美国国家科学院院刊。2014年4月15日；111(15): 5514–5519.
对接蛋白FRS2α是VEGF受体信号的关键调节因子
,一 ,b条 ,一 ,b条 ,c（c） ,c、，1和a、，日期：，1
迈克尔·西蒙斯
一耶鲁大学心血管研究中心内科
天耶鲁大学医学院细胞生物学，康涅狄格州纽黑文，06520
一耶鲁大学心血管研究中心内科
以下部门b条外科手术，
c（c）药理学和
天耶鲁大学医学院细胞生物学，康涅狄格州纽黑文，06520
Joseph Schlessinger撰稿，2014年3月11日（2014年1月28日送审稿）
作者贡献：P.-Y.C.、L.Q.、Z.W.Z.、G.T.、I.L.、J.S.和M.S.设计研究；P.-Y.C.、L.Q.、Z.W.Z.和G.T.进行了研究；P.-Y.C.、L.Q.、Z.W.Z.、I.L.、J.S.和M.S.分析数据；论文由P.-Y.C.、L.Q.、Z.W.Z.、I.L.、J.S.和M.S.撰写。
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指南：02BE62F5-ac0-4C2E-8ED3-DC5E3421359C
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重要性
血管内皮生长因子（VEGF）信号的调节在从胚胎和围生期血管发育到成熟成人血管系统的维持到各种器官功能的调节的一系列生物过程中发挥着中心作用。我们报告称，细胞内对接蛋白FRS2α在调节这一过程中起着关键作用，迄今为止还不知道其参与VEGF信号传导。
关键词：磷酸化、MAP激酶、FGF受体、信号转导、受体激酶抑制
摘要
血管内皮生长因子（VEGFs）通过其同源受体酪氨酸激酶（VEGFR1-3）发出信号。我们报道对接蛋白成纤维细胞生长因子受体底物2（FRS2α）在通过这些受体的细胞信号传递中起着关键作用。体外FRS2α调节VEGF-A和VEGF-C依赖的细胞外信号调节受体激酶信号的激活以及血液和淋巴内皮细胞的迁移和增殖。体内FRS2α的内皮特异性缺失导致出生后血管发育和成人血管生成、淋巴管生成和动脉生成严重受损。我们得出结论，FRS2α是以前未经鉴定的VEGF受体信号成分。
血管内皮生长因子（VEGFs）是血液和淋巴管发育和体内平衡的关键调节因子。发育过程中VEGF-A的缺失导致血管形成完全失败(1)而VEGF-C基因敲除消除淋巴管生成(2). VEGF-A和VEGF-C在出生后各种血管和淋巴管床的形成和维持中起着同样重要的作用(三–6). 这两种VEGF分别通过两种受体酪氨酸激酶（RTK）VEGFR2和VEGFR3发出信号，前者主要在动脉和静脉血管中表达，后者在成人组织的淋巴管中表达(7). 另一个VEGF受体，VEGFR1，被认为在内皮细胞中主要起“诱饵”受体的作用，但在单核细胞中可以传递信号(7).
所有VEGF受体都具有许多结构相似性，包括一个细胞外配体结合域、一个单跨膜区和一个含有酪氨酸激酶结构域的胞质结构域和一个插入区。受体激活需要配体诱导的二聚化，导致作为各种信号蛋白结合位点的细胞质酪氨酸的自磷酸化。在VEGF-A受体的情况下，Y的VEGFR2磷酸化1054/Y（Y）1059是导致Y磷酸化的最大VEGFR2激酶活性所必需的1175（ERK活化还需要磷脂酶Cγ1结合位点）和Y951（导致Src激活的TSAd结合位点）等(7). VEGF-C以类似方式通过VEGFR3发出信号。
在研究成纤维细胞生长因子（FGF）信号传导的过程中，我们注意到内皮细胞敲除或缺失支架蛋白FRS2α，已知其参与FGF和神经生长因子（NGF）受体信号传导(8–10)也影响VEGF信号传导。FRS2α是一种对接蛋白，它包含一个N端肉豆蔻酰化位点、一个PTB结构域和一个大的C端尾，其中包含四个连接蛋白Grb2的SH2结构域的结合位点和两个酪氨酸磷酸酶Shp2 SH2结构区的结合位点(11). FRS2α在这些结合位点的酪氨酸磷酸化导致MAPK信号的激活(12).
