细胞科学杂志。作者手稿；PMC 2007年3月20日提供。
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自噬的分子机制：尚未解答的问题
美国密歇根大学生命科学研究所分子、细胞和发育生物学系和生物化学系，密歇根州安娜堡，邮编：48109
总结
自噬是一个过程，在这个过程中，细胞溶质和细胞器被隔离在双层膜囊泡中，这些囊泡将内容物输送到溶酶体/液泡，以降解和再循环产生的大分子。它在细胞应激反应中起着重要作用，参与多种发育途径和功能，如抑制肿瘤、抵抗病原体和延长寿命。相反，自噬可能与某些肌病和神经退行性疾病有关。在鉴定自噬所需的蛋白质和了解其分子基础方面取得了重大进展；然而，许多问题仍然存在。例如，Tor是诱导步骤中控制包括Atg1激酶在内的复合物功能的关键调节蛋白之一，但Atg1的靶点未知。虽然自噬通常被认为是非特异性的，但也有利用受体和适配器蛋白（如Atg11）的特定类型的自噬；然而，Atg11将货物与隔离囊泡（自噬体）连接的方式尚不清楚。自噬体的形成是一个复杂的过程，囊泡的形成机制和供体膜的来源都不清楚。隔离货物的最终分解依赖于特性良好的溶酶体/液泡蛋白酶；相比之下，脂肪酶的作用尚未阐明，我们也不知道在降解过程中溶酶体/液泡膜的完整性是如何维持的。
关键词：溶酶体、Pexophagy、蛋白质靶向、液泡、酵母
自噬的诱导
在酵母和哺乳动物细胞中，自噬发生在营养生长条件下的基础水平。因此，必须有一种机制来感应细胞外环境并将适当的信号传递给允许诱导自噬的调节元件。其中一个主要的调节成分是蛋白激酶Tor（“雷帕霉素靶点”）（Carerra，2004），它在基础或营养丰富的条件下抑制自噬。托尔有两种行为。首先，它直接或间接导致自噬蛋白Atg13的过度磷酸化(Funakoshi等人，1997年；Scott等人，2000年) (). 这种形式的Atg13对与其相互作用的激酶Atg1的亲和力较低，而相互作用的减少可能会抑制自噬(Kamada等人，2000年). 通过饥饿或雷帕霉素治疗抑制Tor导致Atg13的部分去磷酸化，并允许自噬诱导(Abeliovich，2004年；Noda和Ohsumi，1998年). 其次，Tor在信号转导级联中起作用，控制几种效应物（如Tap42、Sit4、Ure2和Gln3）的磷酸化，这些效应物调节某些蛋白质的转录和翻译，其中一些是自噬所必需的。自噬也通过其他因素如蛋白激酶A进行调节(Budovskaya等人，2004年)，Gcn2公司(Tallóczy等人，2002年)和Snf1(Huang等人，1996年).
诱导和囊泡成核的调节。在酵母和哺乳动物细胞的研究中，自噬的调节是有特点的。（A） 在酵母中，自噬活性需要III类PI 3-K，并且可能在自噬前体膜上发挥作用。由Atg1激酶和其他几种蛋白质组成的假定复合物，其特征是主要为自噬（紫色）或Cvt途径（绿色）所需，可能是Tor激酶的下游效应器，以根据营养条件或其他信号调节作用的途径类型。酵母自噬主要是一种饥饿反应；Tor和其他未显示的调节成分（包括PKA）对营养水平有反应。在营养丰富的条件下，Atg1和Atg13的磷酸化程度更高，彼此的亲和力更低；在饥饿期间，这两种蛋白质部分去磷酸化。PI 3-K复合物I由Vps15、Vps34、Atg6/Vps30和Atg14组成，是Cvt途径和自噬所必需的。（B） 在哺乳动物细胞中，I类PI 3-K受到刺激，以响应配体与胰岛素受体（InR）等受体的结合。铂族锡（3,4）P（P）2和PtdIns（3,4,5）P（P）三在质膜上生成，允许3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）和Akt/PKB的结合和激活，而PTEN通过其3′-磷酸肌醇磷酸酶活性拮抗这一途径。Akt抑制GTPase激活蛋白复合物TSC1-TSC2，从而稳定RhebGTP，激活Tor，从而抑制自噬。Tor和PDK1均刺激p70S6激酶（p70S6k）。在饥饿条件下（当Tor被抑制时）下调p70S6k活性可能会阻止过度自噬(Scott等人，2004年). p70S6k也可能通过干扰I类PI 3-K的激活间接抑制Tor，正如哺乳动物细胞的研究所表明的那样(Um等人，2004年). 在营养丰富的条件下，p70S6k的激活应抑制PI 3-K，允许低水平的自噬以达到体内平衡目的，而在饥饿条件下，最终p70S6k的失活应允许激活PI 3-K以防止过度自噬。III类PI 3-K的刺激作用可能类似于酵母酶复合物的刺激作用。
