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单元格代表。作者手稿；PMC 2013年1月3日提供。
以最终编辑形式发布为：
Cell Rep.2012年12月27日；2(6): 1684–1696.
2012年11月29日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.celrep.2012.10.021
预防性维修识别码：项目经理3534912
美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院419368
PMID：23200853

FGF通过控制let-7miRNA表达

陈培余，1,* 秦凌峰，2,* 卡门·巴恩斯，3中，# 克劳斯·查利斯，三 泰伊，2 张新波，1 拉赫马特·阿里，2 佩德罗·梅迪纳，4 于军（Jun Yu），1 弗兰克·J·斯莱克，4 丹尼尔·安德森，5,6,7 维克托·科特利安斯基，5 王芬（Fen Wang），8 乔治·特利德斯，2和迈克尔·西蒙斯1,9
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补充资料

总结

维持正常的内皮功能对血管功能的各个方面都至关重要，但其调节机制尚不清楚。在这项研究中，我们表明，基线FGF信号传导至内皮细胞的中断导致let-7miRNA水平反过来增加TGFβ配体和受体的表达，并激活TGFβ信号，导致内皮-间充质转化（Endo-MT）。我们进一步发现，在小鼠移植性动脉病模型中，Endo-MT是新生内膜形成的一个重要驱动因素，并且在排斥人类移植损伤中起重要作用。内皮细胞FGF信号输入的减少是由于FGF抵抗状态的出现，其特征是FGF信号级联关键成分的表达和激活的炎症依赖性减少。这些结果确立了FGF信号作为维持内皮细胞稳态的关键因素，并指出Endo-MT在血管病理学中的意外作用。

介绍

维持正常的血管系统是一个积极的过程。成纤维细胞生长因子（FGF）最近已成为正常血管状态的关键调节因子(Hatanaka等人，2010年；村上等人，2008年). 通过同源酪氨酸激酶受体的循环和组织-受体FGF信号，该受体需要细胞内适配器FRS2来启动MAPK信号(Eswarakumar等人，2005年). 使用各种体外模型的实验证据表明FGF在抑制TGFβ信号传导中的作用。因此，FGF2下调TGFβR1的表达，减弱内皮细胞（EC）对TGFβ的反应(Fafeur等人，1990年)并拮抗TGFβ1介导的平滑肌α-肌动蛋白（αSMA）表达(Papetti等人，2003年). 此外，FGF可以通过MAPK途径逆转TGFβ1诱导的上皮细胞上皮间质转化（EMT）(Ramos等人，2010年). 这些观察结果表明，内皮细胞FGF信号的丢失可能导致TGFβ途径的上调，并促进血管系统的不良变化。然而，连接FGF和TGFβ信号级联的分子机制以及FGF依赖性调控TGFβ的生物学作用尚未确定。

血管系统中TGFβ信号传导失调的一个可能后果是新生内膜的形成。新生内膜形成是许多常见疾病的基础，包括移植血管病、血管成形术后和血管移植再狭窄、高血压和动脉粥样硬化等。尽管几十年的研究，新生内膜细胞的起源仍然存在争议，各种研究都指出了内侧平滑肌细胞（SMC）增殖的作用(Costa和Simon，2005年)、血管壁炎症(Ohtani等人，2004年)和外膜血管生成(Khurana等人，2004年).

新生内膜形成的一个潜在因素是内皮向间充质转化过程（Endo-MT）。与EMT有点类似，Endo-MT被认为导致内皮细胞转分化为间充质细胞类型，包括SMC样和成纤维细胞样细胞。虽然Endo-MT与包括心脏纤维化在内的多种病理过程有关(Zeisberg等人，2007年b)和肺动脉高压(Kitao等人，2009年)，其存在本身仍有争议。与EMT类似，Endo-MT被认为是由TGFβ以Smad依赖和独立的方式驱动的(Kitao等人，2009年；Medici等人，2011年). 然而，在病理条件下导致Endo-MT或抑制其在正常血管中发生的因素尚未确定。

在本研究中，我们观察到正常EC中内皮细胞FGF信号的关闭导致TGFβ配体和受体的表达增加，并激活TGFβ信号。在体外，这导致EC形态和SMC标记的表达发生变化。在体内，使用命运映射小鼠，我们观察到新生内膜的形成和广泛的血管周围纤维化。这一过程是由内皮细胞表达let-7通常维持低水平TGFβR1表达的miRNAs。FGF信号关闭对Endo-MT诱导的影响可以通过抑制let-7b或let-7c体内外表达。Endo-MT是小鼠移植动脉病模型中新生内膜形成的关键驱动因素，在排斥人类移植中存在，并且可以通过使用let-7b模仿。这些结果表明，基础FGF信号需要维持在较高水平let-7内皮细胞中的表达反过来阻止TGFβ信号的激活并抑制Endo-MT。

结果

1.基础FGF信号抑制TGFβ介导的Endo-MT

为了测试FGF信号在EC中的作用，我们在人脐动脉内皮细胞（HUAEC）中使用RNA干扰来抑制FRS2的表达，FRS2是参与FGF受体信号传递的关键适配器分子。免疫荧光染色显示，对照组HUAEC表现出典型的圆形/鹅卵石样形态，而FRS2敲除导致细胞形状发生明显变化，并伴有平滑肌钙蛋白（SM-calponin）的表达，该蛋白在内皮细胞中不正常表达(图1A). Western blotting证实在FRS2敲除细胞中出现此和其他SMC标记(图1B). FACS分析表明，对照组和FRS2敲除EC均表达CD31，并能摄取Di-acLDL，排除了SMC污染(图1C).

