SNT-1/FRS2alpha physically interacts with Laloo and mediates mesoderm induction by fibroblast growth factor

doi:10.1016/s0925-4773(01)00524-x

.2001年12月；109(2):195-204.

doi:10.1016/s0925-4773（01）00524-x。

SNT-1/FRS2alpha与Laloo物理相互作用并通过成纤维细胞生长因子介导中胚层诱导

J哈马¹, 许先生, M戈德法布, D C韦恩斯坦

附属公司

PMID： 11731233
预防性维修识别码：下午3244880
内政部： 10.1016/s0925-4773（01）00524-x

SNT-1/FRS2alpha与Laloo物理相互作用并通过成纤维细胞生长因子介导中胚层诱导

J哈马等。机械开发. 2001年12月.

.2001年12月；109(2):195-204.

doi:10.1016/s0925-4773（01）00524-x。

作者

J哈马¹, H Xu先生, M戈德法布, D C温斯坦

附属

¹美国纽约州纽约市西奈山医学院药理学系。

PMID： 11731233
预防性维修识别码： PMC3244880型
内政部： 10.1016/s0925-4773（01）00524-x

摘要

成纤维细胞生长因子（FGF）配体家族的成员在非洲爪蟾中胚层的形成中起着关键作用。虽然已确定由FGF受体激活触发的信号级联的许多成分，但这些细胞内因子与受体本身之间的联系尚难确定。我们在这里报道了爪蟾SNT-1（FRS2alpha）的特性，这是一种以前被鉴定为其他生物环境中FGF活性介体的支架蛋白。SNT-1在爪蟾发育早期广泛表达，这与该蛋白在中胚层形成中的作用一致。异位SNT-1在爪蟾外胚层外植体中诱导中胚层，与低水平的FGF协同作用，并被Ras活性抑制所阻断，表明SNT-1的功能是在中胚层形成过程中传递来自FGF受体的信号。此外，SNT-1突变体抑制FGF诱导的中胚层，表明SNT-1是该过程所必需的。完整胚胎中显性负性SNT-1的表达阻止中胚层的形成，并显著干扰躯干和尾部的发育，这表明在体内轴形成过程中需要SNT-1或受突变结构抑制的相关因子。最后，我们证明了SNT-1与Src-like激酶Laloo在物理上相关，并且SNT-1活性是Laloo诱导中胚层所必需的，这表明SNT-1和Laloo是脊椎动物中胚层形成过程中信号复合体的组成部分。

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数字

图1
爪蟾SNT-1的序列和表达。（A）假定人类与爪蟾SNT-1氨基酸序列。相同的氨基酸显示在填充框中。显示了保守的磷酸酪氨酸结合（PTB）结构域。强调了6YF中突变的六个酪氨酸残基的位置（见下文）（B）RT-PCR分析*XSNT-1型*发育过程中的表达。（C） RT-PCR分析*XSNT-1型*原肠胚期组织块中的表达（10.5期）。“-RT”通道包含除逆转录酶外的所有试剂，用作阴性对照。鸟氨酸脱羧酶（ODC）用作负荷控制（Bassez等人，1990年）。*Xbrachyury（Xbra）公司*是这一阶段的全中胚层标志物（Smith等人，1991）；*科尔丁*是背部中胚层标志物（Sasai等人，1994）；*Xwnt8型*是腹外侧中胚层标记物（Smith和Harland，1991；Christian等人，1991）。

图2
SNT-1错误表达的影响。（A）上图：35期胚胎在动物极注射1ng人SNT-1 RNA的侧视图。底部：未注射同胞胚胎的侧视图。前部位于左侧。SNT-1注射导致包括眼睛在内的前部结构丧失，产生小的异位尾状结构（箭头），偶尔直肠扩大。（B）人类SNT-1在动物帽子中诱导中胚层。在囊胚晚期解剖并培养至原肠中期的动物帽的RT-PCR分析。从2细胞期注射SNT-1 RNA的胚胎中分离出动物帽，如表所示。（C）爪蟾SNT-1（XSNT-1）诱导动物帽子的中胚层。在囊胚晚期解剖并培养至原肠中期的动物帽的RT-PCR分析。从2细胞期注射1 ng XSNT-1的胚胎中分离出动物帽。