酵母Atg1激酶(Matsuura等人，1997年)是包含几个额外蛋白质的假定复合物的一部分(). 关于这个复合物的一个有趣的观点是，除了Atg1之外，所有的蛋白质都主要在Cvt途径或自噬中发挥作用，但不是两者都起作用(Kamada等人，2000年；Kim等人，2001b；尼斯等人，2002年；Scott等人，2000年). 这一发现引发了一种推测，即Atg1复合体参与了这两条通路之间的转换。然而，目前对该复合物中的大多数蛋白质的了解还不够，无法指定特定功能或将其列为仅参与其中一种途径。目前没有证据表明酵母外存在Cvt途径的等效物；因此，高等真核生物可能不需要相同的能力来在生物合成和降解类型的自噬之间切换。
在哺乳动物细胞中，Tor通过I类磷脂酰肌醇3-激酶（PI 3-K）的作用进行调节，该激酶允许Akt/蛋白激酶B（PKB）和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）的膜结合和随后激活，从而抑制自噬(Codogno和Meijer，2004年) (). PTEN是一种3′磷酸肌醇磷酸酶，能拮抗Akt/PKB通路，是自噬的正调控因子。TSC1-TSC2复合物作为GTPase Rheb的GTPase激活蛋白（GAP）。Akt对TSC1-TSC2的抑制使GTP结合形式的Rheb稳定，从而刺激Tor。Rheb的GDP结合形式可能抑制Tor(Tabancay等人，2003年). Tor和PDK1均激活核糖体亚单位S6激酶（p70S6k），这是实现最大自噬活性所必需的(Scott等人，2004年). Tor失活后p70S6k的下调可能会阻止Tor活性缺失时的过度自噬。哺乳动物自噬的调节涉及额外的成分，包括eIF2α、Ras和异源三聚体G蛋白(Codogno和Meijer，2004年；Furuta等人，2004年；Tallóczy等人，2002年).
问题
关于酵母Atg1复合体，还有许多问题有待回答。例如，假设复合物的蛋白质组分之间的相互作用已在成对组合中演示。因此，不清楚是否存在稳定的全息复合体。此外，我们对这种假定复合物的组成的了解是基于遗传抑制研究、双杂交数据和使用过表达蛋白质的亲和分离或联合免疫沉淀。这些相互作用中的一些可能在自然界是暂时的，或者当蛋白质在生理水平上表达时甚至不会发生。
推测的Atg1复合物中蛋白质的功能基本上尚不清楚。例如，Atg11被认为在货物选择中起作用（见下文），但其与Atg1相互作用的原因尚不清楚，也不知道这两种蛋白质何时相互作用——也就是说，相互作用是否依赖于营养物质（如Atg1和Atg13之间的相互作用所建议的那样）。此外，我们不知道这两种蛋白质是在货物选择过程中还是在货物交付到自噬前结构（PAS；见下文）后相互作用。类似地，在这个由Atg20、Atg24和Vac8组成的复合体中提出的函数只是猜测。Atg20和Atg24与磷脂酰肌醇（3）-磷酸结合[PtdIns（3）P（P）]并与Atg11和/或Atg17交互(尼斯等人，2002年). Vac8与同型液泡融合有关(Wang等人，2001年)并且是Cvt途径所必需的，但似乎在Cvt囊泡与液泡的融合中没有作用(Scott等人，2000年). Vac8与Atg13相互作用，但它是否对该蛋白的位置或功能有任何影响尚不清楚。Atg13和Atg17似乎调节Atg1的激酶活性(Kamada等人，2000年)，但Atg11、Atg20、Atg24或Vac8是否发挥了类似的作用？此外，关于Atg1调节的结论是基于使用人工基质的体外研究，因为其生理目标未知。实际上，Atg1激酶活性的作用也不清楚。一份报告表明，诱导自噬需要增加Atg1激酶活性(Kamada等人，2000年). 最近的一项研究得出了相反的结论，反而表明Atg1在自噬中具有结构作用，其激酶活性主要是Cvt途径所必需的(Abeliovich等人，2003年)，尽管Atg1激酶活性可能也是自噬所必需的。