在这项研究中，我们发现FRS2α在调节血液和淋巴内皮细胞中的VEGF信号传导中起着核心作用。其缺失大大降低了体内外VEGF信号传导，导致出生后血管发育和成人血管生成、淋巴管生成和动脉生成受损。
结果
HUVEC中FRS2α表达的下调导致VEGF-A后VEGFR2磷酸化的显著降低165用磷酸化酪氨酸特异性抗体或磷酸化位点特异性抗体对配体刺激的细胞裂解物进行免疫印迹显示的治疗(). 通过表达显性阴性FRS2α突变体FRS2第6页其所有六种酪氨酸都被FGF受体正常磷酸化，并被苯丙氨酸取代(13) (). 此外，减少FRS2α的表达或FRS2第6页过度表达严重抑制VEGF-A165–诱导的ERK信号传导(). FRS2α敲低后观察到的VEGF信号传导的抑制导致VEGF驱动的HUVEC增殖、迁移和基质胶索形成的显著减少().
HUVEC中FRS2α的敲除抑制VEGF-A165–依赖信号。(A类)对照组和FRS2α敲低的HUVEC隔夜血清饥饿，并用VEGF-A治疗165（50纳克/毫升）。用抗VEGFR2抗体免疫沉淀细胞裂解物（IP），并用抗对酪氨酸抗体免疫印迹。将相同的印迹剥离并用抗VEGFR2印迹。用抗VEGFR2和抗FRS2α抗体印迹输入裂解产物。(B)对照组和FRS2α敲低的HUVEC隔夜血清饥饿，并用VEGF-A治疗165（50纳克/毫升）。用p-VEGFR2、VEGFR2，p-ERK、ERK和FRS2α抗体对细胞裂解物进行印迹。(C类)对照组和FRS2α-6F（Flag）过度表达的HUVEC隔夜血清饥饿，并用VEGF-A治疗165（50纳克/毫升）。用p-VEGFR2、VEGFR2，p-ERK、ERK和Flag（FRS2α）抗体对细胞裂解物进行印迹。(D类)对照组和FRS2α敲低的HUVEC隔夜无血清。细胞增殖(左侧)和细胞迁移(赖特)响应VEGF-A165（50 ng/mL）的曲线如xCELLigence所示。每孔重复加载约1000个细胞（用于细胞增殖）或25000个细胞（用来细胞迁移）(***P（P）与对照组相比<0.01）。(E类)体外基质：在对照组和FRS2α敲除的HUVEC上放置生长因子缺失的基质，并暴露于VEGF-A，评估脐带分支的程度165（50纳克/毫升）。中的数据A类–C类和E类基于三个独立的实验；中的数据D类基于两个独立的实验。
VEGFR2是血液内皮细胞中的主要VEGF受体，而VEGFR3是淋巴管内皮的主要受体。人皮肤淋巴管内皮细胞（HDLEC）中FRS2α的敲除导致VEGF-C治疗后VEGFR3活化显著降低()VEGF-C诱导的ERK1/2活化减少(). 显性负性FRS2α突变体FRS2 a的表达第6页在HDLEC中也表现出类似的效果().
