短链脂肪酸（SCFA）是人体肠道中细菌发酵未消化膳食纤维的主要副产品。1对于醋酸盐（2C）：丙酸盐（3C）：丁酸盐（4C），三种主要SCFA之间的摩尔比为～60:25:15。2据报道，SCFAs可诱导结肠癌细胞分化、生长停滞和凋亡。三流行病学研究也支持SCFAs的抗癌作用，研究表明高纤维饮食与结肠癌的发病率和生长降低有关。4
自噬是一个进化上保守的分解代谢过程，其中细胞质内容物和细胞器转移到双膜小泡中，称为“自噬体”。5自噬体最终与溶酶体融合，其内容物被降解酶分解，随后循环使用。6自噬是细胞内长期存活的蛋白质和细胞内稳态过程中受损细胞器的周转机制。自噬在组织发育、分化和重塑中具有重要作用。7它也与肿瘤发展等疾病有关，但其确切作用尚不明确。
已经观察到许多抗肿瘤治疗，包括放射治疗和DNA损伤性化疗，可以诱导自噬。8，9抗肿瘤治疗诱导的自噬是促进肿瘤细胞死亡，还是代表抵抗治疗的自卫机制，仍存在争议。一些观察结果支持自噬对癌细胞生存不利的观点，包括放疗或化疗诱导对凋亡有抵抗力的癌细胞株细胞死亡的能力取决于自噬诱导。8另一方面，越来越多的证据表明，自噬是一种通过消除凋亡来对抗抗肿瘤治疗的自我保护策略。10这些看似矛盾的发现表明，没有一种独特的范式来解释自噬在肿瘤发生中的作用。因此，可以想象自噬在肿瘤发生的不同阶段或背景下可能具有不同的作用。
迄今为止的证据表明，SCFAs的抗肿瘤作用是基于其在结肠癌细胞中诱导凋亡细胞死亡（I型程序性细胞死亡（PCD））的能力。11有趣的是，据报道，短链脂肪酸可增加多种线粒体相关基因和一系列与蛋白质周转相关的基因的表达，但其生理相关性尚待了解。12在此，我们报告了SCFAs，尤其是丙酸盐，诱导自噬和自噬的诱导减弱了SCFA对结肠癌的治疗效果。
结果
丙酸盐诱导结肠癌细胞自噬
短链脂肪酸，特别是丙酸盐和丁酸盐，因其对结肠癌的抗肿瘤作用而闻名。13与这些报告一致，丙酸通过IC抑制HCT116和SW480细胞50第9页和第20页 mM，而丁酸对IC的细胞毒性更强50第页，共5页 mM（补充图S1）。
GFP-LC3重新分布到易于观察的“点状物”是一种常用的监测自噬过程中自噬体形成的技术。丙酸盐暴露显著触发了特征性点状GFP-LC3的形成，表明GFP-LC2在自噬体形成过程中的募集(). 丙酸盐处理（3 mM）导致点状GFP-LC3细胞的百分比比PBS治疗的癌细胞增加了10倍36 小时(). 丙酸诱导的自噬具有时间依赖性(). 溶酶体相关膜蛋白2（LAMP-2）是溶酶体膜的重要组成部分，据报道对溶酶体降解自噬液泡至关重要。14丙酸引起LAMP-2表达的广泛上调(和补充图S2a）。上调的LAMP-2显示点状结构，并与GFP-LC3点共定位，表明自溶体形成。丙酸盐处理后点状GFP-LC3的形成不仅限于HCT116细胞，而且在GFP-LC2表达稳定的SW480细胞中也观察到（补充图S2d和e）。丁酸在HCT116和SW480细胞中以类似于丙酸的方式诱导自噬（数据未显示）。
丙酸盐诱导结肠癌细胞自噬。(一)用丙酸（C3，3）处理大量稳定表达GFP-LC3的HCT116细胞 mM）用于36 h或在无血清培养基（阳性对照）中饥饿24小时 h.通过LysoTracker DND-99或MDC染色监测酸性囊泡细胞器的形成。氯喹（CQ）（5 μM） 增加自噬体的积累。用荧光显微镜在×600倍放大率下拍摄细胞的代表性图像。注意，复合面板中的粉红色显示了脓肿GFP-LC3、LysoTracker DND-99和MDC染色的共定位。(b条)量化每个细胞具有八个以上GFP-LC3点的细胞百分比表示为“GFP-LC3vac细胞（%）”。用指定浓度的丙酸盐处理表达GFP-LC3的细胞36 h（i）。由3引起的点状GFP-LC3细胞百分比 在不同时间点监测mM丙酸盐（ii）。对至少100个表达GFP-LC3的细胞进行计数。*P（P）<0.01;**P（P）与相应响应时间的PBS对照相比。用丙酸盐处理HCT116细胞（3 mM）在CQ（5）在场或不在场的情况下 μM） 对于24 h.用LAMP-2抗体对细胞进行染色(c（c）)或p62抗体(d日). 使用Olympus Fluoview共聚焦显微镜，使用×60浸油物镜拍摄细胞的代表性图像。(e（电子）)对GFP-LC3稳定表达的HCT116细胞进行不同浓度（i）的丙酸盐或（3）丙酸盐处理 mM）用于指定的时间（ii）。对细胞裂解物进行免疫印迹，以对抗几种自噬标记物。在CQ（iii）存在下用丙酸盐处理的细胞中也检测了自噬标记物。(（f）)丙酸盐处理后HCT116细胞中酸性囊泡细胞器形成增加反映在点状LysoTracker染色升高和MDC掺入增加。HCT116细胞受到不同浓度（i）的丙酸盐或丙酸盐（3 mM）用于指定的时间（ii）。用染料对细胞进行染色并进行流式细胞术分析。条形代表平均值±S。E.公司(n个=4).*P（P）<0.01;**P（P）<0.001，与相应时间的PBS控制相比
