关，1,27表明CRC可以通过饮食疗法进行预防。15,16,27膳食纤维的一些重大健康益处可归因于其微生物发酵，即通过结肠中的丙酸杆菌转化为SCFA（乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐）。1,6,15,16,28事实上，许多研究表明，这些SCFA可以防止致癌，因为它们可以减少人类结肠癌细胞的生长和分化，并刺激CRC细胞的凋亡。4,6,27,29醋酸盐是最重要的短链脂肪酸之一，但其研究程度不如丙酸盐和丁酸盐。尽管如此，先前的研究表明，醋酸盐抑制结肠癌细胞的增殖并诱导其凋亡三,4,5,6醋酸诱导的CRC细胞凋亡涉及不同的生化事件，包括线粒体的改变。三,4,5我们之前也已经证明，醋酸盐以剂量依赖性的方式诱导CRC衍生细胞的凋亡，其特征是DNA断裂、caspase-3激活、磷脂酰丝氨酸暴露于质膜外叶以及G1亚群的出现5此外，我们发现这一过程与溶酶体碱化、LMP和CatD释放到胞浆中有关。5

已经证实，部分LMP在溶酶体水解酶释放到胞浆后，可以激活固有的caspase依赖性凋亡或caspase非依赖性替代性细胞死亡途径。7,8其中，CatD已成为癌症治疗中的一个重要分子靶点，因为它由包括CRC在内的各种肿瘤细胞过度表达和分泌。30,31CatD在细胞外基质降解和癌细胞生存中起着至关重要的作用，并在局部侵袭和转移形成过程中积极参与癌细胞的侵袭。32,33然而，其在细胞凋亡中的作用取决于细胞类型、特定环境、刺激和催化活性。10,33我们的数据表明CatD在醋酸盐诱导的CRC细胞凋亡中具有保护作用，5正如我们在酿酒酵母。13由于SCFAs，尤其是醋酸盐，作为CRC的潜在预防/治疗药物越来越受到关注，我们试图进一步了解这种溶酶体蛋白酶在特定细胞和刺激环境下抗凋亡作用的机制。根据我们小组和其他人的数据以及本研究，我们提出在醋酸盐诱导的CRC细胞凋亡过程中，溶酶体和线粒体通过细胞器的通透性和蛋白质的选择性泄漏进行沟通。事实上，我们发现醋酸盐会触发CatD释放到胞浆中，但不会触发CatL的释放，并且只会触发少量CatB的释放，这似乎不会产生重大后果。除了溶酶体的改变外，醋酸盐还引发了剂量和时间依赖性的线粒体功能障碍，其特征是线粒体ROS增加，ΔΨ变化米线粒体质量增加，当CatD被抑制时，线粒体质量增加。这种线粒体功能障碍与醋酸及醋酸和丙酸混合物诱导细胞凋亡期间的报道一致弗氏丙酸杆菌在其他CRC细胞（HT-29）中，包括ROS和ΔΨm耗散增加，以及孤立线粒体肿胀。4然而，CatD或溶酶体在这方面的作用没有得到评估。

细胞暴露于乙酸盐后观察到的线粒体质量的增加使我们研究了线粒体周转的减少是否与这种SCFA对自噬的调节有关。先前的研究表明，低剂量（1-10）可触发细胞凋亡 mM）的丙酸盐和丁酸盐可以延迟，因为自噬也被诱导，这可能会潜在地损害SCFAs在结肠癌中的治疗效果。15,16,17事实上，自噬与癌症进展有关，细胞利用自噬降解受损的细胞器、长寿命蛋白质和病原体，并以此维持体内平衡。20,29,34需要进一步的检测来确定低浓度的醋酸盐是否会在CRC细胞中引起类似的适应性反应。然而，我们先前表明，在乙酸诱导酵母细胞凋亡的过程中，不会诱导自噬。13在本研究中，我们证明醋酸盐会削弱HCT116细胞的自噬流量，并降低所有三种细胞系中的Beclin-1水平。因此，我们表明，正常存在于人类肠道中的醋酸盐浓度在CRC细胞中具有先前未表现出的作用：抑制自噬，很可能是通过在醋酸盐诱导的凋亡过程中破坏自噬体和溶酶体融合来实现的。