HDLEC中FRS2α的敲低抑制VEGF-C依赖性信号传导。(A类)对照组和FRS2α敲低的HDLEC隔夜无血清，并用VEGF-C（50 ng/mL）治疗指定时间。用抗VEGFR3抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀（IP），并用抗对酪氨酸抗体进行免疫印迹。剥离相同的印迹并用抗VEGFR3印迹。用抗VEGFR3和抗FRS2α抗体印迹输入裂解产物。(B上部)对照组和FRS2α敲低的HDLEC隔夜血清饥饿，并用VEGF-C（50 ng/mL）治疗。用p-ERK、ERK和FRS2α抗体印迹细胞裂解物。(B下部)对照组和FRS2α6F（Flag）过度表达的HDLEC隔夜血清饥饿，并用VEGF-C（50 ng/mL）治疗。用p-ERK、ERK和FRS2α抗体印迹细胞裂解物。(C类)对照组和FRS2α敲低的HDLEC隔夜无血清。细胞增殖(上部)和细胞迁移(下部)根据xCELLigence检测到的VEGF-C（50 ng/mL）谱。每孔重复加载约1000个细胞（用于细胞增殖）或25000个细胞（用来细胞迁移）(***P（P）与对照组相比<0.01）。(D类)对照组和FRS2α敲除的HUVEC隔夜血清饥饿，并用PlGF-1（50 ng/mL）治疗。用抗VEGFR1抗体免疫沉淀细胞裂解物（IP），并用抗对酪氨酸抗体免疫印迹。将相同的印迹剥离并用抗VEGFR1印迹。用抗VEGFR1和抗FRS2α抗体印迹输入裂解产物。数据如所示A类,B、和D类基于三个独立的实验；中的数据C类基于两个独立的实验。
与HUVEC的情况一样，这种现象转化为HDLEC对VEGF-C的反应而减少增殖和迁移(). 最后，FRS2α敲除也抑制了HUVEC中PlGF对VEGFR1的激活(). VEGF-A的信号反应降低与所使用的亚型无关。VEGF-A刺激HUVEC121通过VEGFR2发出信号，但与VEGF-A不同165，不需要与神经纤维蛋白-1结合，导致VEGFR2活化类似降低(图S1A类)对VEGF-C的反应也是如此(图S1B). 为了证明FRS2α敲除后对VEGF的这种反应是与FRS2 a相互作用的受体所特有的，HUVEC和HDLEC用EGF治疗。实验结果见图S1C类和D类表明FRS2α敲除对EGF诱导的ERK激活无影响。
由于VEGF-ERK通路在出生后血管发育、成人血管生成和动脉生成中起着重要作用，我们接下来研究是否存在血管异常Frs2级α突变小鼠。如前所述，纯合子Frs2级α4英尺突变体(频率2α4楼/4楼，缺乏Grb-2结合）是可行的(14)，而纯合子Frs2级α二层/二层突变体（缺乏Shp-2结合）表现出ERK活性的严重下降，并在胚胎发育期间死亡(15). 因为很难区分Frs2级α二层/二层突变体是由于VEGF或FGF信号异常引起的，我们主要研究成人Frs2级α4楼/4楼老鼠。
Frs2级α4楼/4楼敲除小鼠出生时具有适当的孟德尔频率，但明显小于野生型同窝小鼠(图S2A类和B). 心脏、肺和肝血管检查显示血管结构相对正常，VE-cadherin和VEGFR2 mRNA的表达水平与野生型小鼠相似(图S2C类)从而表明内皮细胞质量和正常发育血管生成具有可比性。
VEGF-A是动脉生成的重要驱动因素(16). 为了研究这种突变对动脉生成的影响，我们使用了后肢缺血股动脉结扎模型。远端肢体血流的激光多普勒分析（以缺血肢体与正常肢体的血流比率表示）显示Frs2级α4楼/4楼突变体(图S3A类和B). 此外，根据临床评分判断，突变小鼠表现出更严重的组织损伤(图S3C类). 由于新动脉血管的生长是该模型中导致远端血流恢复的主要机制，因此我们接下来在首次手术后14天对动脉后肢血管进行了显微CT（micro-CT）分析。与远端血流恢复受损的发现一致，micro-CT显示Frs2级α4楼/4楼小鼠与顶级对照组的比较(图S3D类和E类). 因此，Frs2级α4楼/4楼突变与正常血管发育相关，但降低成人血管生成和动脉生成。
为了测试血管对VEGF的反应是否也受到影响，我们使用了体内Matrigel和耳血管生成模型。血管内皮生长因子-A植入Matrigel栓塞165或注射VEGF-A164腺病毒在对照动物中导致广泛的血管生成，而在Frs2级α4F/4F突变体(图S3F类和G公司). 为了证实我们在Frs2级α4楼/4楼敲除动物，我们产生了内皮特异性诱导缺失的小鼠Frs2级α（使用Frs2级α−/−
到描述内皮细胞特异性敲除）。
我们首先研究了成人血管生成。Ad-VEGF-A的注入164病毒进入小鼠耳垫可诱导局部血管生成。这种反应在Frs2级α−/−小白鼠与对照窝鼠的比较(). VEGF-A植入165将Matrigel颗粒浸入Frs2级α−/−与窝友对照组的植入相比，也导致血管生成反应显著降低(). 最后，VEGF-A也得到了类似的结果164和VEGF-C角膜植入物().