在自噬体形成过程中，新生的LC3被加工成可溶性形式LC3-I，LC3-I被进一步修饰成自噬膜结合的LC3-II，后者的蛋白质可以从非结合形式（LC3-I）中分离出来并通过免疫印迹检测。免疫印迹分析显示丙酸盐处理后存在LC3-II，LC3-II水平在3 丙酸处理的mM(). LC3-I到LC3-II的转换程度最初很低（早在6 h丙酸后处理），但此后显著增强(). 除LC3外，p62/SQSTM1，另一种自噬的生化标志，也减少了(和补充图S2b）。另一方面，对自噬体形成至关重要的ATG7水平上调。丙酸盐还增加了LC3-I到LC3-II的转化以及GFP-LC3-I至GFP-LC3-II的转化，并降低了SW480细胞中的p62水平（补充图S2g）。
经历自噬的细胞通常会形成双膜酸性囊泡细胞器（自噬体），可通过特定染料检测到。用丙酸盐浓度增加的HCT116细胞处理后，溶菌酶追踪或MDC染色的自体溶酶体样结构逐渐增加，类似点状结构(). 此外，GFP-LC3点状物与LysoTracker和MDC染色在很大程度上共定位，表明形成了自溶体。丙酸盐浓度为3时，自噬空泡的形成达到峰值 mM，并且不能通过增加丙酸盐浓度来进一步促进(). 丙酸盐还增加了SW480细胞中自噬液泡的数量（补充图S2d和f）。综上所述，我们得出结论，丙酸盐处理的细胞中发生了以自噬为特征的细胞质酸性泡状细胞器的形成。
因为LC3-II在自噬过程中会受到溶酶体降解的影响，所以LC3-II水平的升高并不总是能够准确地反映完整的自噬诱导。相反，当下游蛋白质降解受损时，LC3-II可能会积累。为了更准确地评估自噬通量，我们评估了LC3-II在溶酶体促生长剂氯喹（CQ）存在下的积累，氯喹阻断了自噬的最后一个关键步骤，即自噬体内容物的酸依赖性降解。丙酸盐和CQ的联合治疗导致LC3阳性小泡的积聚，并在24小时后导致点状LC3荧光增加10倍 小时(). 检测到LC3-II、GFP-LC3-II和p62的进一步积累(). 我们还发现CQ显著促进酸性囊泡细胞器的积累(). 综上所述，这些观察结果进一步支持以下结论：丙酸盐介导的LC3-II表达增加是自噬体形成加速的结果，而不是溶酶体清除受损的结果。
丙酸诱导的自噬激活与mTOR通路抑制相关
自噬调节是一个复杂的过程，取决于一系列因素。雷帕霉素的哺乳动物靶点（mTOR）对自噬具有负调节作用，这一点已经得到了很好的证实。15Ser2481的mTOR自磷酸化被视为其催化活性的指示物。Western blot分析显示丙酸导致Ser2481 mTOR磷酸化状态的强烈时间依赖性降低，而总mTOR水平没有明显变化(). 免疫印迹分析显示，真核细胞起始因子4E-结合蛋白（4E-BP1）的磷酸化明显降低，4E-BPl是mTOR活性的关键下游效应器，16暴露于丙酸盐后以剂量和时间依赖性的方式(). 此外，我们分析了另一个主要mTOR底物p70S6K的磷酸化状态，其在Thr389的磷酸化状况已被描述为反映mTOR活性，17而Thr421/Ser424的磷酸化被认为通过减轻伪底物抑制来激活p70S6K。7发现Thr389处p70S6K磷酸化降低 丙酸处理后h，然后增加25 h、 观察到p70S6K（P-Thr389）占总p70S6K的比率下降了三倍(). Thr421/Ser424上的p-p70S6K水平显示出与Thr389上的p-p 70S6K类似的模式。我们还发现，Ser-2448处的mTOR磷酸化是p70S6激酶的靶点，18也减少了。丙酸也抑制SW480细胞中的mTOR通路（补充图S3）。总之，这些观察证实mTOR信号通路的下调是丙酸诱导自噬的机制。
丙酸诱导的自噬激活与mTOR通路抑制相关。用不同浓度（顶部）的丙酸盐处理HCT116细胞15 h或带3 mM丙酸盐用于指定时间（底部）。western blot检测mTOR及其主要下游底物4E-BP1和p70S6激酶的磷酸化状态。至于4E-BP1磷酸化，γ代表4E-BP1的超磷酸化形式，而β和α代表4E-BP1的中等和低磷形式。这些数据代表了至少三个独立的实验
SCFA下调mTOR通路与AMPK通路激活相关
为了描述SCFA降低mTOR激活和伴随自噬诱导的分子机制，我们研究了参与mTOR调节的上游信号事件的激活状态。值得注意的是，导致mTOR激活的两个独立途径已经被很好地建立：致癌Akt/蛋白激酶B-PI3 K途径激活mTOR以响应营养素和生长因子的引入，AMP-activated protein kinase（AMPK）途径抑制mTOR活性以响应代谢应激，如营养素缺乏诱导的细胞ATP耗竭。19我们首先假设丙酸诱导的mTOR信号通路激活可能是PI3K-Akt通路抑制所致。免疫印迹分析未检测到任何Thr处Akt磷酸化的明显差异308或Ser473和Ⅰ/Ⅲ类PI3-激酶的表达水平(). 非磷酸化Akt的水平也没有改变。有趣的是，观察到PTEN表达轻微但持续下降(). 数据表明PI3K-Akt信号通路的下调与丙酸诱导的mTOR通路的下调无关。
通过抑制mTOR通路诱导自噬与AMPK通路激活有关。用指定浓度的丙酸盐处理HCT116细胞15 h或带3 mM丙酸盐用于指定时间。(一)western blot检测磷脂酶Akt、PTEN和Ⅰ/Ⅲ类PI3激酶的表达水平。(b条)AMPK的磷酸化状态α/βwestern blot检测到亚基和AMPK下游效应物乙酰辅酶A羧化酶。数据表示为至少三个独立的实验。(c（c）)AMPK的表达水平α在感染了AMPK的HCT116细胞中α检查是否存在强力霉素（Dox）。western blot检测mTOR通路的直接下游靶点（p70S6）和几个自噬标记