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FRS2通过TGFβR1途径调节间充质标志物基因表达

（A） 对照组和FRS2击倒HUAEC的VE-钙粘附素（红色）和SM-钙蛋白（绿色）的免疫荧光染色。细胞核用TO-PRO-3（蓝色）进行复染。比例尺：50µm。（B） 对照组和FRS2击倒HUAEC的SMC标记物的免疫印迹。（C） 用流式细胞术分析对照组或FRS2敲低的HUAEC的CD31和Dil-acLDL。（D） 来自对照或FRS2敲低细胞的TGFβ家族基因的qPCR阵列mRNA表达谱。（E） 对照组和FRS2敲低HUAEC的TGFβRs及其下游靶基因表达的qRT-PCR分析。（与对照组相比，*p＜0.05；***p＜0.001）。β-actin用于标准化模板加载的变异性。（F） 对照组和FRS2击倒HUAEC的TGFβR1、Smad2、间充质细胞和内皮细胞标记物的免疫印迹。SM钙调蛋白和间充质标志物纤连蛋白和波形蛋白表达的（G–I）qRT-PCR分析（**p<0.01；***p<0.001；NS：与对照组相比不显著）。β-actin用于标准化模板加载的可变性。所示数据代表了四个独立实验（除了（D））。

这些发现表明，FRS2敲除后的EC正在进行骨髓间充质标记物获得所定义的Endo-MT。由于TGFβ信号转导参与了这一过程，我们接下来研究了TGFβ相关基因的表达。qPCR分析表明，TGFβ1和TGFβ2、三种TGFβ受体以及几种胶原亚型和其他受TGFβ信号刺激的基质蛋白显著增加(图1D、E). Western blotting证实TGFβR1表达增加并激活TGFβ信号(图1F). 为了验证FGF信号传导的中断诱导TGFβ信号传导和Endo-MT，用抑制FGF信号传递的FRS2突变形式或显性阴性FGFR1（FGFR1-DN，图S1A）转导HUAEC。通过表达FGFR1-DN或FRS2α-6F构建物实现的FGF信号的完全抑制导致TGFβ信号的增加（图S1B），以及平滑肌和其他间充质标志物的表达（图S1C）。

为了证明FRS2敲除后TGFβ信号的激活对于Endo-MT确实是必要的和充分的，使用了几种不同的实验方法。用TGFβR1抑制剂SB431542治疗FRS2敲低EC，显著降低SM-calponin、纤维连接蛋白和波形蛋白的表达(图1G). 在转导显性负性TGFβR1结构（TGFβR_1 K230R）后也观察到类似的结果(图1H)而用特定shRNA沉默Smad2表达导致SM-calponin显著降低，但纤维连接蛋白和波形蛋白表达没有显著降低(图1I). 最后，通过将野生型TGFβR1与TGFβ一起引入HUAEC，或通过在HUAEC中表达组成活性的TGFβR_1（TGFβR1-T202D），以激酶死亡突变型TGF？R1-K230R作为对照，在没有FGF信号抑制的情况下激活TGFβ信号（图S2A，B）。因此，TGFβ信号的激活导致平滑肌（图S2C）和其他间充质标志物（图S2D）的表达增加。

2.FGF通过调节let-7miRNA表达

接下来我们研究了FGF信号关闭后TGFβR1表达增加的机制。mRNA半衰期分析显示FRS2表达下调后显著增加(图2A). 这表明存在miRNA调节TGFβR1信息的稳定性。在硅片分析中确定了let-7与种子序列完全匹配的miRNAs家族let-7在转化生长因子βR1 3'-UTR 75–82和3889–3895中(图2B). 同时，miRNA阵列分析显示，所有基因的表达都减少了20倍以上let-7家庭成员（与let-7b和第7页c分别减少108倍和120倍）(图2C).

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FRS2击倒下调let-7家族

（A） 对照或FRS2敲除HUAEC用DMSO或10µg/ml放线菌素D（ActD）处理指定时间。然后用qRT-PCR测定TGFβR1的表达。18S rRNA用于标准化模板加载的可变性。（B） 对齐let-7人TGFβR1的3’UTR序列。（C） 使用实时PCR miRNA阵列和来自对照细胞或FRS2敲除细胞的cDNA评估miRNA表达谱。（D） βR1和SM钙蛋白酶在用Lin28转导的HUVEC中的qRT-PCR，let-7海绵表示或空向量。β-actin用于标准化模板加载的变异性。（E） 对照组TGFβR1、p-Smad2、Smad2和FRS2的免疫印迹以及用let-7慢病毒。（F） 用qRT-PCR方法分析对照组和FRS2敲除的HUAEC中TGFβR1、TGFβ下游靶分子、平滑肌标志物和间充质标志物基因的表达let-7慢病毒（与对照组相比，*p<0.05；**p<0.01；**p<0.001）。β-actin用于标准化模板加载的变异性。所示数据（A和D–F）是三个独立实验的代表。（G） 小鼠静脉注射对照药物或胆固醇制剂安替戈米尔-let-7b/c（单次注射2mg/kg），6d时分离肝内皮细胞。的表达式let-7用qRT-PCR分析miRNAs。SNORD66用于标准化模板加载的变异性（***p<0.001；NS：与对照组相比不显著）。（H） 经对照或配方安替戈米治疗的小鼠肝内皮细胞中K-ras、N-ras、HMGA2、CDK6、CDC25A、TGFβR1和波形蛋白的基因表达水平-let-76天。β-actin用于标准化模板负荷的变异性（与对照组相比，*p<0.05；***p<0.001）。（一） CD31/波形蛋白的免疫荧光染色（细胞核用DAPI（蓝色，比例尺：7µm）复染），在用对照药物或配方安替戈米尔治疗的小鼠肝切片中-let-76天。（J） 注射对照或配方安替戈米尔的小鼠肝脏EC表达波形蛋白的定量-let-7（与对照组相比***p<0.001）。

