VEGF-A依赖性动脉生成需要Neuropilin 1胞质结构域

未改变的病理性血管生成编号1^细胞老鼠

我们之前已经证明NRP1细胞质尾部对发育中的小鼠视网膜的正常血管生成不是必需的(Fantin等人。，2011)，本研究证实了这一发现(图S1A和S1A’在线提供）。为了解决此组织中的病理性血管生成是否需要NRP1结构域，我们采用了氧诱导视网膜病变的小鼠模型(Smith等人。，1994). 在本试验中，将视网膜血管部分发育的7日龄幼鼠暴露于高氧环境中5天。这种治疗可以消除视网膜中央不成熟的毛细血管，特别是动脉周围的高氧分压毛细血管，但不会导致动脉或静脉退化(图S1B、 “vo”表示血管闭塞的区域）。在第12天回到正常的室内空气后，现在血管化较差的视网膜缺氧，上调VEGF-A，并引发病理性新生血管反应(图S1B、 “nv”表示新生血管的区域）。具体来说，新生血管反应导致动脉的纵向扩张，导致其弯曲的外观(图S1B和S1B′，箭头）。同时，从静脉和残留的毛细血管中发芽导致新生血管簇的形成(图S1B′，分别为直箭头和曲线箭头）。血管闭塞和新生血管的模式在编号1^细胞小鼠及其野生型（WT）同胞(图S1B、 S1C、S1B′和S1C′）。定量分析证实两种基因型在血管闭塞或新生血管反应方面没有显著差异(图S1D和S1E）。

接下来，我们研究了补充有缓冲液（对照）或NRP1结合型VEGF-A、VEGF-A-亚型的生长因子缺失的Matrigel微丸皮下植入物中的血管生成₁₆₅.血管内皮生长因子-A₁₆₅-在对照组和编号1^细胞7天后的小鼠(图S1F和S1G）。最后，我们使用了一个皮肤损伤模型，其中伤口闭合强烈依赖于血管生成(Tonnesen等人。，2000). 我们发现对照组和对照组的伤口闭合率相似编号1^细胞为期7天的小鼠试验(图S1H和S1I）。综上所述，所有三种分析均表明，NRP1胞质尾部不需要用于产后或病理性血管生成。

动脉生成受损编号1^细胞老鼠

然后，我们检查了NRP1胞质尾部对发育和成年动脉生成的需求。为此，我们使用micro-CT（mCT）可视化新生鼠（P7）肾脏和年轻成年鼠（6-8周龄）心脏、后肢和肾脏的动脉循环，使用的造影剂仅填充动脉床，而不是毛细血管床或静脉床(西蒙斯，2008). 动脉循环的mCT图像及其定量分析显示编号1^细胞在P7发育肾血管系统方面，小鼠与同窝对照小鼠的比较(图1A和1B）以及在成人冠状动脉、肢体和肾循环中(图1C–1I）。总的来说编号1^细胞小鼠与联结蛋白缺失小鼠非常相似(Chittenden等人。，2006). 成人不同器官的动脉血管系统发育受损编号1^细胞小鼠的体重、肾脏和心脏重量都有小幅度但显著的减轻(图S2A） 以及mCT确定的肾脏和心脏大小(图S2B） 与WT室友相比。

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图1

新生儿第7天肾脏及成人心脏、后肢和肾脏动脉血管系统的显微CT分析编号1^细胞老鼠和野生型小白蚁

（A–D）第7天新生儿肾脏和WT和编号1^细胞16μm分辨率的小鼠。

（E–I）显微CT图像的定量分析编号1^细胞（白色条）和WT（黑色条）新生儿肾脏和成人心脏、后肢和肾脏显示直径<100μm的血管总数显著减少（平均值±SEM，^*p<0.05）。

另请参见图S1和S2系列.

接下来，我们分析了后肢缺血模型中的动脉生成，该模型是由结扎和切除一段股总动脉诱导的，如前所述(Ren等人。，2010). 用深穿透激光多普勒探头进行的血流测量显示，损伤前的血流相似，两组的灌注均减少90%编号1^细胞诱导缺血后立即与突变体和WT同窝出生(图2A和2B）。尽管对照组小鼠的血流在2周内恢复，但在编号1^细胞小鼠早在第3天就减少了，在第14天保持在控制水平的～50%，到第28天还没有完全恢复(图2A和2B）。

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图2

编号1^细胞后肢缺血模型中小鼠的血流恢复受损

（A和B）HLI模型中的血流测量。（A） 多普勒成像显示WT和编号1^细胞小鼠在HLI手术前后的指定时间点。（B） HLI手术后3天WT（黑条）和编号1^细胞小鼠（平均值±SEM，^*p<0.05）。

（C–F）HLI模型中动脉直径的Micro-CT分析。（C）WT和（D）的代表性micro-CT图像编号1^细胞HLI手术后14天。WT（黑条）和编号1^细胞HLI手术后14天，小鼠（白色条）。直径小于100μm的血管总数在编号1^细胞小鼠相对于大腿和小腿的WT窝友（平均值±SEM，^*p<0.05）。

另请参见图S3.