Tor是否直接磷酸化Atg13和/或作用于其他Atg蛋白尚不清楚。Atg1复合物的大多数或所有成分都是磷蛋白，它们似乎都不是Atg1的靶标(Scott等人，2000年)（D.J.K.，未出版）。作用于这些蛋白质的激酶和磷酸酶尚不清楚。在自噬的情况下，Tor的下游效应器甚至不清楚。Tap42被Tor激活，是蛋白磷酸酶2A（PP2A）样磷酸酶的调节亚单位；然而，它似乎在自噬中不起作用(Kamada等人，2000年). 此外，Tor被认为主要对氮饥饿作出反应，但各种其他类型的应激，包括碳饥饿，都可以诱导自噬。在这些不同的应激条件下调节自噬诱导的调节成分尚不清楚。此外，尽管Atg1和Atg13似乎集中参与酵母的自噬，但目前还没有证据表明高等真核生物中存在Atg11或Atg17同源基因，或者存在Atg13或Vac8同源基因，但植物中除外。在许多生物体中，也不清楚是否存在Atg1的真的同源基因。
最后，尽管大多数模型表明Atg1在自噬诱导中起作用，但这一点尚未得到明确证实。由于雷帕霉素对Atg13磷酸化的影响以及假定的Atg1复合物成分的明显通路特异性，因此提出了这种作用。然而，这种观点可能是误导性的，因为编码这些“特定”成分（例如ATG11型和VAC8型)导致两条路径都有缺陷。此外，Atg1与货物包装因子Atg11相互作用，并参与Atg9从形成的自噬体中自噬恢复的后期阶段（见下文）。因此，Atg1似乎在自噬的多个步骤中发挥作用，其在诱导中的作用有待验证。
货物选择和包装
自噬通常被认为是一种非特异性过程，其中大量细胞质被随机隔离到胞质自噬体中；然而，也有一些特定的自噬的例子。例如，最近的一份报告显示，细胞溶质蛋白Ald6通过自噬以与非特异性摄取不一致的速度传递到液泡(Onodera和Ohsumi，2004年). 类似地，在pexophagy期间，几乎所有过氧化物酶体，而不是其他细胞器，都被认为具有快速隔离和液泡输送功能(Hutchins等人，1999年；Tuttle等人，1993年；Veenhuis等人，1983年). 在Cvt途径的情况下，货物被用于生物合成而非降解目的。在这条途径中，几个成分的作用时间顺序已经确定(). 前驱体ApeI（prApe1）形成十二碳化合物，这些十二碳化合物聚集在一起形成高阶低聚物(Kim等人，1997年)称为Ape1综合体(Shintani等人，2002年). 这一步骤似乎仅取决于prApe1的构象。受体蛋白Atg19结合prApe1的前肽结构域(Scott等人，2001年); 前肽含有液泡靶向信息，并在递送到液泡腔中后与蛋白质的剩余部分切割，从而激活酶。至少有一种其他生物合成货物蛋白Ams1也与Atg19受体结合(哈钦斯和克林斯基，2001年；Shintani等人，2002年)形成Cvt综合体。Atg11随后绑定到Atg19(Shintani等人，2002年)并作为系链或适配器将Cvt复合物带向PAS，PAS是一个可能使Cvt囊泡成核和自噬体形成的位点(Kim等人，2002年；Suzuki等人，2001年). 最后，磷脂酰乙醇胺（PE）结合的Atg8蛋白与Atg19结合，以确保Cvt复合物包含在形成的Cvt囊泡中(Shintani等人，2002年).
货物包装部件的临时操作顺序。酵母Cvt途径是特异性自噬的一个例子。常驻液泡水解酶Ape1和Ams1在胞浆中组装成低聚物。前体（pr）Ape1十二碳化合物进一步聚集成大型Ape1复合体。受体/适配器Atg19结合到Ape1复合物（通过prApe1前肽）和Ams1。Atg11是一种对自噬不是必需的成分，与Cvt复合体相互作用，需要将复合体与自噬前结构（PAS）连接起来。Atg11还与Atg1交互（未显示，请参阅)，但这种相互作用相对于货物包装的时间尚不清楚。Atg11不是最终Cvt小泡或自噬体的一部分，可能在Cvt复合物到达PAS期间或之后的某个时间与Atg19分离。Atg19随后与定位于PAS的Atg8-磷脂酰乙醇胺结合，此事件可能触发囊泡的完成。
问题