为了证明FGF抑制后TGFβ信号的增加直接归因于let-7水平，我们抑制了let-7使用两种替代方法的表达式。Lin28对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的转导let-7胚胎发育过程中的生物发生(Viswanathan和Daley，2010年)导致TGFβ途径、平滑肌和间充质标记物中基因的表达增加(图2D，左面板和图S3）。类似地，HUVEC转导let-7有效抑制all表达的“小孢子”结构let-7miRNAs还导致TGFβR1、SM-calponin和HMGA2（已知let-7目标）表达式(图2D，右侧面板）。

然后我们检查了let-7FGF信号被抑制的EC中的表达将反过来抑制TGFβ信号的激活和Endo-MT诱导。为此，HUAEC转产了let-7b或let-7c前miR。FRS2敲低诱导的TGFβR1表达增加和Smad2磷酸化被两种基因转导完全逆转let-7b或let-7c所有Endo-MT标记物的表达(图2E、F).

FGF信号与let-7然后在体内研究其表达。FRS2（FRS2α-2F，图S1A）中的特定酪氨酸被FGF结合FGFR1磷酸化并激活ERK信号导致FGF信号和胚胎死亡率显著降低(Gotoh等人，2004年). 在E10.5对FRS2α-2F胚胎的检测表明let-7水平（图S4A）。

成年小鼠中的FGF信号可以通过给予FGF陷阱构造（sFGFR1-IIIC）来抑制(村上等人，2008年). 为了证明构建的有效性，培养的HUVEC暴露于Ad-sFGFR1-IIIc导致明显的形态学改变（图S4B），抑制let-7表达（图S4C），并诱导包括SM22α、SM-calponin和纤维连接蛋白在内的Endo-MT标记物（图S4D，E）。与这些体外数据一致，向小鼠注射Ad-sFGFR1-IIIc导致在宿主循环中检测到它们，并显著降低let-7miRs在从这些动物的心脏和肝脏分离的原发EC中的表达（图S4F，G）。

确定是否减少let-7在体内表达与抑制FGF信号具有相同的效果，我们直接靶向let-7b和let-7c miRNAs在小鼠体内使用胆固醇制备的拮抗剂以提高稳定性和传递效率(Love等人，2010年). 分析let-7单次尾静脉注射2mg/kglet-7原发性肝EC中b/c抑制剂的表达显著降低let-7b和let-7与对照组小鼠相比，经抗戈米特治疗的小鼠中的c miRNA没有受到影响(图2G). 减少了let-7b/c水平进一步通过几个已知的let-7目标包括K-ras、N-ras、HMGA2、CDK6和CDK25A(图2H). 与体外数据一致let-7b/c表达导致TGFβR1和波形蛋白表达增加(图2H). 最后，免疫细胞化学检查肝脏血管let-7与Endo-MT相一致，经抗戈麦尔治疗的小鼠在腔EC中的波形蛋白表达增加(图2I，J).

3.FGF信号的炎症依赖性抑制

上述体外和体内研究的结果表明，FGF信号传导的减少导致let-7TGFβ依赖性Endo-MT的表达和启动为了证明这种生物学与疾病的相关性，我们接下来检查了Endo-MT是否发生在移植排斥反应中，这是一个与高局部干扰素-γ（IFN-γ）产生相关的过程，据报道该过程抑制FGF信号(Friesel等人，1987年).

IFN-γ处理培养的HUVEC导致αlet-7依赖性基因HMGA2，TGFβR1和Smad2水平增加，SMC和其他间充质标志物表达大幅增加，包括Notch3、SM22α、纤维连接蛋白和波形蛋白(图3A、B). 值得注意的是，FGFR1的表达显著降低，FGF信号几乎完全被抑制(图3C). 用TNF-α和IL-1β治疗EC可导致FGF信号的类似减少(图3C)而其他炎症细胞因子，如IL-6、MCP-1和VEGF，则没有这种作用（图S5A-C）。与观察到的FGF信号减少相一致，HUVEC暴露于IFN-γ导致let-7miRs表达(图3D).

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炎症细胞因子（IFN-γ、TNF-α和IL-1β）下调FGF受体，从而使EC在体内外对FGF的反应降低

（A） 对照组和人干扰素-γ治疗的HUVEC平滑肌和间充质标志物基因表达的qRT-PCR分析（与对照组相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001）。β-actin用于标准化模板加载的变异性。（B） 对照组和人干扰素-γ治疗的HUVEC中平滑肌和间充质标记物的免疫印迹。（C） 用人干扰素-γ（10 ng/ml）、人TNF-α（10 ng/ml）或人IL-1β（10 ng/ml）在完全生长培养基中处理HUVEC 6天，然后在0.5%FBS饥饿培养基中培养18小时。用FGF2（50 ng/ml。FGF信号下游靶点的免疫印迹。（D） 成熟的qRT-PCR分析let-7对照组和人干扰素-γ处理的HUVEC中的表达。SNORD47用于标准化模板加载的可变性。所示数据（A–D）代表四个独立实验。（E） 左：Cdh5-CreERT2邻近主动脉和移植物切片中p-ERK的免疫荧光染色；mT/mG小鼠。比例尺：10µm。右：注射FGF2的小鼠内皮细胞表达p-ERK的定量（***p<0.001，与相邻主动脉相比）。

接下来，我们采用了一种小鼠移植排斥模型，其特征是排斥移植物周围的局部炎症反应强烈，内皮细胞命运定位小鼠是通过交叉Cdh5-CreER2和mT/mG（“番茄”）小鼠系（均为C57BL/6背景）产生的然后通过从P2到P20的三苯氧胺给药激活Cre基因（图S6A）。这导致用GFP永久标记所有EC和EC衍生细胞。对这些小鼠的动脉进行的分析表明，GFP在管腔EC中表达均匀，且完全缺乏所有SMC（Notch3，αSMA，SM22α）或间充质（波形蛋白，胶原）标记物（图S6B）。