血管生成受损Frs2α−/−老鼠。(A类)野生型和Frs2α−/−小鼠用1×109Ad-LacZ或Ad-VEGF-A的pfu164病毒。在第7天使用立体显微镜和荧光显微镜记录VEGF-A诱导的血管生成。(B)对小鼠耳朵进行切片，并计算血管数量(**P（P）与对照组相比<0.01）(n个=每组4只小鼠）。(C类和D类)Matrigel与PBS或VEGF-A混合165（50 ng/mL）置于野生型或频率2α−/−老鼠。第7天，切开基质凝胶塞，并计算血管数量(*P（P）与对照组相比<0.05）(n个＝每组6只小鼠）。(E类–H（H）)含有VEGF-A的Hydron颗粒164或VEGF-C植入野生型角膜Frs2级α−/−老鼠。植入后第7天通过立体显微镜评估血管生成(E类和G公司)（星号表示植入颗粒的位置）。血管密度在F类和H（H）(*P（P）< 0.05; **P（P）与对照组相比<0.01）(n个=每组6只小鼠）。
测试内皮细胞的作用Frs2α动脉生成缺失，我们采用后肢缺血模型。激光多普勒血流显像显示，结扎右侧股总动脉导致同侧爪子的血流减少近90%(). 尽管14天后对照组小鼠恢复了血流，Frs2级α−/−显示缺血足的血流恢复显著减少，组织丢失显著增加(). 此外，对足部缺血部分的毛细血管生长的检查表明Frs2级α−/−老鼠().
动脉生成受损Frs2级α−/−老鼠。(A类)激光多普勒图像显示野生型和非野生型左后肢缺血诱导前后的血流Frs2α−/−老鼠。(B)左脚血流恢复的激光多普勒分析，表示为左脚与右脚的血流比率（L/R）*P（P）<0.05，野生型与。Frs2α−/−(n个=每组8只小鼠）。(C类)在Frs2α−/−小鼠，临床评分显示严重表型，导致肢体坏死。(D类)野生型和非缺血组的代表性切片Frs2α−/−缺血后第14天。毛细管密度定量（数量/mm2肌肉面积）和CD31/肌细胞比率如所示E类数据为每节10个字段的平均值±标准差（每只小鼠3节；n个=每个应变为4）*P（P）<0.05，野生型与。Frs2α−/−.
VEGF-A信号传导在出生后视网膜血管系统的发育中起着关键作用。检查Frs2级α在此过程中，Cdh5-CreERT2或PDGF-BB-CreERT2在出生后第1天（P1）被激活。5天后在P6检查时，Frs2级α−/−小鼠的视网膜血管覆盖率显著降低()除了视网膜血管异常外，Frs2级α−/−小鼠膈淋巴管的数量减少了约50%(). 这些结果共同证明了FRS2α在体内调节VEGF信号传导中的关键作用。
产后血管生成和淋巴管生成缺陷Frs2级α−/−老鼠。(A类–D类)野生型和Frs2级α−/−同窝老鼠。(E类和F类)野生型和Frs2级α−/−同窝老鼠。一'和b条'面板显示血管生成前沿的放大倍数更高(A类–D类)和膈淋巴管(E类和F类).