图3
SNT-1在包括FGF和Ras的信号级联中发挥作用。（A） SNT-1活性被显性抑制Ras结构的表达所抑制。1纳克*SNT-1型*和1ng显性抑制性Ras如表所示，注射RNA。（B） SNT-1和碱性FGF（bFGF）蛋白在中胚层诱导试验中协同作用。如表所示，使用50 pg SNT-1和1 ng/mL bFGF。培养至原肠中期的动物帽的RT-PCR分析。

图4
SNT-1突变体作为假定的显性阴性试剂发挥作用。（A） ΔMT抑制FGF介导的中胚层诱导，随后用全长SNT-1进行抢救。（B） 6YF抑制FGF介导的中胚层诱导，随后用全长SNT-1进行抢救。培养至原肠中期的动物帽的RT-PCR分析。2纳克Δ*百万吨*，1纳克*6年（预测）*和1 ngSNT-1型如表所示，注射RNA。添加25 ng/mL bFGF，如表所示。

图5
SNT-1突变体6YF抑制爪蟾胚胎中胚层诱导和正常发育。（A） 32期胚胎，注射500 pg6年（预测）单独RNA（顶部面板），联合注射500 pg6年（预测）和40 pg激活的Ras（常量活性Ras）RNA，或未注射。前部位于左侧。顶部面板底部的两个胚胎为背视图，显示开放的囊胚残余；所有其他视图都是横向的。（B） β-半乳糖染色和全山就地用反义核酸杂交原肠中期白色胚胎*Xbrachyury公司*探查；植物后视图。左侧胚胎注射100pgβ*-半乳糖苷酶*2细胞期单个卵裂球赤道区的RNA；注释之间的重叠*Xbrachyury公司*表达（蓝色）和红色β-gal产物（箭头）。右侧的胚胎注射了100pgβ*-半乳糖苷酶*RNA和500 pg6年（预测）同一区域的RNA；注意到β-半乳糖产物存在于*Xbrachyury公司*表达式（箭头）。

图6
SNT-1和Laloo之间的物理关联。（A） SNT-1/Laloo联合免疫沉淀的Western blot分析。（B）酵母2杂交分析，证明Laloo和SNT-1的SH4/SH3结构域之间的相互作用。Myc-tagged Gal4 DNA结合域融合蛋白（Laloo或FGFR1片段）和Gal4激活域融合蛋白的表达载体（SNT-1或PLCγ-SH2域）在酵母中共转化，并将其接种到不含亮氨酸/色氨酸的合成培养基上以测定共转化效率，或接种到不含有亮氨酸/色氨酸/组氨酸+25mM 3-氨基-1,2,4-三唑（AT）的培养基上，以选择显示融合蛋白相互作用的克隆。未检测到与阴性对照PLCγ融合蛋白相互作用的蛋白（未显示）。底部面板：LalooSH4/3、LalooSH 4和LalooSH-3-30蛋白在酵母中表达。用抗Myc单克隆抗体免疫沉淀酵母蛋白提取物，并用针对GAL4 DNA结合域的单克隆抗体进行Western blot分析。

图7
显性负性SNT-1的表达抑制激活的Laloo突变体Y492F诱导的中胚层。培养至原肠中期的动物帽的RT-PCR分析。100微克*Y492F型*RNA和1 ng6年（预测）如表所示，注射RNA。

图8
描述SNT-1和Laloo在脊椎动物早期发育期间FGF信号传导中作用的模型。箭头不一定表示直接的分子相互作用。详见正文。

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