众所周知，功能失常的线粒体被选择性地靶向自噬降解。16然而，可以想象的是，当自噬不活跃时，细胞会使用其他途径清除受损的线粒体。因此，我们研究了CatD是否参与线粒体降解，类似于酵母中的Pep4p，可能通过消除功能失调的线粒体而起到促进生存的作用。我们表明CatD保护RKO细胞免受乙酰乙酸诱导的氧化应激和线粒体去极化，因为它被PstA抑制或被siRNA下调会导致H水平显著升高2O（运行）2和O2−ΔΨm减小。哈哈等。10此前曾暗示CatD对H有保护作用2O（运行）2-通过参与自噬诱导M059J胶质母细胞瘤细胞的细胞死亡，从而提高细胞在氧化应激下的存活率。10因此，我们已经表明，Pep4p缺失增加了酵母细胞对乙酸的敏感性，这与ROS积累增加有关，14尽管没有诱导自噬。13这些数据以及我们的结果支持了CatD活性降低导致ROS积累增加和线粒体去极化的观点。因此，我们继续确定CatD是否参与受损线粒体的降解，正如我们推测的醋酸诱导CRC细胞凋亡的情况。我们发现，乙酸酯处理的RKO细胞中CatD的下调增加了线粒体质量以及AIF的细胞池。这些发现证实了我们的假设，即CatD通过自噬非依赖性过程参与乙酰乙酸诱导凋亡过程中受损线粒体的降解。虽然没有足够的效率来维持线粒体质量的动态平衡，但由于仍然可以观察到乙酰乙酸诱导的线粒体质量增加，这种替代性降解过程允许细胞处理功能失调的线粒体并延迟细胞死亡。未来很有意思的是，确定CatD是否也被释放，是否参与了对其他SCFA的响应，即直接或通过下游底物的线粒体降解。用PstA抑制CatD与用CatD siRNA获得的结果相似，表明CatD的催化活性是实现这一功能所必需的，正如我们之前发现的酵母和人类CatD的抗凋亡作用一样。5,14我们现在还表明，酵母CatD在乙酸诱导的线粒体降解中的作用取决于其蛋白水解活性，并且可以由人类CatD补充，这表明该机制在进化过程中是保守的。

如上所述，部分LMP随后溶酶体水解酶释放到胞浆中，可以激活固有的caspase依赖性凋亡或caspase非依赖性替代性细胞死亡途径。7,8因此，禁用溶酶体功能作为一种辅助治疗方法正在研究中，以使细胞对凋亡诱导剂敏感。7溶酶体膜的失稳被认为是一种有前途的策略，因为它可以通过启动癌细胞中的溶酶体途径来促进凋亡。8然而，我们的结果表明，溶酶体蛋白酶的释放，特别是CatD，5可能使一种降解过程替代自噬，在细胞生存中具有类似的保护作用，从而抵消溶酶体死亡途径的激活。这将对醋酸盐的疗效产生负面影响，可能还会对触发LMP并损害自噬的其他治疗性化合物产生负面影响。在联合治疗中，需要抑制CatD。

总之，基于酵母系统提供的线索，我们的发现揭示了CatD在自噬非依赖性线粒体降解中的一种新的前生存功能，该功能可以提高醋酸诱导凋亡的CRC细胞的存活率。这些结果为生命和死亡的复杂调控提供了新的视角，并建议使用CatD抑制剂作为SCFA的辅助治疗，以预防/治疗CRC。

材料和方法

细胞系和培养

我们使用了三种来源于人类CRC的细胞系，即RKO巴西V600E，HCT-15KRASG13D公司和HCT116KRASG13D；PI3千卡细胞保持在37 °C，在含有5%CO的增湿大气中2HCT-15细胞在RPMI培养基（法国纽埃Biowest）中生长我-谷氨酰胺和HEPES。RKO细胞在高糖DMEM（Biowest）中生长，并补充1 mM丙酮酸钠和1.5 g/l碳酸氢钠。HCT116细胞生长在McCoy’s 5中 一种（生物西部）培养基。所有培养基均添加10%胎牛血清和100 U/ml青霉素/链霉素。在自噬研究中，我们使用了HBSS（英国佩斯利Gibco）培养基，辅以7.5%碳酸氢钠。