如果酵母Atg11和Atg19蛋白由于相应基因的突变而不能相互作用，则Cvt复合物形成但不定位于PAS。然而，目前尚不清楚Atg11的功能是如何将货物与囊泡形成机械连接起来的。沿着这些路线，Atg11如何针对PAS而不是单元格内的其他位置？它是否与作为目标因子的未识别组件相互作用？Atg11不是最终Cvt囊泡的一部分；因此，在将Cvt复合物输送到PAS后，它必须与受体分离。是什么触发了这个事件？此外，Atg11似乎与Atg19和Atg1都相互作用。当货物存在时，Atg11是否将Atg1带到囊泡形成部位？如上所述，不知道Atg1和Atg11何时交互。同样，Atg8-PE与Atg19受体的结合是否向PAS发出货物存在的信号？如果是，这种信号是如何发生的？Ichimura等人最近表明，Atg8在脂质化后发生构象变化(Ichimura等人，2004年). 当Atg8 PE与Atg19结合时，是否会发生类似的变化？
最近的一项研究表明，在营养丰富的条件下，如果没有prApe1、Atg19或Atg11，PAS就不会形成(Shintani和Klonsky，2004年b). 在本研究提出的模型中，货物蛋白诱导或大大促进了PAS的形成。这在生物合成Cvt途径中有意义，其中主要目的是传递Cvt复合物。相比之下，PAS的形成并不依赖于Cvt货物或饥饿状态下的货物识别机器。在这种情况下，不知道什么因素决定PAS部件的本地化。最后，过氧化物酶体的作用可能类似于Cvt复合物，以便在pexophagy期间形成PAS或囊泡成核（囊泡形成的起始）。吞咽pexophagy不需要Atg19；相比之下，这个过程需要Atg11。在过氧化物酶体降解期间，是否有另一种蛋白质替代Atg19？注意，目前没有证据表明Cvt途径存在于外部酿酒酵母; 然而，所有真核生物都可能发生特异性自噬。例如，除了过氧化物酶体的吸收外，叶绿体也会被自噬降解(Niwa等人，2004年)线粒体可能是在某些条件下通过自噬进行特定隔离的靶点(薛等，2001). 在这些情况下，对识别机制的了解较少。在pexophagy期间，Pex14似乎在过氧化物酶体识别中发挥作用(Bellu等人，2001年)，但尚未确定其绑定伙伴。最后，还有几项研究表明，致病细菌和病毒以及异常蛋白聚集体可以通过自噬作用进行降解（由Kirkegaard等人，2004年；Larsen和Sulzer，2002年). 再次，我们不知道在这些情况下是什么因素触发了自噬体形成或货物吞没。
囊泡成核
囊泡形成过程中最不为人所知的步骤之一是成核，成核是将构成自噬体和Cvt囊泡的蛋白质和脂质聚集在一起的初始步骤，也是推动该过程向前发展的机制。囊泡的形成必须有一个成核步骤，一个起点；然而，很难定义其特征。在酵母中，几乎所有自噬蛋白都至少暂时定位于PAS。因此，Atg蛋白到达该位点可能标志着成核事件。
在大多数内膜交通的情况下，囊泡是通过出芽从预先存在的细胞器形成的。所产生的囊泡在管腔与胞质表面上保持与作为膜供体的细胞器相同的细胞拓扑结构。在自噬相关过程中，囊泡可能从头形成。它不与细胞器相连，也不会从细胞器表面挤压而形成(). 结果是，自噬体有一个双层膜（在某些情况下可能是多层膜），货物的管腔与细胞溶质拓扑结构相反：Cvt囊泡或自噬体内部相当于细胞器的管腔或细胞外空间(). 作用于囊泡成核的特定成分尚不完全清楚，一些蛋白质可能在成核和膨胀中都起作用。在酵母中，一组似乎在PAS中起作用的蛋白质是PI 3-K复合物I(Kametaka等人，1998年；Kihara等人，2001年) (). 酵母中只有一个PI 3-K，即Vps34，但它是两种不同复合物的组成部分。这两种复合物都含有Vps34和推测的调节蛋白Vps15，以及Atg6（也称为Vps30）。此外，复合体I包括Atg14，而复合体II包括Vps38。复合物I主要作用于PAS，但并非仅限于PAS，而复合物II作用于内体。PtdIns（3）P（P）由复合物I产生的结果将包括Atg18、Atg20、Atg21、Atg24和Atg27在内的蛋白质招募到PAS(尼斯等人，2002年；Stromhaug等人，2004年；Wurmser和Emr，2002年); Atg20和Atg24是假定的Atg1激酶复合物的一部分().