接下来，我们分析了在丙酸盐治疗期间AMPK信号通路激活是否与mTOR通路抑制有关。作为细胞生物能量学的主要传感器，AMPK介导的信号通路被描述为感知细胞内能量状态和调节细胞代谢。据报道，AMPK是自噬的正向调节因子。20AMPK在α苏氨酸172亚基（Thr172)为了响应AMP与ATP比率的增加，所有已知AMPK同源物的激活都需要AMP与ATP的比率。21丙酸增加了AMPK的磷酸化水平α早在7岁时HCT116细胞中 丙酸处理后h(). 此外，尽管有报道称258或Ser第485页/491页不会引起任何可检测到的AMPK激活，21我们观察到AMPK磷酸化水平升高α在Ser485对于α1和Ser491对于α2 (). 检测到AMPK的一个直接下游靶点乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的磷酸化。丙酸盐也增加了AMPKαThr下的磷酸化172SW480电池中（补充图S4）。
AMPK作为一种由催化激酶亚单位组成的异源三聚体复合物存在于细胞中(α)和两个调节亚单位(β和γ). 以下人员的在场β/γ亚单位有助于α亚单位，有助于通过其活性位点阻止自抑制结构域，并增强变构活化（Thr172磷酸化）。与Thr的磷酸化增加相反172的α丙酸亚基显著降低了AMPK的磷酸化水平β两种Ser的亚单位181和Ser182尤其是在高浓度（10 百万分之一）(). 此外，AMPKγ-1也减少了(). 是否减少β1亚基磷酸化和γ在丙酸盐处理期间，AMPK的表达在调节中起部分作用，有待进一步研究。
为了进一步研究AMPK对丙酸介导的mTOR信号抑制和自噬激活的依赖性，我们使用感染了多西环素诱导的shRNAs抗AMPK表达的HCT116细胞α与AMPK在mTOR信号活性下调中的作用一致，丙酸盐介导的p70S6激酶磷酸化抑制在感染AMPK的细胞中明显不明显αshRNA(). AMPK中丙酸触发的自噬诱导也受损αshRNA感染细胞，从而证实AMPK激活是这些事件的主要机制(). 综上所述，我们得出结论，丙酸诱导HCT116和SW480细胞自噬是基于AMPK途径激活，而不是PI3K-Akt信号的减少，以及随后mTOR的下调。
丙酸诱导的AMPK信号激活与线粒体缺陷诱导的细胞ATP耗竭和氧化应激相关
上述数据表明，丙酸通过激活AMPK抑制mTOR通路。AMPK对ATP浓度的变化非常敏感。因此，我们确定丙酸盐激活AMPK是否是由细胞ATP减少引起的。显示在从30开始急剧增加后 最短5分钟 h、 丙酸处理后HCT116细胞内ATP水平稳定下降。丙酸诱导的ATP减少和AMP/ADP上调通过HPLC进一步证实（补充图S5a）。在SW480细胞中也观察到丙酸盐处理后类似的ATP波动模式（补充图S5b）。
丙酸诱导的AMPK信号激活与线粒体缺陷诱导的细胞ATP耗竭和氧化应激有关。(一)用丙酸盐处理HCT116细胞（3 mM）。使用CellTiter-Glo发光细胞活性测定试剂盒测量细胞内ATP水平。条形代表平均值±S。E.公司(n个=4). (b条)用丙酸（0，1，3，10）处理HCT116细胞 mM），并对JC-1进行流式细胞术染色。红色荧光（FL-2（R3））降低的细胞数量显著增加，表明Δψ（i） ●●●●。极化细胞百分比与去极化Δψ以条形图（ii）表示。条形代表平均值±S。E.公司(n个=3). (c（c）)线粒体同时用MitoTracker深红色和MitoTracher绿色FM染色，并用流式细胞术测定染色强度(我和ii（ii）)，平均荧光显示在条形图中(三). 条形代表平均值±S。E.公司(n个=3). (d日)用丙酸盐处理HCT116细胞（3 mM） μM）24 h.然后用钙黄绿素-AM、氯化钴对细胞进行染色2和MitoTracker Red。通过荧光显微镜获得了具有代表性的图像。放大倍数，×600。(e（电子）)丙酸盐处理的细胞用MitoTracker深红色和钙黄绿素AM染色。用流式细胞术分析染色强度(我)并以条形图的形式显示(ii（ii）). 条形代表平均值±S。E.公司(n个=3). (（f）)用丙酸盐处理HCT116细胞（3 mM）是否存在N-乙酰半胱氨酸（NAC）（1 mM）用于24 h，细胞用羧基-h染色2通过荧光显微镜获得ROS检测的DCFDA和代表性图像。放大倍数，×100。(克)通过流式细胞术分析羧基DCF荧光。(小时)用丙酸（0，1，3，10）处理HCT116细胞 mM）进行48 h.细胞用羧基-h染色2DCFDA和MitoTracker深红色。用流式细胞术分析荧光强度。羧基-H增强的细胞百分比2DCFDA和减少的MitoTracker深红色染色显示为条形图。条形代表平均值±S。E.公司(n个=3)
能源耗尽或细胞能量生成缺陷会导致ATP耗尽。因此，我们接下来研究丙酸盐治疗期间细胞ATP减少是通过线粒体质量减少、线粒体功能受损还是两者兼而有之来实现的。丙酸导致线粒体膜去极化，表现为JC-1染色细胞数量增加，在较低的红色荧光信号强度（FL-2轴）中JC-1荧光降低(). 除了JC-1之外，我们还使用了MitoTracker Deep Red（线粒体追踪器深红色）来监测Δψ流式细胞术可鉴定两组具有不同MitoTracker深红色染色强度的细胞(). 丙酸盐以剂量和时间依赖性的方式增加了花期强度较低的线粒体比例，这反映了去极化线粒体().