讨论
本研究发现FRS2α是一种独特的调节因子，也是通过VEGFR的重要细胞内信号转导途径。如VEGFR2和VEGFR3所示，FRS2α的缺失会导致血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞中VEGF-A和VEGF-C诱导信号的激活受损。在体内，这种表型转化为血管生成和动脉生成（VEGF-A依赖性过程）和淋巴管生成（VEGF-C依赖性进程）的严重损害。
FRS2α参与VEGF信号传导是非常意外的，因为VEGFR2缺乏明显的典型FRS2β结合位点。许多蛋白质被提议在VEGFR2下游发挥作用，传递其细胞内信号，包括TSAd、PLCγ和Grb2等(7). T细胞特异性适配器分子（TSAd）与VEGFR2 Y结合951网站。TSAd对细胞培养模型中肌动蛋白的重组和Src的激活至关重要，但对小鼠的发育并不重要(17,18). Grb2与VEGFR2 Y结合1212但其作用尚不确定，因为小鼠VEGFR2 Y1212突变体没有明显的缺陷(19). PLCγ绑定到Y1175并激活MAPK信号。携带VEGFR2 Y1175F突变的小鼠在胚胎期（E）8.5和E9.5之间死于内皮和造血缺陷，类似于素食者2−/−老鼠(19). 考虑到这些因素，确定FRS2α依赖性调控VEGF信号的确切机制将非常重要。
FRS2α在VEGF信号传导中的这种关键参与表明了该分子的新作用。迄今为止，FRS2α与FGF和NGF调节的生物活性有关，包括细胞增殖和迁移、神经炎的生长以及各种器官和组织的发育(11,20).Frs2级α−/−小鼠在E7.0–E7.5死于多种发育问题，包括前后轴异常形成、胚胎外外胚层、大脑皮层、眼睛、颈动脉体、心脏流出道、前列腺、四肢和骨骼发育失败以及广泛的血管异常(21).
目前的研究首次证明，在这些小鼠中发现的血管缺陷可能是由于VEGF信号受损所致。Frs2级α二层/二层敲除小鼠在胚胎发育过程中死亡，胚胎表现出严重的生长迟缓和广泛的水肿。正如我们在本研究中所证明的那样，Frs2级α4楼/4楼敲除小鼠还发现了一些血管生成和动脉生成缺陷，包括对体内VEGF刺激的反应性降低。然而，由于很难在FRS2α表达全面中断的小鼠系中明确找出VEGF依赖性异常，我们研究了内皮特异性缺失的小鼠血管缺陷Frs2级α在出生后启动。
在这些小鼠的耳朵中注射Ad-VEGF-A或插入含有VEGF-A的Matrigel塞子，与同窝对照组相比，血管生成反应明显减弱。类似地，视网膜血管系统的出生后早期发育（主要由VEGF驱动）也在Frs2级α−/−老鼠。最后，一项使用后肢缺血模型进行的动脉生成研究也表明，动脉网络的形成受到严重阻碍，这与VEGF依赖性MAPK信号激活受损的其他遗传小鼠模型中的情况相当(16,22). 综上所述，这些数据表明内皮FRS2α在血管发育、血管生成、淋巴管生成和动脉生成中发挥着关键作用。负责FRS2α依赖性调节VEGF受体信号的确切机制尚不明确，目前正在进行研究。值得注意的是，尽管有报道称在EC中通过VEGF实现FRS2α磷酸化(23)，该事件没有任何功能意义，通常不考虑FRS2α参与VEGF信号传导(7).