因为在这个模型中，动脉生成是负责血流恢复的关键过程(Chittenden等人。，2006)，我们使用mCT来可视化和量化动脉循环的范围(图2C和2D）。年，我们观察到膝盖上方和下方的小动脉和小动脉的密度和数量显著减少编号1^细胞与对照小鼠相比(图2E和2F）。这种差异不能用低联结蛋白水平来解释，我们之前在这个实验环境中已经证明了低联结素水平会损害动脉生成(Chittenden等人。，2006)WT和WT正常组织和缺血组织的as-western blot分析编号1^细胞小鼠表现出相似的合成蛋白表达(图S3A） ●●●●。

VEGF-A信号转导和ERK激活受损编号1^细胞老鼠

血管生成受损与VEGF-A对ERK信号的激活减少有关(Hong等人。，2006；拉纳汉等人。，2010). 事实上，对后肢缺血模型中形成侧支循环的免疫荧光分析表明，ERK在内皮细胞中的激活降低编号1^细胞与WT小鼠相比(图S3B、 白色箭头）。为了分析NRP1细胞质尾部对这一过程的贡献，我们首先比较了VEGF-A₁₆₅-诱导ERK激活编号1^细胞和体内对照小鼠。来自对照组和编号1^细胞与先前的观察结果一致，突变小鼠的心脏中Nrp1水平略有增加(Fantin等人。，2011). 注射1μg/kg VEGF-A₁₆₅腹腔注射导致Y区VEGFR2磷酸化快速上调¹¹⁷⁵在对照小鼠中参与激活PLCγ/ERK信号并伴有ERK1/2磷酸化增加的残基(图3A） ●●●●。令人惊讶的是，这两种对VEGF-A的反应₁₆₅在编号1^细胞心脏(图3A） ●●●●。

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图3

VEGF-A信号传导受损编号1^细胞老鼠

（A） 腹腔注射VEGF-A后心脏裂解物的Western blot分析。blot显示ERK和VEGFR2磷酸化降低编号1^细胞与WT室友相关的小鼠。

原发性动脉EC细胞裂解物的（B–D）Western blot分析编号1^细胞以及血清缺乏的WT EC，然后用50 ng/ml VEGF-A刺激指定时间₁₆₅（B）印迹显示Y1175上VEGFR2和ERK的磷酸化降低编号1^细胞相对于对照EC。（C）磷酸化VEGFFR2（pVEGFR2）相对于总VEGFR2（VEGFR2，^*p<0.05）。（D） 磷酸化ERK（pERK）与总ERK（ERK）之比的量化（平均值±SD，n=5，^*p<0.05）。

（E） 细胞裂解物的Western blot分析编号1^细胞和WT一级动脉EC，它们缺乏血清，并用50 ng/ml的FGF2或IGF1刺激指定时间。ERK磷酸化在编号1^细胞和WT EC。

另请参见图S4.

为了进一步了解NRP1胞质尾部缺失后ERK激活减少的分子机制，我们接下来检测了原发性动脉EC中VEGF-A的信号转导编号1^细胞和对照小鼠。在体内，NRP1水平在编号1^细胞EC与野生型EC相比，而VEGFR2在两种基因型的EC中的表达相似(图3B） ●●●●。与WT EC相比，编号1^细胞EC显示VEGFR2 Y1175位点的磷酸化显著降低(图3B和3C）。与此观察和我们的体内研究结果一致，ERK1/2磷酸化在突变的原发EC中也显著降低(图3B和3D）。

研究ERK激活减少是否与编号1^细胞EC对受损的VEGF-A信号具有特异性，或反映了更广泛的信号缺陷，我们检测了FGF2和IGF1治疗对原发性EC ERK信号的影响编号1^细胞和对照小鼠。两种生长因子在两种基因型的EC中均激活ERK(图3E） ●●●●。这些结果表明，内皮细胞ERK1/2信号受损编号1^细胞小鼠对VEGF-A具有特异性₁₆₅-诱导VEGFR2激活。