将BALB/c小鼠的主动脉段植入Cdh5-CreERT2-mT/mG（C57BL/6背景）小鼠主动脉会在接下来的2-3周内导致严重的移植物炎症和排斥反应。为了测试这种炎症反应对内皮细胞FGF信号的影响，在术后2周将同种异体动脉移植物的小鼠宿主静脉注射FGF2，并在15分钟后处死。FGF信号的免疫细胞化学分析显示，移植物管腔EC中几乎没有p-ERK信号，而邻近正常动脉段的管腔EC显示出强烈的p-ERK信息(图3E).

移植后2周的移植物检查显示，10.1%的新生内膜SMC（由Notch3或αSMA的表达定义）表达GFP，这表明内皮起源(图4A、B). 此外，新生内膜中有很高比例的EC（79%）表达Notch3和αSMA(图4A、C)，显示出非常广泛的Endo-MT。为了研究FRS2α表达中断对这一过程的影响，我们将FRS2飞行/飞行小鼠置于mT/mG背景。然后将这些小鼠与Cdh5-CreERT2驱动系（iEC-FRS2α）杂交，使FRS2α表达失活−/−)然后在出生后第5天激活Cre表达（P5）。

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Endo-MT参与小鼠动脉硬化

（A） 通过抗Notch3、抗αSMA和抗胶原蛋白1免疫染色对动脉移植物进行组织学分析。Cdh5-GFP公司+/槽口3+（红色）和Cdh5-GFP+/α形状记忆合金+（红色）共定位表示Endo-MT，并显示为黄色。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺：Notch3和αSMA为10µm，胶原蛋白1为63µm。五十、 流明；N、 新生内膜；白色三角形表示内皮细胞；黄色三角形表示内部弹性层；箭头表示内皮细胞表达SMC标记物。（B） 缺口百分比3+（左）或αSMA+（右）Cdh5-GFP细胞+新生内膜（与对照组相比，p<0.05；p<0.01）。（C） Cdh5-GFP百分比+Notch3细胞+（左）或αSMA+（右）新生内膜（与对照组相比，**p<0.01）。（D） Cdh5-GFP百分比+Notch3细胞+（左）或αSMA+（右）流明（与对照组相比，*p<0.05；**p<0.01；**p<0.001）。（E–F）通过计算机辅助显微镜对胶原1区域和动脉移植内膜厚度进行形态计量学评估（与对照组相比，*p<0.05；**p<0.01）。PBS（N=7只/组）、Luc-control（N=6只/组-let-7（N=9只小鼠/组），以及let-7b模拟（N=6只小鼠/组）。

内皮特异性FRS2α缺失或抑制FGF信号传导let-7抗戈麦尔表达导致GFP数量进一步显著增加（p<0.05）+SMC公司(图4A，B)而带有SMC标记的新生内膜EC的比例增加到近100%(图4C).

内腔EC显示出更广泛的变化：61%的移植物内腔EC表达Notch3和αSMA，而在iEC-FRS2α中内腔MT的范围增加到80-90%−/−鼠标或跟随let-7抗miR给药(图4D). 内皮细胞FRS2α缺失和let-7安替戈米尔治疗(图4E、F).

测试let-7为了挽救这种表型，我们使用化学合成的双链let-7b miR模拟物封装在脂质体制备的脂质纳米粒（LNPs）中(Love等人，2010年). 通过首先确定抑制靶基因表达的剂量反应来评估针对内皮靶点的给药效果。单次静脉注射携带0.03至2.2 mg/kg抗Tie2 siRNA的LNPs，显示70%抑制第2级72小时后肝脏和心脏EC中的表达（图S7A，B），两个器官的半衰期持续约30天（图S7，C，D）。靶向siRNA制剂也有类似结果图标2（图S7E、F），素食者2（图S7G，H）和Cdh5（图S7 I，J）。相反，使用LNP配制的荧光素酶siRNA（LUC）或生理盐水（图S7A、B、E–J）未观察到任何受试基因的可检测减少，这表明沉默是siRNA特有的，不是脂质体载体引起的。为了证明这种抑制水平的生理意义，我们对0.7 mg/kg LNP Cdh5 siRNA处理的小鼠进行了伊文思蓝试验。敲除后，与对照小鼠相比，EC通透性显著增加（图S7K）。

使用上述LNP制剂，let-7从术后第7天开始每隔一天注射一次mimics（0.5mg/kg）（共注射四次），并在第14天收获移植物。给移植小鼠注射这些模拟物导致内皮源性新生内膜SMC（GFP）数量显著减少+/槽口3+或αSMA+细胞：从未经治疗的10.1%到模拟治疗小鼠的3%，p<0.05）(图4A、B)以及新生内膜EC接受内膜-MT的比例（从79%到20.3%，p<0.01；图4A、C). 同样显著的是，接受Endo-MT的管腔EC比例显著下降（从61%降至33.7%，p<0.01；图4A、D)胶原沉积和新生内膜厚度显著减少(图4A、E、F)

为了确定人类疾病中是否出现类似现象，我们检查了移植的慢性排斥心脏的冠状动脉（n=8）。与正常人冠状动脉相比(图5A)慢性心脏移植排斥反应患者动脉管腔EC的大多数（79.8%）表达SMC标记物Notch 3(图5B、C、E). 新生内膜分析显示，与小鼠移植模型相似，Endo-MT广泛存在，76%的新生内膜EC表达Notch3(图5D、F)占新生内膜SMC的很大一部分（9.6%）(图5G).