Δ损失ψ可能是由线粒体膜通透性转换（MPT）增加引起的。22测试MPT的诱导是否与丙酸盐介导的Δ降低有关ψ用丙酸盐处理HCT116细胞，并用建立的方法分析MPT，包括用MitoTracker深红色、钙黄绿素-AM和CoCl进行荧光染色2。如所示，钙黄绿素保留在未经处理的细胞中，并与MitoTracker深红色标记的线粒体共定位。然而，丙酸盐处理导致线粒体钙黄绿素荧光损失，这是由于钙黄绿质从线粒体泄漏，并被随后添加的CoCl猝灭2此外，钙黄绿素荧光的减少与线粒体追踪器深红色信号的同时减少有关()，表明Δ的损失ψ在连续孔隙活化后观察到。环孢霉素A部分阻断了MPT的诱导(). 总之，这些数据表明Δ的损失ψ与丙酸处理诱导MPT相关。
据报道，MPT诱导后活性氧（ROS）生成增加。23事实上丙酸杆菌、丙酸盐和醋酸盐已被证实可增强人类结直肠癌细胞系中ROS的生成。24丙酸处理后，羧基-DCF阳性染色的细胞百分比增加()，添加抗氧化剂后会减弱N个-乙酰半胱氨酸（NAC）。我们还注意到，羧基DCF阳性染色的细胞是线粒体膜电位受损的细胞，如MitoTracker红染色减少所反映的(). 观察结果表明，丙酸盐处理过程中产生ROS的来源可能来自有缺陷的线粒体。除了AMP/ATP比率增加外，ROS还充当激活AMPK的信号分子。25活性氧的过度生成被认为在自噬的启动中起作用。26因此，研究了NAC对丙酸盐介导的自噬的抗氧化作用。抗氧化剂NAC抑制丙酸盐诱导的ROS积累()随后减弱了自噬诱导（补充图S5c），提供了ROS可能参与自噬发生的证据。环孢素A能够减弱MPT并减少ROS的释放（数据未显示），也能够缓解丙酸盐触发的ROS积累和随后的自噬反应（补充图S5c）。然而，我们无法完全阻止NAC或环孢菌素A的自噬反应，这表明丙酸也能诱导ROS依赖性自噬。
功能失常的线粒体被选择性地靶向自噬降解。因此，我们怀疑减少细胞ATP生成的另一种可能性是否是由于线粒体质量减少。我们使用了MitoTracker Green FM，它定位于线粒体，与Δ无关ψ，以测量线粒体质量。检测到MitoTracker绿色荧光略有增加12 丙酸盐暴露后h(). 综上所述，研究结果表明丙酸盐处理期间细胞内ATP的下降归因于Δ的丢失ψ而不是线粒体质量的降低。
缺陷线粒体是自噬降解的靶点
自噬降解选择性地以去极化线粒体为目标进行消化和消除，这是一个称为“线粒体吞噬”的特殊过程，其目的是清除细胞中受损的线粒体，并帮助阻止凋亡途径的激活。27如所示在未经处理的细胞中，我们观察到存在点状线粒体分布。然而，在接受丙酸诱导自噬的HCT116细胞中，我们观察到线粒体涂片染色，染色强度显著降低，线粒体和点状GFP-LC3之间的共定位增加。COXIV染色也证实了丙酸增加了GFP-LC3和线粒体之间的共定位(). COXIV和LAMP-2之间的共定位增加也支持了定位于缺陷线粒体的自溶体(). 还观察到COXIV与泛素结合蛋白p62之间的共定位增加，该蛋白与LC3相互作用并调节自噬体的形成(). CQ阻断自噬降解导致线粒体聚集体积累，与LAMP-2和p62聚集体重叠。
缺陷线粒体是自噬降解的靶点。(一)用丙酸（3）处理GFP-LC3稳定表达的HCT116细胞 mM）或车辆控制（PBS）24 h.线粒体用MitoTracker深红色染色，并通过荧光显微镜获得代表性图像。放大倍数，×600。箭头表示丙酸诱导细胞自噬。注意细胞内线粒体涂片染色，自噬激活，GFP-LC3点的形成反映了这一点。合并图像中的黄色表示GFP-LC3与线粒体共定位。处理后的细胞也用COXIV抗体染色(b条)用共焦显微镜进行有丝分裂检测。用丙酸盐处理HCT116细胞（3 mM）在CQ（5）在场或不在场的情况下 μM） 用于48 h.细胞用COXIV/LAMP2染色(c（c）)或COXIV/p62(d日)抗体。使用Olympus Fluoview共焦显微镜和×60浸油物镜获得代表性图像。用丙酸（3）处理GFP-LC3稳定表达的HCT116细胞 mM）在CQ（5）在场或不在场的情况下 μM） 在指定的时间内。流式细胞术分析GFP-LC3和MitoTracker深红色荧光(工程安装)GFP荧光增强和MitoTracker深红色染色减少的细胞比例以条形图表示(环境影响指数). 条形代表平均值±S。E.公司(n个=4). 箭头表示丙酸诱导细胞自噬
流式细胞术分析支持丙酸触发的有丝分裂，表明丙酸处理后，MitoTracker深红色染色减少且GFP-LC3荧光增强的细胞比例显著增加(). CQ终止自噬降解显著增加了缺陷线粒体的积累(). 研究结果表明，有丝分裂选择性地以膜电位去极化的线粒体为靶点。
通过线粒体生物生成和糖原和脂质代谢途径的改变拯救细胞能量危机
AMPK通过下调ATP消耗合成代谢途径和上调ATP生成分解代谢途径，为低营养素可用性条件下的能量稳态提供了微调放大机制。28通过这种方式，AMPK激活可以恢复细胞能量稳态。在这项研究中，丙酸降低了脂肪酸合成酶的表达()通过催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成长链脂肪酸（LCFAs）来储存能量。我们还发现GSK-3β通过糖原合成酶的磷酸化和失活来抑制endergonic糖原合成，被下调(). 此外，AMPK介导的磷酸化使ACC失活()，可能会抑制从头开始脂质合成，而失活的ACC增加了LCFAs的线粒体输入和氧化，导致ATP的生成。29
通过线粒体生物生成和糖原和脂质代谢途径的改变拯救细胞能量危机。(一)用不同浓度的丙酸盐处理HCT116细胞24小时 h（顶部）或带3 mM丙酸盐用于指定时间（底部）。脂肪酸合成酶和GSK-3的表达水平βwestern blot检测。通过半定量逆转录酶PCR（RT-PCR）评估丙酸盐处理后HCT116细胞线粒体生物发生调控基因的表达谱(b条)和实时PCR(c（c）). 条形代表平均值±S。E.公司(n个=4). 核基因线粒体转录因子A（Tfam）；线粒体转录因子B（mtTFB）；核呼吸因子-1和2（NRF-1和-2）；DNA聚合酶γ（Pol-γ); 和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ助活化剂1（PGC-1）。(d日)western blot检测线粒体氧化还原载体亚基的蛋白水平
能量剥夺以AMPK依赖的方式刺激骨骼肌线粒体的生物生成。30我们检测了几个线粒体生物发生标记，这些标记在丙酸盐处理后HCT116细胞的OXPHOS蛋白表达/输入和血红素生物合成的反式激活基因协调中起关键作用。如所示丙酸刺激了mRNA水平的Tfam和mtTFB表达，峰值分别为8.5和11.5 h、 然后恢复到预刺激水平。协调NRF-1和-2以及pol-γ早在12岁时，mRNA水平的表达也受到刺激 治疗后h，但长期治疗后有所减少。尽管mRNA含量的相对增加在各种转录因子之间有所不同，但在丙酸盐暴露后的快速诱导中观察到了类似的总体趋势。与这些基因的上调相反，我们观察到PGC-1转录的时间依赖性降低().