自噬体或Cvt囊泡形成的示意模型。形成Cvt囊泡或自噬体的膜的起源尚不清楚，囊泡形成的机制也不清楚。在一个模型中（如左图所示），来自预先存在的细胞器（如内质网（ER））的膜被诱导分离并发生变形，形成球形，最终封闭；膨胀不需要额外的膜。目前尚不清楚Atg8等自噬蛋白何时或如何靶向该膜。在第二个模型中（如右图所示），膜的一部分形成自噬体或Cvt囊泡的细胞核；在酵母中，这个细胞核是自噬前结构（PAS）。添加额外的膜以使形成的囊泡膨胀，但这种膜的来源尚不清楚。大多数数据支持第二种类型的模型。无论是哪种情况，就蛋白质含量和磷脂组成而言，原始膜在所有表面上都可能是等效的。在囊泡形成过程中，膜可能会发生分化，从而在囊泡完成时，两个分离的膜具有不同的特性；例如，Atg8-PE位于形成囊泡的两侧，但在Atg4裂解后从外膜上被移除（参见). 外囊膜可能含有识别和与液泡融合所需的陷阱元素（参见)而内囊膜可能更容易在液泡腔内降解。自噬体或Cvt囊泡的双膜性质导致货物从胞浆转移到细胞的腔空间。
问题
虽然酵母PI 3-K复合物I在PAS中起作用，但PtdIns的作用（3）P（P）在这个位置生成的并不完全清楚。铂族锡（3）P（P）需要招募与这种脂质结合的各种蛋白质，但在大多数情况下，这些蛋白质的功能尚未阐明。例如，Atg18与PtdIns结合（3）P（P）(Guan等人，2001年；Stromhaug等人，2004年)并参与Atg9的循环（见下文）(Reggiori等人，2004年a)但其功能尚不清楚。Atg18、Atg21和Atg27也与PtdIn结合（3）P（P）(Stromhaug等人，2004年；Wurmser和Emr，2002年). 在这些情况下，脂结合域的性质未知；这些蛋白质不包含PX或FYVE基序。
形成自噬体或Cvt囊泡的膜的来源是另一个谜，Cvt途径和自噬是否相同尚不清楚。在酵母中，一项研究表明，自噬需要通过早期分泌途径的膜流，而不是Cvt途径(Hamasaki等人，2003年；Ishihara等人，2001年)，而最近的一份报告表明，内质网（ER）在这两种途径中都发挥作用(Reggiori等人，2004年b). 这种差异可能反映了每项研究中遵循的动力学参数的差异。在哺乳动物细胞中，最流行（但并非唯一）的观点是ER是自噬的来源膜。巨噬细胞感染的研究单核细胞增生李斯特菌或转染表达脊髓灰质炎病毒蛋白的COS-1细胞也表明ER的作用(Rich等人，2003年；Suhy等人，2000年). 然而，即使是这样，内质网的一部分是如何从细胞器中分离出来并传递到囊泡成核部位的？同样重要的是，上述研究反映了细胞对病原体的反应；目前尚不清楚囊泡的形成过程在非感染细胞中是否相同，尽管有证据表明ER在正常细胞系中也有作用(Fengsrud等人，2004年).
酵母Cvt途径中的成核事件和自噬可能存在根本性差异。例如，如上所述，Atg1激酶活性可能只需要对一种囊泡成核。同样，在这两个过程中似乎对Atg8有不同的要求：在缺乏Atg8的情况下不会形成Cvt囊泡。相反，尽管自噬体异常小，但形成时却没有这种蛋白质(Abeliovich等人，2000年). 这些结果表明，Atg8是Cvt囊泡成核所必需的，但对于自噬体的扩张而不是形成（见下文）。研究表明第21页Δ突变体的Atg8-PE水平低，Cvt通路有缺陷，但自噬基本正常(Stromhaug等人，2004年). 类似地，Atg7突变体（见下文；)缺乏C末端13个残基的Atg8脂化水平较低，仅在Cvt途径中表现出缺陷(Yamazaki-Sato等人，2003年).
囊泡扩张和完成。两种泛素样蛋白参与囊泡的形成。酵母Atg8的C末端精氨酸残基（R）被Atg4半胱氨酸蛋白酶去除，以显示甘氨酸残基。Atg8和Atg12是被E1样酶Atg7激活的泛素样蛋白。然后将Atg8和Atg12转移到类E2酶Atg3和Atg10，并分别与磷脂酰乙醇胺（PE）和Atg5结合。Atg8-PE锚定在PAS膜上，是形成和完成自噬体或Cvt囊泡膜的组成部分。Atg12和Atg5以非共价方式结合Atg16，并且Atg16的自我作用允许复合物的多重聚合。Atg4的第二次裂解从完整囊泡的外膜释放Atg8。哺乳动物细胞也会发生类似的反应。
囊泡扩张和完成