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Endo-MT参与人移植动脉硬化

（A–B）人类正常和慢性排斥反应人冠状动脉的CD31和Notch3免疫荧光染色的代表性图像。比例尺：62µm。L表示流明；白色三角形表示IEL（内部弹性板）。（C–D）人慢性排斥反应冠状动脉管腔和新生内膜EC的高倍图像，用Notch3染色共定位。比例尺：16µm。箭头表示内皮细胞表达SMC标记物。（E） CD31的百分比+Notch3细胞+管腔（与正常动脉相比，***p<0.001）。（F） CD31的百分比+Notch3细胞+新生内膜（Ø，未检出）。（G） 缺口百分比3+CD31细胞+新生内膜（Ø，未检出）。（H–I）人CD31和Notch3免疫荧光染色在SCID/米色小鼠中的人冠状动脉移植的代表性图像，用或不用人PBMC重建。比例尺：62µm。L表示流明；白色三角形表示IEL（内部弹性板）。（J–K）经人PBMC管腔和新生内膜EC处理的动脉移植物的高倍图像，用Notch3染色共定位。比例尺：16µm。箭头表示内皮细胞表达SMC标记物。（L） CD31的百分比+Notch3细胞+管腔内（***p＜0.001，与无PBMC相比）。（M） CD31的百分比+Notch3细胞+在新生内膜中（未检测到）。（N） 缺口百分比3+CD31细胞+新生内膜（Ø，未检出）。

将一段人冠状动脉移植到异体人PBMC重建的免疫缺陷小鼠主动脉中诱导移植排斥反应(Rao等人，2008年)然后用于验证内皮细胞中Endo-MT的发生。PBMC注射三周后，排斥的人动脉显示出广泛的新生内膜形成（比较图5 H与I)Notch3在管腔和新生内膜EC中广泛表达(图5J、K). 定量分析表明，84.7%的管腔EC和77%的新生内膜EC表达Notch3(图5L，M)10.4%的新生内膜SMC表达EC标记(图5N).

最后，为了检测这种现象在其他环境中的发生频率，我们评估了另外两种以不同程度的新生内膜形成和血管炎症为特征的体内模型——金属丝损伤和静脉-动脉移植。Cdh5-CreERT2股总动脉钢丝损伤；mT/mG小鼠导致新生内膜形成，5.2%的新生内膜细胞显示GFP表达(图6A). 小鼠腔静脉移植到同基因Cdh5-CreERT2的主动脉；mT/mG小鼠也与新生内膜中的Endo-mT证据相关，2周时为3%，4周时为6.7%。静脉移植物的内脏EC也显示出广泛的Endo-MT，其中31%在移植物2周后表达间充质标志物，45.6%在移植物4周后表达(图6B).

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Endo-MT在股动脉钢丝损伤和静脉适应模型中的应用

（A） A–b：后肢血管解剖。蓝线表示内皮层剥落。A、 动脉；五、 静脉；星号表示导线插入的位置。c–d：未损伤（左）和损伤（右）股动脉的典型横截面图像。e–f：损伤3周后损伤股动脉切片中αSMA（红色）的免疫荧光染色。五十、 流明；N、 新生内膜；M、 媒体。（B） a：静脉至动脉移植示意图。b–c：下腔静脉低倍镜下CD31（红色）和αSMA（红色）的免疫荧光染色。d： 高倍放大下腔静脉αSMA（红色）的免疫荧光染色。e–f：静脉移植物低倍放大CD31（红色）和αSMA（红色）的免疫荧光染色。g&i：移植后2周和4周静脉移植物的高倍放大CD31（红色）免疫荧光染色。h&j：移植后2周或4周静脉移植物高倍镜下αSMA（红色）的免疫荧光染色。

讨论

本研究中的数据表明，需要维持EC中的基本FGF信号let-7miRNA表达。高let-7反过来，抑制TGFβ信号传导和抑制Endo-MT也需要相应的水平。最后，Endo-MT本身是许多以FGF信号传导阻力为特征的疾病状态中新生内膜形成的重要因素。因此，FGF控制let-7表达直接调节TGFβ信号，连接这两条关键的生长因子信号通路，并维持血管系统的正常状态(图7).

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FGF依赖性调节TGFβ信号和Endo-MT的模式

FGF对大量细胞类型产生过多的影响(Eswarakumar等人，2005年). 在血管系统中，FGF信号通过维持血管系统完整性所需的持续FGF刺激发挥保护作用(Hatanaka等人，2010年；村上等人，2008年)和VEGFR2表达(村上等人，2011年). 目前的研究通过证明持续的FGF信号在预防Endo-MT中的作用来扩展这一新的FGF功能，并暗示let-7miRNA是这一过程中的关键参与者。

let-7miRNA家族最初在秀丽隐杆线虫作为发育时间和细胞增殖的调节器(Reinhart等人，2000年). 该家族在整个系统发育树中高度保守，在小鼠和人类中由11个非常密切相关的基因组成，编码在三条不同的染色体上(Roush and Slack，2008年). 迄今为止，let-7miRs参与了胚胎发育过程中许多事件的控制，包括神经系统和肝脏发育(Maller Schulman等人，2008年)，肿瘤抑制(Zhang等人，2007年)和抑制细胞增殖(Johnson等人，2007年)虽然最近的研究表明他们参与了肿瘤的EMT，包括一个提示let-7b级逆转了这个过程(Li等人，2009年).let-7miRNAs在EC中也高表达，被认为是促血管生成的(Urbich等人，2008年).