为了确定线粒体生物发生是否真的被诱导，我们检测了线粒体氧化还原载体亚单位的蛋白质水平。线粒体膜上许多复合亚单位的表达增加8 治疗后h，20天后恢复到刺激前水平 小时(). 线粒体生物发生的刺激性也通过MitoTracker Green FM荧光的增加得到证实总之，数据表明HCT116细胞通过下调糖原和脂质合成等合成代谢过程来适应丙酸诱导的ATP耗竭，同时刺激线粒体生物生成以恢复细胞能量平衡。
抑制自噬增强丙酸诱导的凋亡细胞死亡
SCFAs通过诱导caspase-3介导的凋亡而具有抗肿瘤活性。11为了确定丙酸诱导的自噬和凋亡之间的相互联系，应用自噬抑制剂检测丙酸处理期间HCT116和SW480细胞的细胞活力。丙酸处理细胞中观察到的点状GFP-LC3的形成在2 百万分之一(). 24和48 h、 3-MA联合治疗显著增强丙酸酯的细胞毒性作用(). 12点 治疗开始后h，丙酸盐/3-MA治疗导致膜联蛋白V阳性癌细胞显著增加(). 这种差异持续到48 h、 当观察到annexin V阳性肿瘤细胞百分比相差1.75倍时。作为反映癌细胞凋亡的一种独立方法，免疫印迹显示促凋亡caspase-7和执行者caspase-3的裂解增加，它们是线粒体凋亡事件的关键介质，31在癌细胞裂解物中获得24 与单独使用丙酸盐治疗的患者相比，丙酸盐/3-MA治疗开始后h(). 通过添加氯喹来防止自噬降解也会增强HCT116细胞的凋亡，特别是在治疗的后期（48 h）(). 此外，为了证实AMPK在丙酸触发的自噬中的作用，我们研究了shRNA-介导的AMPK是否α沉默可能类似于自噬抑制对丙酸细胞毒性的影响。shRNA介导的AMPK下调α增加丙酸对HCT116细胞的毒性，如细胞活力降低所示（补充图S6d）。总之，这些结果表明自噬反应在阻止丙酸诱导的结肠癌细胞死亡中具有保护作用。
抑制自噬可增强丙酸诱导的凋亡细胞死亡。(一)用丙酸盐处理HCT116细胞（3 mM）用于36 在没有或存在3-MA（2）的情况下 mM）。同样的处理也适用于感染了自动液位计5shRNA。LysoTracker Red DND-99和MDC染色检测酸性囊泡细胞器的形成。代表性的图像都是用荧光显微镜放大600倍拍摄的。(b条)点状GFP-LC3标记的自噬体形成被量化(我). 数据显示为“GFP-LC3vac细胞（%）”(双).*P（P）< 0.05;**P（P）<0.001，与PBS对照组相比。western blot检测几种自噬标记(ii（ii）). 用3-MA（2）预处理HCT116细胞 mM）或感染自动液位计5对shRNA进行丙酸盐处理（3 mM）。通过基于台盼蓝排斥的细胞染色来测量细胞活力(c（c）)以磷脂酰丝氨酸（PS）为基础的膜联蛋白V染色评估凋亡细胞死亡(d日，克). (e（电子）)丙酸（3）处理HCT116细胞后caspase-7和caspase-3裂解的Western blot分析 mM）在不存在或存在自噬抑制剂（3-MA和CQ）或AMPK抑制剂（化合物C）的情况下持续所指示的时间。(（f）)HCT116和SW480细胞感染自动液位计5shRNA，蛋白质敲除通过western blot进行评估
为了进一步验证自噬对丙酸诱导死亡的保护作用，通过敲除自动液位计5.用shRNA转导的细胞中ATG5表达降低自动液位计5经western blot证实().自动液位计5消耗降低丙酸诱导GFP-LC3点刺形成的能力()并增强了其诱导细胞死亡的功效(). RNA干扰导致ATG7表达降低的HCT116细胞中也观察到自噬反应受到抑制、细胞死亡增强和caspase-3/7裂解（补充图S6a、b和c）。药物（3-MA或CQ）或基因抑制自噬(自动液位计5shRNA）方法也增强了SW480细胞中丙酸触发的凋亡（补充图S6e、f和g）。
较高剂量的3-MA和CQ除了抑制自噬外，还可能对肿瘤细胞活性产生不利的副作用。为了证实3MA和CQ的抗肿瘤作用取决于它们抑制基于自噬的生存能力，将丙酸/3MA或丙酸/CQ对癌细胞的治疗与使用shRNA对自噬进行基因抑制的治疗进行了比较自动液位计5（第5页）。如图所示，在ATG5敲除的细胞中丙酸盐暴露后，3MA或CQ的联合治疗并没有进一步增加细胞死亡以及补充图S6e和f。因此，3-MA和CQ增强丙酸诱导的细胞死亡的能力基于其对自噬的抑制。
讨论
SCFAs，特别是丁酸盐在结肠癌中的抗肿瘤活性已被广泛研究。32这里的数据表明自噬是由丙酸盐诱导的。自噬作为一种适应性反应，与自噬抑制剂或shRNA的表达协同作用ATG5/7型增加丙酸诱导的细胞死亡。我们的数据表明，自噬是一种适应性策略，可以增强结肠癌细胞对SCFA触发的凋亡刺激的抵抗力。
自噬被激活以应对各种应激刺激，包括饥饿、缺氧、内质网应激和氧化应激。在这项研究中，自噬诱导依赖于其负调控因子mTOR的下调，mTOR失活与AMPK的过度磷酸化有关α除了增加AMP/ATP比率外，ROS还充当激活AMPK的信号分子。25在本研究中，ATP耗竭和ROS积累可能共同启动AMPK激活。SCFA被氧化β-氧化为结肠细胞提供替代能源，这可能是ATP瞬时上调的原因（1-7 h） ●●●●。随后，细胞ATP含量下降（7 h） ，这发生在广泛的线粒体膜电位损失开始之前（12 h）(). 观察到的早期（7-12 h） ATP消耗可能是由于Na+/HCO增加导致的ATP消耗增加所致三SCFAs处理后的共转运蛋白（NBC）和Na+/H+交换器（NHE）活性。12通过细胞器和细胞质内容物的自噬降解，自噬使细胞能够循环氨基酸和营养物质，以维持蛋白质合成和ATP生成，从而维持生物能量稳态和细胞存活。33说明自噬在ATP恢复中作用的直接证据是自动液位计5CQ沉淀丙酸诱导的ATP耗竭击倒或阻断自噬降解（补充图S7和5）。基于这些结果，我们推断丙酸盐诱导的自噬可能会为肿瘤细胞提供另一种代谢需求来源，以允许适应性蛋白质合成，并帮助克服线粒体缺陷引起的细胞能量危机。