在血管系统中，血管内皮生长因子（VEGF）和生长因子（FGF）在调节血管发育和维持血管内环境稳定方面发挥着中心作用，尽管两者略有不同。FRS2α在VEGFR信号传导中的意外作用具有深远的生物学意义，因为单个分子同时影响VEGF和FGF信号传导通路这一事实不仅对我们理解VEGF生物学本身至关重要，而且对理解VEGF/FGF（或潜在的其他RTK）也至关重要串扰和设计用于选择性（或联合）影响VEGF和FGF信号的药物的开发。反过来，后者对于开发旨在刺激和抑制血管生长的治疗干预措施至关重要。
总之，在本研究中，我们发现FRS2α结合并调节所有三种VEGF受体的信号传导。这一结果将该分子置于VEGF和内皮细胞生物学的中心。
材料和方法
生长因子。
所有重组人生长因子，包括EGF（Sigma E9644；用于体外刺激）、VEGF-A165（研发系统293-VE-010；用于体外刺激），VEGF-A121（研发系统4644-VS-010；用于体外刺激）、VEGF-C（研发系统2179-VC-025；用于体外激励）、VEGF-C（R&D系统2179-VC-025/CF；用于体内角膜血管生成分析）、PlGF-1（Peprotech 100-06；用于体外激励）和重组小鼠VEGF-A164（R&D Systems 493-MV-005/CF；用于活体角膜新生血管测定）在0.1%BSA/PBS中重建。
慢病毒的产生。
FRS2αshRNA慢病毒构建体购自Open Biosystem。描述了FRS2α慢病毒的产生和生产(24). 对于FRS2α6F的生产，10μg pLVX-IRES-puro携带频率2α第6页用FuGENE6将cDNA表达盒、5μg pMDLg/PRRE、2.5μg RSV-REV和3μg pMD.2G共转染293T细胞。48小时后，收集培养基，用0.45μm过滤器清除，与聚溴乙烯（Sigma）混合，并应用于细胞。培养6小时后，用新鲜培养基替换含病毒培养基。
用于蛋白质免疫检测的抗体
以下抗体用于免疫印迹（IB）、免疫沉淀（IP）或免疫组织化学（IHC）：CD31（ab28364，Abcam；IHC，克隆4G10（05–321，Millipore；IB），磷酸酪氨酸（PY20）（sc-508，Santa Cruz；IB，β-微管蛋白（T7816，Sigma；IB，p-VEGFR2 Tyr-1175（2478，细胞信号；IB）和p-VEGFR2Tyr-1214（44-1052，Invitrogen；IB。
细胞培养和试剂。
细胞系和培养条件。
原代人内皮细胞培养：HUVEC（人脐静脉内皮细胞，第5-10代；Lonza）和HDLEC（人皮肤淋巴管内皮细胞，5-10代，Lonza）在补充了EGM-2-MV子弹试剂盒（Longza）的EBM-2中培养。在细胞接种之前，立即在37°C下用0.1%明胶（G6144；Sigma）涂覆培养容器30分钟。对于不同的生长因子处理，细胞在血清中饥饿过夜，并用50 ng/mL EGF、VEGF-A处理165、VEGF-A121不同时间点的VEGF-C或PlGF。
原代小鼠内皮细胞分离。
使用大鼠抗鼠CD31抗体（克隆MEC13.3，Pharmingen；553370）和Dynabeads（目录号110.35；Invitrogen）从心脏、肺和肝脏分离出原代小鼠内皮细胞(25).
细胞裂解、免疫沉淀和Western Blot分析。
为了获得细胞裂解物，用冷PBS清洗细胞，并在低渗HNTG裂解缓冲液（20 mM Hepes，pH 7.4，150 mM NaCl，10%（vol/vol）甘油，1%Triton X-100，1.5 mM MgCl）中冰上裂解10分钟2，1.0 mM EGTA），含有蛋白酶抑制剂混合物（11-697-498-001；罗氏）和磷酸酶抑制剂混合物（04-906-837-001；罗氏公司）。裂解产物在15871×克在4°C下放置15分钟。描述了免疫沉淀和Western blot分析程序(25).