用醋酸盐处理细胞

将细胞接种到合适的无菌板上24小时 在所有实验中，处理前h。我们之前确定了IC50，IC中间（IC中间）和2×IC5048后的醋酸盐 治疗时间：70、100和140 HCT-15为mM；110、140和220 RKO细胞系分别为mM。5IC50，IC内部和2×IC50HCT116的值（100、150和200 mM）分别根据Marques中所述的硫罗丹明B还原平均值计算等。5(补充图S3). 对于每个棒，表示至少三个独立实验的平均值。Bonferroni试验：*P（P）≤0.05, **P（P）≤0.01和***P（P）与阴性对照细胞相比≤0.001。

RNA干扰介导的CatD抑制

RKO细胞以3×10的密度放置在6孔板中4每个孔的细胞数。24天后 h、 在用小干扰RNA（siRNA）寡核苷酸转染前，约70%的融合被证实。细胞转染100 针对CatD的nM靶向加SMART池siRNA（A-003649-16；Thermo Fisher Scientific，Lafayette，CO，USA）。使用经验证的Silencer Select阴性对照（加扰siRNA对照，编号4390843；Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）监测转染性能。用6个 μl Lipofectamine 2000（Invitrogen Corp.，英国佩斯利）。14岁之后 h、 去除转染混合物，细胞未经处理（空白）或用醋酸盐处理（110 mM）或依托泊苷（50 μM（M）)再孵化48个 h在新鲜培养基中。如下所述，进行MitoSOx、DHE和MitoTracker Green和MitoTracker Red CMXRos双重染色。实验分三个重复进行，并通过western blotting监测CatD水平。

细胞内活性氧的测定

二氯荧光素测定

将细胞以1.4的密度接种在12孔板中×105和1.8×105每个孔的细胞数（分别为RKO和HCT-15细胞）。如有指示，用PstA（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）预培养细胞16 h，然后在12、24和48小时内与不含或含有不同醋酸盐浓度的PstA混合 h.处理后，用1x PBS和h清洗细胞两次2将DCF-DA（Sigma-Aldrich）以最终浓度100添加到培养板中 μM.培养板在37 30°C 分钟。然后，用500 μl 90%DMSO/10%PBS（裂解液）10 室温下，在黑暗中搅拌min。H（H）2O（运行）2(500 μM或1 HCT-15或RKO细胞系的mM）作为阳性对照。H（H）2DCF-DA荧光强度检测，发射波长为538 485 nm和激发波长 nm，使用荧光微孔板阅读器（Fluoroskan Ascent FL；Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA）。数值表示为实验结束时每个条件下归一化为细胞数的平均荧光强度。进行了三个独立的实验。

DHE分析

未经处理的细胞（阴性对照）或暴露于不同醋酸盐浓度的细胞12、24和48 h进行分析。使用时，细胞与PstA预孵育16 h，然后与不含或含不同醋酸盐浓度的PstA共培养24小时 h.如上所述抑制RKO细胞中的CatD。约1×106收集漂浮和附着细胞，用1×PBS洗涤，1500×离心克用于5 最小值，与150孵育 nM DHE（分子探针，美国俄勒冈州尤金）（30 最小值，37 °C，在黑暗中）检测超氧化物阴离子（O2−). 用流式细胞术分析氧化DHE的荧光发射。H（H）2O（运行）2(500 μM或1 HCT-15或RKO细胞系的mM）作为阳性对照。数值表示为归一化为的荧光强度平均值T型0（治疗前ROS水平控制）。进行了三项独立实验，并使用Flowing软件（2.5.1版，芬兰图尔库生物技术中心）分析了数据。

MitoSOX分析

MitoSOX红（分子探针）用于检测线粒体超氧化物。约1×106收集漂浮和附着细胞，用1x PBS洗涤，1500×离心克用于5 min，与2.5孵育 μM MitoSOX红30 室温下的最小值。用流式细胞术分析氧化的MitoSOX红的荧光发射。H（H）2O（运行）2(1 mM）用作阳性对照。值表示为阳性染色细胞的百分比，标准化为T型0（治疗前ROS水平控制）。