尽管有这些重要的生物学作用，但对let-7生物成因。在胚胎发育过程中，RNA结合蛋白Lin28a/b选择性地阻断其成熟(Hagan等人，2009年；Lehrbach等人，2009年)而异核核糖核蛋白A1（hnRNPA1）抑制Drosha对其的加工(Michlewski和Caceres，2010年). Lin28在成人内皮细胞中不表达，我们观察到在FGF阻断后hnRNPA1表达没有增加（数据未显示）。我们的数据表明，稳态FGF刺激对于持续let-7但这种效应的机制尚不明确。let-7家族又间接地与包括TGFβR1在内的几个TGFβ家族成员的调节有关(Tzur等人，2009年).

我们的研究提供了强有力的证据支持FGF信号、，let-7表达和转化生长因子β。在细胞培养研究中，使用几种不同的方法抑制FGF信号一致导致let-7表达式。在体内，let-7FGF信号减少的胚胎（FRS2α-2F突变体）中的水平显著降低，而系统性给予pan-FGF陷阱sFGFR1-IIIc则降低let-7不同器官内皮细胞的水平。在每种情况下，FGF信号依赖性丢失let-7表达与TGFβ家族成员表达增加、TGFβ信号通路激活和Endo-MT标记物的出现有关。

事实上let-7TGFβ信号通路上调的原因是其自身水平，而非阻断FGF信号通路的其他效应，许多观察结果支持Endo-MT。体外研究表明let-7抗坏血酸诱导的EC表达-let-7海绵或表情let-7抑制因子Lin28A导致TGFβ、TGFβR1和经典TGF靶基因（如胶原蛋白或波形蛋白）的表达增加。此外，EC表现出与Endo-MT和一些平滑肌及其他间充质标记物的表达一致的显著形态学变化。类似地，体内安替曲明抑制let-7b/c表达也导致TGFβR1表达增加和Endo-MT标记物的出现。最重要的是，恢复let-7内皮细胞中的b水平let-7b模拟物和递送系统旨在促进miRNA传递到内皮细胞，逆转FGF阻断或let-7安替戈米尔治疗对Endo-MT标记物表达的影响及其功能后果。虽然所有let-7家庭成员用EC表示，我们选择let-7b因为它证明了let-7c、 FGF信号转导中断后表达的最显著减少let-7 let-7b与TGFβR1具有最佳互补性(Tzur等人，2009年).

Endo-MT现象的存在及其对人类病理学的贡献仍然是一个激烈争论的问题。除了转化生长因子β，还有另外两种信号通路，Notch(Chang等人，2011年)和1级(Garcia等人，2012年)，也被报道可以诱导它。然而，分子细节仍然很少。虽然有大量证据表明TGFβ信号转导与EMT有关，但其在Endo-MT中的作用尚不明确。一些研究报告称，用TGFβ在体外长时间刺激EC可诱导Endo-MT（Ishisaki等人，2003；Zeisberg等人，2007a)但没有研究证明TGFβ在体内诱导Endo-MT的能力。TGFβ被认为通过Smad依赖性激活蜗牛来诱导Endo-MT(Kitao等人，2009年). 据报道，Endo-MT在心脏、肾脏、肺部、癌症和年龄相关性纤维化中发生(Ghosh等人，2010年；Zeisberg等人，2007a；Zeisberg等人，2007b). 目前的研究有力地支持了Endo-MT现象的现实，并扩展了其生物学作用。

特别是，我们已经证明，内皮-MT在新生内膜形成中发挥着重要作用，新生内膜形成是许多重要心血管疾病状态的基础。在移植模型中，内皮-MT占新生内膜中SMC的约10%，而管腔EC的约80%表现为间充质转化。这一点非常重要，因为转化后的细胞可以分泌大量胶原蛋白和其他ECM蛋白，从而导致血管纤维化。事实上，内皮特异性FRS2α缺失或let-7安塔戈米尔政府。此外，内腔EC获得间充质表型可能导致内皮功能障碍，例如增加血管通透性或加强白细胞迁移(村上等人，2008年).

Endo-MT发生的触发因素是FGF信号的丢失。虽然许多因素可以并且确实会影响这一过程，但FGF抵抗的发生显然与炎症有关。我们追踪到这一联系与包括IFN-γ和TNF-α在内的关键炎症介质降低FGFR1表达和显著降低FGF-依赖ERK激活的能力有关。因此，与严重血管炎症相关的条件，如同种异体动脉移植，可诱导广泛的内-MT反应。在其他血管损伤模型中，FGF信号的丢失不太严重，例如线动脉损伤或静脉-动脉移植，Endo-MT仍会发生，但程度更有限。除了血管损伤外，Endo-MT还被报道用于许多病理环境，包括急性心肌梗死(Zeisberg等人，2007b)和急性肾损伤(Basile等人，2011年)也具有强烈炎症成分的特征。

最重要的是，Endo-MT明显发生在人类疾病中。事实上，来自慢性排斥性心脏移植的八分之八的人动脉中，有明确证据表明，Endo-MT和移植到用同种异体人PBMC重建的免疫缺陷小鼠体内的人动脉与同种异体小鼠动脉移植的频率相同。

总之，FGF通过控制TGFβ、TGFβR1和Smad2的表达来调节内皮TGFβ信号let-7水平。FGF抵抗状态的出现和FGF信号输入的减少导致let-7转化生长因子β信号转导增加，最终导致内膜形成和纤维化。

材料和方法

原代小鼠内皮细胞的分离和培养

如前所述，从心脏和肝脏分离出原代小鼠内皮细胞(Murakami等人，2011年).

let-7家族微松结构

A类let-7构建了273个nts的小孢子，包含9个隆起结合位点（每个位点对应于let-7家庭成员：let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i和mir-98）。这个let-7通过对6个单链化学合成DNA片段的退火和连接，合成了家族小孢子。凸起的结合位点是根据microRNA结合位点的经典规则设计的(Filipowicz等人，2008年). 273 ntlet-7将家族小孢子串联亚克隆以扩增结合位点。