Matrigel脐带形成试验。
20孔板涂上生长因子还原的Matrigel（354230；BD Biosciences），并在37°C下固化30分钟。将细胞胰酶化，以6×10的密度接种在Matrigel涂层板上4在含有0.5%FBS（含或不含VEGF-A）的EBM-2培养基中每孔培养6个细胞，并在37°C下培养6小时。放大100倍拍摄显微照片。
xCELLigence实时细胞分析：细胞增殖和细胞迁移。
使用xCELLigence实时细胞分析（RTCA）DP仪器（Roche Diagnostics）在37°C和5%（vol/vol）CO的加湿培养箱中进行细胞增殖和细胞迁移实验2.
使用改良的16孔板（E-plate；Roche Diagnostics）进行细胞增殖实验。最初，向微孔中添加100μL无细胞生长培养基[20%（vol/vol）FBS]。在室温下放置装置30分钟后，测量每个孔的背景阻抗。然后将100微升含或不含生长因子的细胞悬浮液接种到微孔中（每孔1000个细胞）。将平板锁定在培养箱中的RTCA DP设备中，每个孔的阻抗值由xCELLigence系统自动监测，并表示为细胞指数值（CI）。CI每15分钟监测300次。在每个测试中使用每种细胞浓度的两个重复。向E板水井周围的空间加水，以避免蒸发的干扰。
细胞迁移实验是通过使用改良的16孔板（CIM-16；Roche Diagnostics）进行的，每个孔由一个上腔和一个下腔组成，上腔和下腔由一个随机分布的8微米微孔膜隔开。
最初，将160μL和30μL介质分别添加到下腔和上腔，并将CIM-16板在37°C和5%（vol/vol）CO下锁定在RTCA DP装置中2在60分钟内根据制造商的指导方针获得平衡。在此潜伏期后，进行测量步骤，作为无细胞培养基产生的背景信号。为了启动实验，将100μL细胞悬浮液接种到微孔中（每孔10000个细胞）。添加细胞后，按照制造商的指南，在层流罩中室温下培养CIM-16板30分钟，以使细胞沉淀在膜上。
为了防止实验过程中蒸发的干扰，在CIM-16板上井周围的整个空白区域中添加了介质。每种情况都是重复进行的，在培养5小时期间，每5或15分钟进行一次编程信号检测。所有数据均由提供的RTCA软件记录（第1.2.1节）。
RNA分离、定量实时PCR和基因表达谱分析。
使用RNeasy plus Mini Kit（74134，Qiagen）分离RNA，并使用iScript cDNA合成试剂盒（170-8891，Bio-Rad）转化为cDNA。通过混合等量的cDNA、iQ SYBR Green Supermix（170-8882；Bio-Rad）和基因特异性引物（QIAGEN），使用Bio-Rad CFX94进行实时定量PCR。所有反应均在25μL反应体积内进行，一式两份。数据被归一化为内源性控制β-肌动蛋白。数值表示为与对照相比的折叠变化。
小鼠的产生。
这个Frs2级α4楼/4楼老鼠(26)由位于康涅狄格州纽黑文的耶鲁大学V.P.Eswarakumar提供。Frs2αflox/flox公司描述了小鼠(27). Cdh5-CreERT2公司(28)（德国蒙斯特马克斯普朗克研究所R.H.Adams赠送）和PDGF-BB-CreERT2(29)（来自伦敦大学学院M.Fruttiger的礼物）转基因小鼠首次用mT/mG[B6129（Cg）-Gt（ROSA）26Sor进行繁殖tm4（ACTB-td番茄，-EGFP）罗/J] （JAX SN:007676）小鼠产生内皮细胞特异性报告小鼠，然后与Frs2αflox/flox公司老鼠。为了诱导Cre重组用于成年血管生成和动脉生成检测，P6幼崽每隔一天用吸管喂食0.05 mg/g三苯氧胺溶液（20 mg/mL玉米油原液）10次。为了诱导P6视网膜血管和隔膜的Cre重组，P1幼崽连续五天用吸管喂食0.05 mg/g三苯氧胺溶液（20 mg/mL玉米油原液）。这些系与mT/mG报告系的杂交用于评估Cre驱动重组的有效性。对于PCR基因分型分析，使用的引物如下：