线粒体改变分析

线粒体质量和ΔΨm分析

MitoTracker Green FM（Molecular Probes）用于分析相对线粒体质量。MitoTracher Green是一种绿色荧光染料，与ΔΨm无关，它定位于线粒体基质，并通过与半胱氨酸残基的游离巯基反应与线粒体蛋白质共价结合。同时使用MitoTracker Red CMXRos（分子探针）监测ΔΨm的变化。MitoTracker Red CMXRos是一种红色荧光染料，通过在线粒体中以膜电位依赖的方式积聚，对活细胞中的线粒体进行染色。未经处理的细胞（阴性对照），暴露于足叶乙甙的细胞（50 μM） 在不同的时间点分析了LMP的诱导剂或不同的醋酸盐浓度。使用时，将细胞与10 μM（2个S公司,3S公司)-反式-环氧琥珀酰基-我-亮氨酸氨基-3-甲基丁烷乙酯（E-64d；Sigma-Aldrich）（CatB和CatL抑制剂）或100 μ1和16的M PstA h、 分别与不同浓度的醋酸盐或足叶乙甙共孵育48小时 h.收集漂浮细胞和附着细胞，用1x PBS洗涤，1500×离心克用于5 最小值，与400孵育 nM MitoTracker绿色FM和200 nM MitoTracker红色CMXRos（30 最小值，37 °C，在黑暗中）。解偶联剂CCCP（50 μM、 30个 min）作为线粒体膜去极化的阳性对照。用流式细胞仪分析荧光发射。每个时间点的线粒体质量值表示为平均绿色荧光强度与对应于时间零点的荧光强度之比(T型0). 每个时间点的ΔΨm值表示为平均红色荧光强度与归一化为对应绿色荧光强度的平均绿色荧光强度之比T型0.进行了三个独立的实验。

荧光显微镜研究

将细胞接种在含有玻璃盖玻片的6孔板中，并暴露于醋酸盐中48 h.实验结束时，用1x PBS清洗细胞，并用20 nM二氧羰基6（3） （分子探针）或400 nM MitoTracker绿色和200 nM MitoTracker红色CMXRos适用于30 最小值，37 °C，在黑暗中。CCCP（50 μM、 30个 min）也被用作ΔΨm损失的阳性对照。盖玻片安装在1x PBS中，并立即在荧光显微镜下观察（Leica DM 5000B；Leica Microsystems，Wetzlar，德国）。针对每个实验条件准备了三张盖玻片，并显示了代表性图像。

流式细胞仪分析

样品在流式细胞仪（Epics XL；Beckman Coulter，迈阿密，佛罗里达州，美国 mW。使用FL-4（488/620）检测红色荧光 nm），并使用FL-1（488/525）检测绿色荧光 纳米）。总共30个 获得了000个细胞每使用Flowing软件（2.5.1版，图尔库生物技术中心）分析样本和数据。

CRC细胞系自噬的评估

未经处理（空白）或经IC处理的细胞系50，IC内部或2×IC50醋酸浓度培养42 h在完全培养基中。随后，在HBSS培养基中培养细胞6 有无20时为h 毫巴。A1（Acros Organics，Geel，Belgium），不含或含有醋酸盐。

酵母细胞存活和线粒体降解测定

酿酒酵母使用菌株W303-1A作为野生型菌株。这个第四人民党Δ突变体通过同源重组在W303-1A中构建政治公众人物4::kanMX4码用PCR从相应的Euroscaw缺失菌株中扩增出破坏盒。PCR证实了盒的正确整合。构建CatD旗帜，通过PCR从质粒pJP1520中扩增插入物-CTSD公司（包含人类CatD cDNA）并通过同源重组整合到pESC-His载体中。通过测序验证了正确的整合。用空载体（pESC）转化W303-1A菌株第四人民党Δ应变用空载体（pESC）pESC转换-政治公众人物4，pESC-DPM公司和pESC-CTSD公司分别用于表达WT-Pep4、双点突变（DPM-Pep4p）或人类CatD的质粒。用pGAL-CLbGFP转化菌株（参见Okamoto等。35)用于线粒体降解研究的载体。如前所述，进行菌株生长条件、乙酸处理和线粒体降解试验。14