自噬不仅通过循环利用细胞成分来维持生物能量学，而且通过清除受损的细胞器和蛋白质聚集体发挥细胞质质量控制机制的作用，细胞应激后这些细胞聚集体的积累可能具有细胞毒性。34自噬还通过去除可能会产生细胞毒性的线粒体，在缺氧期间的细胞内稳态控制中发挥着越来越重要的作用。35在这项研究中，流式细胞术分析提供了强有力的证据，表明MPT诱导与Δψ()、ROS生成增加（补充图S8）和自噬靶向丙酸诱导的线粒体功能紊乱降解导致Δ损失ψ(和). 这些结果强调了线粒体去极化作为线粒体自噬关键事件的作用，并加强了线粒体通透性转变是有丝分裂决定因素的观点。作为两种机制不同的程序性细胞死亡，自噬和凋亡可以同时、依次或以相互排斥的方式被诱导以响应细胞应激。36，37线粒体可能是整合两种细胞死亡类型的中央细胞器，线粒体通透性转变被认为通过自噬或凋亡来决定细胞的命运。38缺陷线粒体的自噬降解可以通过规避促凋亡因子的释放来延缓凋亡的发生，从而阻碍凋亡级联的激活。
据报道，丙酸盐和丁酸盐具有组蛋白脱乙酰酶（HDAC）抑制活性。39用已知组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）处理细胞，未能模拟丙酸诱导的自噬反应（补充图S9）。
饮食与癌症之间的联系很复杂，很难解开。纤维的主要细菌发酵产物SCFAs与癌症的相关性是多方面的。SCFAs已被报道为选择性诱导结肠癌细胞分化、生长停滞和凋亡的抗肿瘤药物。三，13，32结果表明，SCFAs自发诱导的自噬将增加结肠癌对不利微环境的抵抗力和灵活性，并损害SCFAs自身在结肠癌预防中的功效。虽然我们尚未检查SCFAs/氯喹联合治疗体内，氯喹已成为许多癌症的自噬调节剂体内模型。也许最重要的是，我们的研究为通过调节自噬途径增强SCFA的抗肿瘤活性提供了原理证明。包括CQ或靶向自噬途径中其他步骤的药物与高纤维食物的联合治疗可能是一种可行且有前景的结肠癌治疗方案。
材料和方法
材料
人结肠癌细胞系HCT116和SW480购自美国类型培养库。293T和phoenix Ampho包装细胞系来自Orbigen（加利福尼亚州圣地亚哥，美国）。胎牛血清（FBS）购自Invitrogen Corporation（Carlsbad，CA，USA）。小鼠抗PI3-激酶购自BD Transduction Laboratories（美国马里兰州斯帕克斯）。AMPKβ-1磷酸（pS181）和AMPKγ-1（C末端）兔单克隆抗体购自Epitomics Inc.（加利福尼亚州伯林盖姆，美国）。Jayanta Debnath博士亲切地提供了LC3兔多克隆抗体。p62/SQSTM1、ATG7和LAMP-2抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。总OXPHOS人抗体混合物（MS601）和MitoProfile总OXPHS+PDH ICC抗体试剂盒（MS602）购自MitoSciences Inc.（美国俄勒冈州尤金市）。β-actin购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。所有其他抗体均购自Cell Signaling Technology，Inc.（美国马萨诸塞州丹弗斯）。丙酸钠、丁酸钠、单丹酰cadervarine（MDC）、氯喹、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、化合物C和3-甲基腺嘌呤（3-MA）购自Sigma-Aldrich。常规PCR试剂和MTS溶液来自Promega Corporation（美国威斯康星州麦迪逊）。DNAfectin脂质体转染试剂购自Applied Biological Materials Inc.（Richmond，BC，Canada）。微管相关蛋白轻链3（GFP-LC3）逆转录病毒表达结构由美国加利福尼亚大学旧金山分校的Jayanta Debnath博士善意地提供了四种针对人类的HuSH 29mer shRNA结构自动液位计5（位点ID=9474），序列列于，购自OriGene Technologies（美国马里兰州洛克维尔）。四种抗人pGIPZ慢病毒shRNA构建物自动液位计7从Open Biosystems Products（美国亚利桑那州亨茨维尔）购买了四个针对人类AMP、α1催化亚单位（PRKAA1）的pTRIPZ慢病毒shRNA构建物。LysoTracker Red DND-99、MitoTracker Deep Red FM、MitoTracker Green FM、ROS检测试剂（羧基-H2DCFDA）、Vybrant细胞凋亡检测试剂盒（V35116）和Alexa Fluor 488 annexin V、MitoTracker红色染料和MitoProbe过渡孔检测试剂盒({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“M34153”，“term_id”：“343832”，“term_text”：“M24153”}}M34153型)从Invitrogen购买。
表1
ATG5 shRNA构建序列
| ATG5 shRNA结构 | 序列（5′-3′） |
|---|