在Cvt和自噬途径中起作用的大多数蛋白质在囊泡形成过程中起作用，包括扩张和完成过程。如上所述，囊泡形成的机制尚不清楚。如果自噬体或Cvt囊泡是通过预先存在的膜变形形成的(，左侧），则可能没有扩展步骤；然而，如果通过连续添加膜进行形成(（右侧），允许膜生长的添加剂构成膨胀阶段。在任何一种情况下，完成都意味着最后一步，在这一步中，小泡密封以将货物与细胞液分离。在扩张和完成步骤中起作用的蛋白质包括两组组分，涉及参与新的结合反应的泛素样（Ubl）蛋白质(Ohsumi，2001年) (). Atg8是一种Ubl，它通过Atg4蛋白酶进行蛋白水解处理，以显示甘氨酸残基，然后共价连接到PE(Ichimura等人，2000年). 这将Atg8从可溶性蛋白转化为膜相关蛋白(Huang等人，2000年；Kirisako等人，1999年). Atg8-PE是唯一已知的囊泡相关蛋白，被认为在结构上发挥作用。Atg8的膜结合对自噬过程中囊泡扩大的某些方面至关重要，因为它的缺失会导致异常小的自噬体的形成(Abeliovich等人，2000年). 相比之下，在营养条件下缺乏Atg8阻止了Cvt囊泡的形成，尽管Atg8或Atg8-PE在囊泡成核或膨胀中的作用尚不足以解释这种差异。共轭反应涉及泛素激活E1样酶Atg7(Kim等人，1999年；Tanida等人，1999年；袁等，1999)在第二个共轭反应中也起作用：另一个Ubl，Atg12共价连接到Atg5(Kametaka等人，1996年)通过Atg7和类E2酶Atg10的作用(Mizushima等人，1998年；Shintani等人，1999年). 第三种蛋白质，Atg16，将Atg12-Atg5结合物聚合并连接，形成四聚体复合物(Kuma等人，2002年；水岛等人，1999年). Atg12-Atg5·Atg16蛋白的功能尚不清楚，但它们可能起到暂时性外壳的作用。
问题
哺乳动物细胞中有三个Atg8蛋白家族：微管相关蛋白1轻链3（MAP1LC3）、高尔基体相关ATP酶16kDa增强子（GATE-16）和γ-氨基丁酸A型受体相关蛋白（GABARAP）。尽管最近的一项研究表明这三种蛋白质都定位于自噬体膜，但它们是否都在自噬中起作用尚不清楚(Kabeya等人，2004年). 大鼠MAP1LC3同源基因似乎与PE结合(Kabeya等人，2004年); 然而，一项研究表明，人类三种亚型之一的MAP1LC3B经历了一种不寻常的翻译后修饰，涉及C末端赖氨酸而非甘氨酸残基(He等人，2003年). 尚未证实人类MAP1LC3B同源基因与PE偶联，但如果赖氨酸是修饰残基，则活化可能不涉及Atg7和Atg3。然而，最近的一项研究提供了矛盾的证据，表明MAP1LC3B与其他亚型经历了相同类型的加工(Tanida等人，2004年).
关于Cvt囊泡/自噬体形成的主要问题之一是什么为膜的变形/弯曲提供驱动力。在大多数囊泡填塞过程中，外壳蛋白起着核心作用。目前，无论是从电子显微镜还是从囊泡纯化中都没有证据表明完整的Cvt囊泡或自噬体上的外壳。在酵母中，有明确证据表明Atg8-PE在自噬体形成过程中排列在膜的两侧(Kirisako等人，1999年)尽管其在这一过程中的作用尚不清楚。它可能与Atg12-Atg5系统（见下文）和Atg12-Attg5·Atg16复合体相互作用，后者可以形成四聚体(Kuma等人，2002年)是过渡涂层的最佳候选者。对哺乳动物细胞的研究提供了额外的证据，证明这些蛋白质起到了外壳的作用；延时图像显示Atg5-GFP荧光的变化似乎与囊泡扩张和脱膜相对应(水岛等人，2001年). 一个问题是这些蛋白质是否具有形成高阶组装体的能力。另一个问题涉及完整囊泡的脱膜驱动力，这是在与溶酶体/液泡融合之前所必需的步骤。脱膜通常是一个定时过程，通过ATP酶的作用进行调节，但在自噬的情况下还没有发现这种蛋白质。最后，Cvt小泡和自噬体的大小和曲率有很大差异(Baba等人，1997年). 两种囊泡的形成都需要Atg12-Atg5·Atg16复合物，但尚不清楚这些蛋白质的构象变化如何适应这两种不同程度的曲率。
囊泡的形成可能发生在没有外壳蛋白的情况下，如吞噬作用，其中吞噬的驱动力是肌动蛋白聚合；然而，吞噬作用的触发因素是结合一个靶点，例如一种细菌，它可以充当支架，使膜能够包裹货物。虽然Cvt复合物可以在酵母Cvt途径中提供这样的支架，但它不足以直接被更大的自噬体吞噬。已知微丝在哺乳动物自噬体形成过程中起作用(Kim和Klinsky，2000年)，但我们不知道它们是否参与驱动膜变形，或者它们是否在酵母中发挥类似的作用。然而，在吞噬过程中，肌动蛋白会引起质膜突起。因此，该模型可能不适用于自噬，因为自噬体不被认为是通过出芽或从预先存在的细胞器突起形成的().