总蛋白/胞浆蛋白提取物的制备和western印迹

如前所述，进行哺乳动物细胞的细胞裂解、蛋白质样品制备（总量和细胞溶质）和蛋白质印迹5有25个 μ在SDS-PAGE前，每车道施用的总蛋白或胞浆提取蛋白g。总酵母抽提物通过悬浮2×10制备60.5个单元格 ml水并添加50 μ3.5%的混合物β-巯基乙醇2 M氢氧化钠。15分钟后 在冰上孵育min，蛋白质沉淀50 μ第1页，共3页 M三氯乙酸15 冰块上的最小值。快速离心后，将颗粒重新悬浮在Laemmli缓冲液中进行SDS-PAGE。

使用的主要抗体是抗Beclin-1（1以下为：3000; 细胞信号技术，荷兰莱顿），抗LC3-II（1以下为：5000; Sigma-Aldrich），抗Atg5（1以下为：3000; Sigma-Aldrich），抗CatD（1以下为：100; Calbiochem，美国加利福尼亚州圣地亚哥），抗CatB（1以下为：300; 英国剑桥Abcam），反CatL（1以下为：1000; Abcam），抗AIF（内部）兔多克隆抗体（1以下为：500; Chemicon International，Billerica，MA，USA），抗VDAC1（1以下为：2000; MitoSciences，俄勒冈州尤金，美国），抗Tom22（FL-145）（1以下为：1000; 圣克鲁斯生物技术，圣克鲁斯，加利福尼亚州，美国），抗肌动蛋白（圣克鲁斯生技，圣克鲁兹），抗FLAG（1以下为：5000; Sigma-Aldrich）和抗酵母磷酸甘油酸激酶（PGK1）抗体（1以下为：5000; 分子探针）。使用的二级抗体是过氧化物酶偶联的AffiniPure山羊抗兔IgG（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，USA）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠免疫球蛋白IgG。随后使用ECL检测系统（英国白金汉郡Amersham生物科学公司）和Chemi-Doc XRS系统（美国加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室公司）的分子成像仪进行化学发光检测。进行时，使用Quantity One软件（4.6.9版，Bio-Read制造商，加利福尼亚州Hercules，USA）对蛋白质带进行密度分析，并将肌动蛋白水平用作蛋白质负荷的标准化控制。

统计分析

数据表示为平均值±S。三个独立实验的D。统计显著性分析通过单因素方差分析确定，然后通过Dunnett或Bonferroni检验，使用Prism软件与对照组进行多重比较（GraphPad，加利福尼亚州La Jolla，美国）。这些差异对于P（P）-值低于0.05。

致谢

我们感谢Frank Madeo（格拉茨大学）提供质粒pESC、pESC-政治公众人物4和pESC-DPM公司和Elisabete Fernandes（明尼苏达大学）为pESC-CTSD构建。这项工作得到了FEDER通过POFC–COMPETE和Fundaço para a Ciéncia e Tecnologia通过PEst-OE/BIA/UI4050/2014和FCTANR/BEX-BBCM/0175/2012项目提供的支持，以及CSF Oliveira（SFRH/BD/77449/2011）、H Pereira（SFRH/BD/73139/2010）、L Castro（SFRH/DD/93589/2013）和S Chaves（SFR/BPD/89980/2012）的研究金。

术语表

BafA1型巴菲尔霉素A1
B类组织蛋白酶B
类别D组织蛋白酶D
CatL公司组织蛋白酶L
CRC公司大肠癌
CCCP公司羰基氰化物间氯苯腙
E-64天(2S公司,3S公司)-反式-环氧琥珀酰基-我-亮氨酸氨基-3-甲基丁烷乙酯
ΔΨm线粒体膜电位
LMP公司溶酶体膜透化
玫瑰红活性氧物种
PstA（磅/平方英寸）胃蛋白酶抑制素A
SCFA公司短链脂肪酸
SRB公司硫罗丹明B

笔记

作者声明没有利益冲突。

脚注

补充信息附在细胞死亡与疾病网站上的这篇论文(网址：http://www.nature.com/cddis)

C Munoz-Pinedo编辑

补充材料

补充数据

工具书类

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