Frs2α4楼（5′-AGAATGGTGCACAACCAAAATCC-3′和5′-CAATTCTTAACACACCACAGGCG-3′），Frs2αflox/flox公司（5′-GAGTGGCTGTGATTGGAGAGAGGAGCAGGTG-3′和5′-GGCACAGTGTGCTGCAGACACATG-3′），mT/mG，和PDGF-BB-CreERT2（5′-CCAGCCGCCGTCGCAACTC-3′和5′-GCCGCCGGGATCACTCTC G-3′）
动脉生成和血管生成检查的动物模型。
所有实验均按照耶鲁大学动物保护和使用委员会批准的方案进行。
小鼠耳血管生成测定。
编码VEGF-A的腺病毒164(1 × 109pfu）或LacZ控制病毒（1×109pfu）皮内注射到小鼠耳部皮肤。
体内基质凝胶塞试验。
生长因子减少的Matrigel（354230；BD Biosciences）与VEGF-A预混合165（PHC9391，Invitrogen）和肝素（20 U/mL）。将样品注射到10周龄小鼠的皮下组织中。一旦小鼠被杀死，将回收的Matrigel塞固定在10%（vol/vol）福尔马林中。
小鼠角膜微袋试验。
含有VEGF-A的微丸164（493-MV-005/CF；R&D）或VEGF-C（2179-VC-025/CF(n个=每组8个）。植入后第7天，对角膜新生血管进行检查并拍照。
Hindlimb缺血模型和激光多普勒血流分析。
如前所述诱导小鼠后肢缺血(16). 对于激光多普勒血流分析，在术前和术后第0、3、7和14天使用激光多普勒血流分析仪（Moor LDI；Moor Instruments）测量后肢血流。通过使用不同的彩色像素对激光图像中的血流变化进行定量评估。为了避免小鼠与小鼠之间以及实验与实验之间的差异，后肢血流量表示为左（缺血）与右（非缺血）激光多普勒信号的比值。
显微CT血管造影。
如前所述进行显微CT血管造影和分析(30).
简言之，使用GE eXplore Locus SP扫描仪（GE Healthcare），在60 kVp电压和100 mAs管电流下，使用角度增量为0.5度、各向同性分辨率为24μm的360视图采集2D micro-CT图像。Micro-CT数据通过Microview软件（2.2版；GE Healthcare）传输到Advanced Workstation（4.4版；GE医疗）进行血管分割。美国国立卫生研究院ImageJ用于分析血管树。数据表示为血管段编号，表示200中计算的指定直径的血管总数z（z）三维micro-CT图像中小腿的截面。
统计分析。
使用GraphPad Prism软件v.5进行统计分析。Photoshop CS5软件用于图像处理，符合图像处理的一般准则。所有数据均以平均值±标准差表示，并与一名双尾学生进行了两组比较t吨测试。值为P（P）<0.05为有统计学意义。
致谢
我们感谢Robert Friesel（缅因州医学中心研究所）提供Frs2α和VEGFR2构建体；Ralf Adams（曼斯特马克斯普朗克研究所）Cdh5-CreERT2公司小鼠；Marcus Fruttiger（伦敦大学学院）用于PDGF-BB-CreERT2小鼠；Fen Wang（德克萨斯州农工健康科学中心）Frs2α飞行/飞行老鼠；Veraragavan P.Eswarakumar（耶鲁大学）Frs2α4楼/4楼老鼠；以及丽塔·韦伯、妮科尔·科普兰和韦恩·伊万格利斯蒂，负责维护这些研究中使用的小鼠。这项工作得到了美国国立卫生研究院R01 HL084619（医学硕士）的支持。
工具书类
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