| TI358433型 | GTGCTTCGAGATGTGTTTGGAGAAT公司 |
| TI358435型 | AAGCACTTTCAGAAGGTTATGAGAGAGAGAA公司 |
| TI358434型 | TCAGCTCTCCTTGGAACATCACAGTACA公司 |
| TI358436型 | GCAATCTTGTAACTTTGATAATGAACAGT公司 |
细胞培养和转染
HCT116细胞在添加了10%FBS和抗生素-抗真菌药（100单位/ml青霉素，100 μg/ml链霉素和250 μg/ml两性霉素B）在含有5%CO的环境下放置在加湿培养箱中237°C时。Phoenix Ampho细胞在含有10%FBS和抗生素-抗真菌药物的DMEM培养基中生长。所有细胞株的支原体污染检测均为阴性。MAP1LC3（LC3），酵母哺乳动物同源物之一自动液位计8是一个公认的自噬体形成标志。利用逆转录病毒载体（pBABE）构建稳定表达GFP-LC3的细胞株。对于这种病毒感染，使用DNAfectin脂质体转染试剂，约1000万Phoenix Ampho细胞被质粒转染。收集病毒上清液48 转染后h，在新鲜培养基中以1:1稀释，并加入聚brene（4 μg/ml）并添加到HCT116和SW480细胞中，接种在30%汇流处的六孔板中。24天后 在37°C下，用新鲜的等分试样代替病毒上清液。对每种情况进行三轮连续感染，之后90%以上的细胞表达外源蛋白。HCT116和SW480细胞的产生自动液位计5shRNA敲除根据上述方案进行。关于ATG7型pGIPZ慢病毒shRNA和AMPKαpTRIPZ慢病毒shRNA世代，293T细胞转染自动液位计7shRNA或AMPKα在包装质粒存在下构建。病毒收集和靶细胞感染遵循上述相同的方案。HCT116细胞自动液位计7用TurboGFP标记pGIPZ慢病毒shRNA的表达。含AMP的HCT116细胞αpTRIPZ慢病毒shRNA表达由TurboRFP标记，并由Tet-On或Tet-Off系统调节。
蛋白质印迹
处理后的HCT116和SW480细胞用冰镇RIPA缓冲液（Sigma-Aldrich，R0278）收集，并加入蛋白酶抑制剂混合物（Sigma Aldrich，S8830）。50卷 μg蛋白质在Bio-Rad Protean II系统中通过SDS-PAGE凝胶进行分离（美国加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室）。将蛋白质转移到PVDF膜后，用LI-COR Biosciences（Lincoln，NE，USA）的Odyssey Blocking Buffer封闭膜60 在室温下培养1 min，并在4°C的Odyssey阻断缓冲液中以适当稀释度与一级抗体孵育过夜。用适当的一级抗体孵育过夜后，用TBS-T清洗膜（3×），共15次 min，用荧光标记二级抗体（1:5000）检测80 在室温下至少清洗15分钟，用TBS-T清洗（3次） 分钟。免疫印迹由奥德赛红外成像系统（LI-COR Biosciences）可视化。
用LysoTracker和MDC标记酸性小室
LysoTracker Red DND-99已被广泛用作探针，以指示多种生物体中的自噬活性。简而言之，酸性囊泡细胞器（AVO）用染料（50 nM，Molecular Probes Invitrogen Corporation）在预热（37°C）RPMI 1640培养基中稀释15 37°C时最小值。孵育后，用无血清培养基冲洗细胞一次，并立即用BX41荧光显微镜观察（美国宾夕法尼亚州中央山谷奥林巴斯）。总共20个 通过流式细胞术（激发波长488）测定每个样品中的000个细胞 nm，发射滤波器585/42 nm）使用FACS Calibur系统。据报道，MDC是标记自噬空泡的特异性标记物。简而言之，将细胞与0.05 37°C下PBS中的mM MDC持续10 孵育后，用PBS洗涤细胞两次，并用BX41系统显微镜观察细胞内MDC。总共20个 每个样本处理1000个细胞进行流式细胞术（激发波长351–364 nm，发射滤波器485/22 nm）使用FACS Vantage系统。
ATP定量
ATP用CellTiter-Glo发光细胞活性测定试剂盒（Promega公司）定量。发光度由Thermo Scientific的Luminoskan Ascent测量。
高效液相色谱法测定AMP、ADP和ATP
700卷 0.4微升 处理后向HCT116细胞中加入高氯酸和内对照。然后冷冻、解冻和离心细胞。这些颗粒用于蛋白质测量。用1/10体积的4M K中和上清液2一氧化碳三然后再次离心。上清液用于HPLC分析。AMP、ADP和ATP的HPLC分析在岛津LC-20AT HPLC系统上进行，该系统配备了热科学超螺旋金柱（4.6×150 毫米，3 μm）前面是C18预柱滤筒。溶剂系统由两个缓冲液组成，速度为0.5 ml/min，使用等度洗脱：38%缓冲液B（V/V）。缓冲区A含25 mM氢氧化钠2PO4，0.01%四丁基氢氧化铵，pH 5。缓冲液B由10%（V/V）乙腈在200 mM氢氧化钠2人事军官40.01%四丁基氢氧化铵，pH 4.0。通过监测254℃下的紫外线吸收率来检测化合物 纳米，并通过峰面积与标准曲线的比较进行量化。使用BCA试剂盒进行蛋白质测量。通过峰值校准进行计算，数值表示为每克湿重的微米或每毫克蛋白质的纳米。
流式细胞术检测线粒体膜电位