一些蛋白质控制Atg8的修饰、稳定性和定位。例如，在没有Atg12-Atg5的情况下，Atg8-PE不局限于PAS，并且不稳定(Kim等人，2001a；Suzuki等人，2001年). 也有证据表明两个共轭系统之间存在串扰。例如，在哺乳动物细胞中，Atg10与MAP1LC3结合(Nemoto等人，2003年)，并且Atg3促进了Atg12-Atg5共轭物的形成(Tanida等人，2002b). 此外，Atg10水平的增加有助于MAP1LC3处理(Nemoto等人，2003年). 这些结果可能反映了Atg7释放产生的动力学效应，Atg7随后可在替代途径中发挥作用。然而，类似的研究表明，在过量Atg12存在的情况下，MAP1LC3处理增加，但在过量Atg12-Atg5存在的情况下减少(Tanida等人，2002a)，尽管这些观察的意义尚不明确。目前尚不清楚在酵母或其他系统中，两个不同共轭系统之间是否会发生类似类型的串扰。
另一个主要问题涉及Atg8的功能。该蛋白在Cvt和自噬途径中可能具有不同的作用，Cvt囊泡形成需要该蛋白，但自噬体扩张需要该蛋白(Abeliovich等人，2000年). 自噬体形成和扩张的机制尚不清楚(). 内质网的一部分致力于形成自噬体，并且仅仅经历了形成囊泡结构的变形过程吗？或者，自噬体是否在PAS处成核，然后通过囊泡膜的添加而膨胀？如果是的话，这些小泡是从哪里来的，它们是如何被靶向的？哺乳动物细胞中的延时研究表明，自噬囊泡会随时间膨胀(水岛等人，2001年). 在酵母中也可以看到中间囊泡结构的一些证据(George等人，2000年). 感染巨噬细胞单核细胞增生李斯特菌，有证据表明细菌被融合形成更大结构的囊泡隔离(Rich等人，2003年); 然而，尚未显示这些囊泡含有自噬标记。此外，尚不清楚哪些SNARE蛋白会参与囊泡融合。目前，没有证据表明SNARE在Cvt囊泡/自噬体的形成中发挥作用，并且可能融合封闭囊泡是SNARE独立的。
检索
在大多数目标路径中，都有一个检索特定组件以便重用的过程。例如，许多受体与货物分离，并再循环回原来的隔间进行额外一轮装载。在其他情况下，检索决定隔间身份或功能的组件至关重要。这包括需要送回供体膜的蛋白质，如v-SNARE。在被认为在酵母自噬或Cvt途径中起直接作用的>20种蛋白质中，已知只有两种与自噬体或Cvt-囊泡相关-Atg8-PE和Atg19。大多数Atg蛋白是可溶的，可以在完成过程中或完成后从囊泡中循环；然而，Atg9是一种跨膜蛋白，似乎不是完整的自噬体的一部分(Noda等人，2000年). 因此，必须有一些从PAS回收这种蛋白质的机制，即回收途径。Atg9不常见，因为它显示的定位模式不同于大多数Atg蛋白的定位模式：除了定位于PAS外，它还可以在其他多个点状点中看到。另一种蛋白质Atg23也显示出类似的分布(Tucker等人，2003年). 从PAS检索Atg9而不是Atg23需要Atg18、Atg2和PtdIns（3）P（P）(Reggiori等人，2004年a) (). 检索Atg9和Atg23都需要Atg1，但只有在Atg23的情况下，Atg1激酶活性才是必需的(Reggiori等人，2004年a). 后一结果支持了这样的观点，即高水平的Atg1激酶活性对Cvt途径而非自噬至关重要，因为Atg23仅对前一途径至关重要。
PAS中的蛋白质检索。已知只有两种蛋白质与完整的酵母Cvt囊泡或自噬体相关，即特异性受体Atg19和Atg8-PE；参与囊泡形成的其他蛋白质可能在形成过程中从PAS或自噬体/Cvt囊泡再循环。虽然靶向性和释放机制尚不清楚，但大多数Atg蛋白是易于从膜表面释放的可溶性或外周膜蛋白。如图所示，从PAS检索Atg9需要PtdIns（3）P（P），PtdIns（3）P（P）-结合蛋白Atg18、Atg2、Atg13和Atg1。
问题
该领域的主要问题之一是自噬体或Cvt囊泡膜的来源。一个相关的问题是膜是如何靶向囊泡形成部位的。在大多数细胞运输过程中，一些蛋白质作为识别标记物，以确保适当的膜或囊泡传递；这些蛋白质必须被送回捐赠者的隔间，以便再次进行输送。Atg9和/或Atg23标记供体膜的起源吗？如果是的话，这些蛋白质位于细胞内的什么位置？虽然这通常不是假设的，但多种来源可能会形成膜。将Atg9和Atg23定向并交付给PAS需要哪些组件？Atg1、Atg2和Atg18在检索过程中的功能是什么？这些蛋白质可能作为囊泡介导传递或某些新传递机制的新型外壳或适配器的一部分发挥作用。
Atg20和Atg24是结合PtdIns的PX域蛋白质（3）P（P）并参与从内体中提取材料(Hettema等人，2003年). 这些蛋白质在从PAS中检索Atg9和/或Atg23中是否发挥类似作用？
囊泡靶向、对接和融合
必须调节囊泡与溶酶体/液泡融合的时间；如果融合过程在双膜囊泡完成之前开始，则货物将留在胞浆中。由Atg12-Atg5·Atg16组成的假定涂层可能防止过早融合。位于自噬体或Cvt囊泡外表面的Atg8-PE可能具有类似的作用。至少在酵母中，由于Atg4的第二次裂解，它在融合之前被移除，尽管这个处理事件的时间尚不清楚。Atg8ΔR是一种缺乏最终精氨酸残基的Atg8突变形式，其表达绕过了对初始Atg4依赖性切割步骤的需要(); 然而，不能进行从PE中释放Atg8的第二次切割事件会导致自噬和Cvt途径的部分缺陷(Kirisako等人，2000年). 这表明释放的Atg8被重新利用，外膜上的Atg8-PE干扰了这些通路的晚期，或者Atg4在细胞中具有额外的功能。目前尚未开发出一种体外反应来重建Cvt囊泡或自噬体与液泡的融合。然而，分子遗传学研究表明，自噬体和Cvt囊泡与液泡的融合也需要同型液泡融合所需的机制(). 该机制包括：SNARE蛋白Vam3、Vam7、Vti1和Ykt6；NSF、SNAP和GDI同源物Sec17、Sec18和Sec19；Rab蛋白Ypt7；C类Vps/HOPS复合体的成员；以及最近显示在融合过程中起作用的两种蛋白质，Ccz1和Mon1(Darsow等人，1997年；菲舍尔·冯·莫拉德和史蒂文斯，1999年；Harding等人，1995年；Kim等人，1999年；佐藤等人，1998年；佐藤等人，2000年；Wang等人，2003年；Wang等人，2002年).