蛋白质印迹分析

用T-PER（Thermo Scientific）溶解细胞，T-PER含有完整的微型蛋白酶抑制剂（Roche）和磷酸酶抑制剂（Rosche）。将每个样品中的20µg总蛋白用4%–12%双三凝胶（Bio-Rad）和MOPs流动缓冲液（Bio-Rad）溶解，转移到硝化纤维素膜（Bio-Read）中，并用抗体进行探测。使用SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate（Thermo Fisher Scientific）进行化学发光测量。

RNA分离、qRT-PCR和基因表达谱分析

使用RNeasy plus Mini Kit（Qiagen）分离RNA，并使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）转化为cDNA。通过混合等量cDNA、iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）和基因特异性引物，使用Bio-Rad CFX94（Bio-Rad）进行定量实时PCR（qRT-PCR）。所有反应均在25µl反应体积内进行，一式两份。数据归一化为内源性β-肌动蛋白。底漆列于补充表1.

使用人类TGFβBMP信号通路（PAHS-035D，QIAGEN）RT对84个TGFβ相关和EMT相关基因进行定量PCR分析2Profiler PCR阵列，并在Bio-Read CFX96机器（Bio-Rad）上运行。使用制造商集成的基于网络的软件包进行数据分析，该软件包具有基于循环阈值（Ct）的折叠式变化计算。

MicroRNA靶点预测

为了确定TGFβR1的3'UTR内潜在的miRNA结合位点，使用了以下生物信息数据库：TargetScan(http://www.targetscan.org)、PitTar(http://pictar.mdc-berlin.de)和DIANA-microT v3.0(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/).

microRNA实时PCR分析

使用人类细胞分化和发育RT对88个miRNA进行定量PCR分析2剖面仪PCR阵列（MAH-103A，QIAGEN）。使用RT对microRNA阵列数据进行验证2miRNA qPCR分析和RT-PCR引物集（QIAGEN）。个体miRNA表达与小核SNORD47（人类）或Snord66（小鼠）的表达相对应。PCR扩增包括在95°C条件下进行10分钟的初始变性步骤，然后在95°C条件下进行45次PCR循环，持续30秒，在60°C下持续30秒。

小鼠和胚胎的产生

财务报告准则2弗洛克斯(Lin等人，2007年)和FRS2α-2F(Gotoh等人，2004年)先前已经描述了小鼠。将Cdh5-CreERT2转基因小鼠与mT/mG[B6129（Cg）-Gt（ROSA）26Sor杂交tm4（ACTB tdTomato，-EGFP）Luo/J] （JAX SN:007676）小鼠生成EC特异报告小鼠。对于Cdh5-GFP表达细胞的命运定位，Cdh5CreERT2；每隔一天用0.05mg/g三苯氧胺溶液（20mg/ml玉米油原液）吸管喂食mT/mG幼鼠10次。

let-7 miRNA脂质制剂

let-7b抑制剂的合成。安塔戈米尔斯let-7b和let-7c的合成如所述(Krutzfeldt等人，2005年)：反-let-7b、 5'-a英寸-秒一秒卡卡卡卡库卡科秒u个秒c（c）秒一秒-Chol-3’；和反-let-7c、 5英尺秒一秒ccauacaaccuacc公司秒u个秒c（c）秒克秒-胆固醇-3’。小写字母表示2'-O（运行）甲基修饰核苷酸；下标“s”表示硫代磷酸键；“Chol”代表通过羟脯氨酸连接的胆固醇。反-let-7b和anti-let-7使用与之前描述的C12-200-siRNA制剂相同的方法和成分将c包裹在脂质纳米粒（LNP）中(Love等人，2010年). 通过动态光散射测定粒径（Zetasizer Nano ZS；英国马尔文）。防磨平均直径-让7b-LNP为145 nm，用于抗-让7c-LNP为160 nm。

let-7b模拟物的合成

Alnylam Pharmaceuticals（马萨诸塞州剑桥）合成了化学修饰的miRNA模拟物。成熟链的序列let-7b经Dicer处理后，mmu-let-7b-5p（毫米单位-let-7b、，MIMAT0000522公司)和mmu-let-7b-3p（毫米单位-let-7b*，MIMAT0004621公司)，从miRbase获得(http://www.miRbase.org). 2-O（运行）-甲基核苷酸修饰（小写）被引入到两条链中，以降低触发先天免疫反应的可能性。在等摩尔量的化学修饰5p和3p链退火后获得双链miRNA模拟物：mi-let-7b条L（左），用于轻度修改（5p 5'-UGAGGuAGuAGGUUGUGUG.GUU-3'，3p 5'-CuAuAcAACCuACUGCCUUCC-3'）；和mi-let-7b条小时，用于重度修改，（5p 5'-UGAGGuAGuAGGUUGUGUG.GUU-3'，3p 5'-cuAuAcAAccuAcuGccucc-3'）。用siRNA靶向荧光素酶siLuc配制的LNPs作为对照。

脂质纳米粒（LNPs）中的miRNA配方

microRNA模拟物和siLuc被封装在用脂质C12-200配制的LNP中，使用与前面描述的相同的方案和成分。所有LNP的平均直径范围为54–59 nm。

体内sFGFR1-IIIc腺病毒给药和let-7安替戈米尔给药

sFGFR1-IIIc腺病毒(村上等人，2008年)剂量为5×1010每只小鼠通过尾侧静脉注射的病毒颗粒。给对照小鼠等量的无菌PBS。用人IgG亚类分析试剂盒（Invitrogen）测定sFGFR1-IIIc的血清水平。对于let-7给小鼠注射安替戈米尔，给小鼠注射1:1的抗-让7b-LNP和反-让7c-LNP或PBS，2 mg/kg体重，每次经尾侧静脉注射0.1 ml。注射后6天测量EC中的miRNA或mRNA水平。

let-7 antagomir和let-7在小鼠动脉移植模型中的体内模拟递送

对于let-7实验中，在动脉移植七天后，给小鼠注射四种剂量的let-7安替戈米尔（2 mg/kg）、荧光素酶对照（0.5 mg/kg）和let-7b每隔一天通过颈静脉注射0.1 ml，模拟（0.5 mg/kg）。