线粒体膜电位（Δψ)使用流式细胞仪线粒体膜电位检测试剂盒（BD Biosciences）测量丙酸处理后HCT116细胞的数量。通过流式细胞术分析荧光发射（JC-1单体：激发波长488 nm，发射滤波器530/30 纳米；JC-1聚集体：激发波长488 nm，发射滤波器585/42 nm），使用FACS Calibur系统。Δψ还通过MitoTracker深红色FM染色细胞的显微镜检查定量，并通过流式细胞仪分析确认。简言之，治疗后抽吸细胞培养液，MitoTracker深红色FM（100 无FBS的RPMI中的nM）加入15 37°C时最小值。荧光发射在显微镜下检测或通过流式细胞术分析（激发波长635 nm，发射滤波器661/16 纳米）。
免疫细胞化学和共焦显微镜
HCT116细胞接种于0.3×106/用盖玻片将其分成六孔板，以实现70%的汇流。36岁之后 h、 用丙酸盐处理细胞（3 mM）在CQ（5）在场或不在场的情况下 μM） 用于48 h.用3%多聚甲醛将细胞固定在PBS中15 分钟，然后用0.1%Triton X-100渗透5 在含3%马血清的3%BSA/1×PBS中阻断40分钟后 min，将载玻片与COXIV/p62或COXIV/LAMP2抗体在4°C下孵育过夜。过夜培养后，用PBS清洗玻片三次，然后用Alexa Fluor 568山羊抗鼠IgG（H+L）和Alexa Fuor 488山羊抗兔IgG h（1:100稀释）。然后用PBS清洗载玻片三次，用DAPI在Prolong Gold防褪色试剂中复染，并用Olympus Fluoview共焦显微镜使用×60油浸物镜（美国纽约州梅尔维尔市奥林巴斯IX70）进行可视化。荧光由氩激光器的488纳米线和氪激光器的568/647纳米线激发。使用Fluoview软件（美国宾夕法尼亚州中央谷奥林巴斯成像公司）对图像进行分析。
线粒体质量、ROS和MPT的染色和流式细胞术分析
线粒体质量通过MitoTracker Green FM测量。线粒体染色采用与MitoTracher Deep Red FM染色相同的程序。用流式细胞术检测荧光发射（激发波长488 nm，发射滤波器530/30 纳米）。使用Image-iT LIVE绿色活性氧检测试剂盒（分子探针，{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“I36007”，“term_id”：“2087231”，“term_text”：“l36007”}}I36007号). 简而言之，用不同浓度的丙酸盐处理细胞，并用羧基-H孵育2DCFDA（25 μ汉克平衡盐溶液中的M）30 37°C时最小值，避光。使用FACS Calibur流式细胞术系统（激发波长488）测量DCF荧光 nm，发射滤波器530/30 纳米）。线粒体探针转换孔测定试剂盒用于线粒体膜通透性转换（MPT）检测。简而言之，用不同浓度的丙酸盐处理细胞，并用钙黄绿素AM（10 nM）和氯化钴2(0.4 mM）用于15 最小37°。用PBS洗涤后，在荧光显微镜下检测钙黄绿素AM荧光，或用FACS Calibur流式细胞术系统（激发波长488 nm，发射滤波器530 纳米）。
RT-PCR和实时PCR
通过半定量逆转录酶PCR（RT-PCR）和实时定量PCR评估线粒体生物发生调控基因的表达谱。通过PCR从cDNA中扩增出感兴趣的基因，引物对列于.反应按照陈的描述进行等。40
表2
RT-PCR引物序列
RT-PCR引物序列
|
|---|
| 基因 | 序列（5′-3′） | 大小（bp） |
|---|
| Tfam公司 | 感知CCACCGGAGCGATGGTTTT | 112 |
| | 反义CTGAAGGGGAGCAGTCG | |
| mtTFB公司 | 感知CGTGGGCGTGCACTTCA | 169 |
| | 反义CAGCCTGCGCGTTTCCA | |
| NRF1级 | 感知GCGCAGCCTCTCTGAACT | 269 |
| | 反义CAGCAGGCCATTCCCACA | |
| NRF2级 | 感应GGCTGCACTGGAAGGCT | 216 |
| | 反义TCTCCCCGAGGAACCCGCTG | |
| POLG公司 | 感知ACCGGGAGCACCGTGAGGA | 197 |
| | 反义GCAGGCGGCTCATGGTTGGT | |
| PGC1 | 感知GCCGTGGCCGCAGAAATGAC | 578 |
| | 反义GCCTGTGGCATCCGCCCAAA | |
| 高GADPH | 感知GGCCTCCAGAGTAAGACC | 147 |
| | 反义AGGGGTCTACATGGCAACTG | |
细胞活力和凋亡细胞死亡测量
对于MTS分析，0.5×105在RPMI培养基中，将细胞/孔镀在96个板中，并应用指示的药物治疗36 播种后h。48岁时 h、 添加CellTiter 96水含量测定（Promega）中提供的MTS试剂。使用Vi-Cell系列细胞活力分析仪（Beckman Coulter，Inc.，Brea，CA，USA）测量细胞活力，该分析仪基于台盼蓝排除的传统细胞活力方法。此外，Vybrant凋亡检测试剂盒（V35116）提供了一种基于PS易位和Δ变化的快速简便的凋亡检测方法ψ，被使用。使用FACS Calibur流式细胞术系统（MitoTracker Red：激发波长488 nm，发射滤波器585 纳米；Alexa Fluor 488 annexin V：激发波长488 nm，发射滤波器530 纳米）。
统计
两个实验组之间统计上显著差异的概率由Student’s确定t吨-测试。P（P）<0.05在所有计算中均被视为具有统计学意义。