对接与融合。Vam3、Vam7、Vti1和Ykt6是SNARE家族的成员，在多种细胞环境中的膜融合中发挥作用。Ypt7是Rab小GTPase家族的成员，其成员再次牵涉到许多膜融合的例子。还显示了C类Vps/HOPS复合物和最近显示在融合过程中发挥作用的两种蛋白质，Ccz1和Mon1。
问题
酵母中融合成分的作用分析基于相应的突变体是否阻碍prApe1的成熟并积累一种蛋白酶抗性形式；这种突变体将prApe1保留在完整的细胞溶质囊泡中，在那里，它对球质膜溶解后的外源蛋白酶具有抵抗力。这些研究通常是在营养（Cvt途径）条件下进行的。自噬过程中是否存在不同的SNARE和/或其他融合成分，尚待确定。此外，没有人证明纯化的Cvt囊泡或自噬体上存在任何融合成分。这导致了各种不确定性。例如，prApe1进入液泡需要Vti1；然而，我们不知道它是在自噬体还是Cvt囊泡上，也不知道它是否需要形成完整的囊泡或与液泡融合。
囊泡破裂
酵母自噬的主要目的是降解细胞质并回收产生的大分子，用于在营养胁迫期间合成必需成分。因此，它必须分解由自噬体/Cvt囊泡与液泡融合而产生的单层液泡下囊泡(). 囊泡溶解步骤取决于液泡腔的酸性pH值和蛋白酶B（Prb1）(Nakamura等人，1997年；Takeshige等人，1992年); 然而，Prb1的功能可能是激活在分解过程中起直接作用的液泡酶原。最后一步还牵涉到另外两种蛋白质，Atg15和Atg22(Epple等人，2001年；苏里亚普拉纳塔等人，2000年；Teter等人，2001年). Atg15通过多泡体途径传递到液泡(Epple等人，2003年). 这种蛋白质与脂肪酶家族的序列相似，似乎很可能直接在囊泡破裂中发挥作用。Atg22是一种完整的膜蛋白，位于液泡的限制膜中。与Atg15相反，Atg22仅用于自噬体的降解。
问题
Atg15具有脂肪酶基序，相应活性位点的突变消除了其功能。然而，这种蛋白质属于脂肪酶的三酰甘油家族；所以它的底物是不清楚的。此外，Atg15在真空吸尘器之前或内部的作用位点尚未确定。在自噬体或Cvt囊泡膜的起源已知之前，很难解决后一个问题。Atg22与某些渗透酶的序列相似，但该蛋白在自噬体分解中的作用尚不清楚。
另一个有趣的问题涉及自噬体或Cvt囊泡膜的分化、识别和/或修饰。在囊泡形成的初始阶段，形成囊泡的两侧可能是等效的(). 在某种程度上，双方可能会有所不同。例如，在酵母中，Atg8-PE最初排列在形成自噬体和Cvt囊泡的两侧（图和). 囊泡完成后，Atg8-PE留在囊泡的内部，但Atg8从外膜上被去除，而SNARE蛋白可能局限于外表面。在与液泡融合后，外囊泡膜至少与液泡膜暂时连续。细胞不能破坏这种膜，因为破坏液泡的完整性是致命的。据推测，这种膜要么经过修饰，使其受到类似于液泡膜其余部分的保护，要么迅速从限制膜中去除并再循环或降解，可能是通过微自噬(Müller等人，2000年). 相比之下，产生液泡下囊泡的内囊泡膜必须降解。因此，这种最初相当于外层膜的膜，在本质上不能抵抗液泡水解酶的降解。
脚注
这项工作得到了美国国立卫生研究院向D.J.K提供的公共卫生服务拨款GM53396的支持。