人体组织

从心脏功能正常的器官供体、接受心脏移植的终末期心肌病患者、或在尸检或再次移植时出现慢性排斥反应的同种异体心脏移植受者获得未经鉴定的人冠状动脉。组织采集和分析得到了耶鲁大学医学院、新英格兰器官银行和不列颠哥伦比亚大学审查委员会的批准。

Endo-MT动物模型

所有实验都是根据耶鲁大学机构动物护理和使用以及人类调查委员会批准的方案进行的。

动脉移植模型

对于小鼠对小鼠的主要错配动脉移植模型，将4-5周龄雄性BALBc/J小鼠的胸主动脉段插入10-12周龄雄性受体Cdh5CreERT2的肾下主动脉；mT/mG小鼠使用端对端显微外科吻合技术。对于人鼠动脉移植模型，将手术标本或尸体器官供体的人冠状动脉相邻段植入8至12周龄CB.17重症联合免疫缺陷（SCID）/米色小鼠的肾下主动脉。动物接受1×108移植后1周，每只小鼠腹腔注射人异基因（动脉）外周血单个核细胞（PBMC）。冠状动脉移植后4周，对动物实施安乐死，切除移植动脉并在OCT中冷冻以进行进一步分析。

股动脉损伤模型

这是按照前面所述进行的(Acevedo等人，2004年).

静脉移植模型

在小鼠静脉-动脉移植模型中，将雄性、4-5周龄C57BL/6小鼠的胸腔内下腔静脉段插入雄性受体、10-12周龄Cdh5CreERT2的肾下主动脉；mT/mG小鼠使用端对端显微外科吻合技术。

形态分析

为了获取移植的移植物、动脉或肝脏，对动物进行麻醉，并用生理盐水和4%PFA灌注组织。对于冷冻切片制备，从麻醉小鼠中分离出移植物，在4°C下在4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜，在4℃下在15%蔗糖中冷冻6小时，并嵌入OCT（Tissue-Tek）中。

免疫荧光染色

冷冻块以6µm的间隔进行切片。对于冷冻组织切片，载玻片在−20°C的丙酮中固定10分钟。对于石蜡切片，在二甲苯中对载玻片进行脱蜡，在柠檬酸盐缓冲液（10 mM，pH 6.0）中煮沸20分钟，进行抗原回收，然后再水化。用PBS清洗三次后，在4°C的湿化室中用封闭溶液（10%BSA和PBS中的马血清）稀释的下列初级抗体培养组织切片过夜：抗人SMα-actin-APC（1:10）；兔抗Notch3（1:100）；兔抗胶原蛋白1（1:100）；兔抗SM22α（1:100）。用TBS清洗切片三次，用适当的Alexa荧光488、594或633结合二级抗体在室温下用1:1000稀释在封闭溶液中培养2小时，再次清洗三次，并用带有DAPI（Invitrogen）的Prolong Gold安装试剂安装在载玻片上。使用Velocity软件捕获图像，并使用ImageJ（NIH）进行量化。

计算机辅助图像分析（定量IF）

使用NIH图像1.60测量前胶原和胶原阳性面积。使用计算机辅助图像分析和NIH图像1.60，从横切面上的4个区域测量新生内膜厚度，并从5个连续横切面计算平均值，每个移植体相距150µm。用于评估αSMA+/Cdh5-GFP公司+或槽口3+/Cdh5-GFP公司+用免疫荧光染色在10倍放大镜下成像，分析每个移植物至少10个间隔150µm的切片，以确定内皮细胞和平滑肌标记物的共存。

统计分析

使用GraphPad Prism软件v.5进行分析。所有数据均以平均值±标准差表示，两组比较采用双尾Student t检验。P<0.05的值具有统计学意义。

​

集锦

  1. FGF控制内皮细胞中let-7 miRNA的表达
  2. let-7表达减少导致内皮细胞向间质转化（Endo-MT）
  3. Endo-MT是人类疾病病理学的重要贡献者

补充材料

01

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致谢

我们感谢R.Friesel（缅因州医学中心研究所）提供FGFR1构建物和FGFR1抗体，R.Adams（蒙斯特马克斯普朗克研究所）为Cdh5-CreERT2小鼠，V.Eswarakumar（耶鲁大学）赠送FRS2α-2F小鼠，N.Kirklies-Smith（耶鲁大学）为静脉注射提供技术援助，B。McManus（不列颠哥伦比亚大学）用于人类冠状动脉标本，S.Kuchimanchi（Alnylam）用于miR模拟合成。

这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R01-HL 053793（授予M.S.）和R01-CA 131301（授予F.S.）的支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

作者贡献

P-Y.C、L.Q、G.T和M.S.构思并设计了实验，并对结果进行了讨论。P-Y.C、L.Q.、T.Y.、X.Z.、R.A.和J.Y.进行了实验。生成并提供P.P.M.和F.J.Slet-7海绵构建，F.W.生成FRS2敲除小鼠，C.B、K.C.、D.G.A.和V.K.开发体内给药系统，生成并提供let-7体内研究用抗miRs。P-Y.C.、G.T.和M.S.撰写了手稿。

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