排除VEGFR2磷酸化受损只是反映NRP1亲和力降低^细胞对于VEGF-A₁₆₅，我们使用了一种已建立的方法来测试NRP1配体的结合，例如碱性磷酸酶共轭VEGF-A₁₆₅体内表达NRP1的轴突和血管(维埃拉等人。，2007). 通过该试验，我们观察到VEGF-A的类似结合₁₆₅表达NRP1但缺乏VEGFR2的轴突，以及与NRP1和VEGFR2共存的血管编号1^细胞鼠标和控件(图S4A） ●●●●。相反，VEGF-A₁₆₅未能与缺乏VEGFR2的轴突结合编号1^−/−大脑，如预期(图S4B） ●●●●。这些结果与之前的体外研究一致，这些研究使用Scatchard分析显示VEGF-a的相似亲和力₁₆₅对于全长NRP1和缺乏细胞质PDZ结合结构域的NRP1(Prahst等人。，2008).

定义VEGF-A是否受损₁₆₅输入信号编号1^细胞EC是由于缺乏PDZ结合域或NRP1细胞质尾部的另一部分，我们从NRP1转导了一级动脉EC^细胞携带对照腺病毒载体的小鼠(广告-无效的)或表达全长NRP1的载体(广告-编号1)，NRP1缺乏整个细胞质结构域(广告-编号1^细胞)或NRP1只缺少PDZ结合位点(广告-编号1^浦东新区). 作为NRP1^细胞表达水平在体外是可变的（但在体内不是可变的），我们选择了具有NRP1的细胞^细胞在上述各种突变体转导后与Nrp1水平最匹配的水平(图4A） ●●●●。尽管全长广告编号1构建恢复的VEGFR2 Y¹¹⁷⁵磷酸化和ERK激活以控制水平广告-编号1^细胞和广告-编号1^浦东新区是无效的(图4A和4B）。EC也获得了类似的结果编号1条件null(编号1^{飞行/飞行})用CRE表达载体转导的小鼠(广告-Cre公司)以消融NRP1表达，然后用广告编号1，广告编号1^细胞，或Ad-Nrp1型^浦东新区(图4C和4D）。因此，只有全长NRP1结构恢复了VEGF-A₁₆₅-突变细胞对WT水平的依赖性ERK激活(图4B和4D）。总之，这些发现确立了NRP1细胞质结构域中的PDZ结合区域对于VEGF-A激活正常VEGFR2和ERK至关重要₁₆₅在动脉内皮细胞中。

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图4

VEGF-A信号的救援编号1^细胞和编号1^{飞行/飞行}全长NRP1的原发性EC和NRP1 siRNA敲除组分活性ERK后的EC小管生成

（A和B）蛋白质印迹分析编号1^细胞用所示腺病毒构建物转导、血清饥饿并用50 ng/ml VEGF-A刺激的EC₁₆₅.Blots（A）和ERK活化定量（B）表明广告编号1，但不是广告编号1^细胞或广告编号1^浦东新区，恢复VEGF-A诱导的VEGFR2和ERK激活编号1^细胞EC（平均值±SD，n=3，^*p<0.05）。

（C和D）蛋白质印迹分析编号1^{飞行/飞行}用表达CRE重组酶的腺病毒构建物处理EC，使NRP1失活，并用所示腺病毒构建体转导EC，血清饥饿，用50 ng/ml VEGF-A刺激₁₆₅.斑点（C）和定量（D）表明广告编号1，但不是Ad-Nrp1型^细胞或广告编号1^浦东新区，恢复VEGFR2和ERK的激活（平均值±SD，n=3，^*p<0.05）。

用对照或NRP1 siRNA处理的（E和F）HUVEC用指示的腺病毒载体处理，以比较72小时后它们在3D胶原基质中进行试管形成的能力。72小时后小管生成的代表性图像（E）和量化图像（F）（平均值±SEM，n=18，^*p<0.05）。比例尺表示100 um。

链接ERK激活中的更改编号1^细胞对于观察到的动脉生成缺陷，我们使用了一种模拟体内动脉生成许多特征的人脐带内皮细胞（HUVEC）体外3D微管生成测定(Koh等人。，2008；斯特拉曼和戴维斯，2012年；Stratman等人。，2011). 在该模型中，用siRNA敲低NRP1可显著损害肾小管生成，而NRP1的表达却不受影响^浦东新区或NRP1^细胞构建，恢复小管生成(图4E和4F）。此外，NRP1存在时小管生成缺陷^细胞或NRP1^浦东新区可以通过组成活性（CA）ERK的共同表达来挽救(图4E和4F）。因此，恢复ERK激活足以恢复肾小管生成编号1^细胞欧盟委员会。

延迟贩运VEGFR2编号1^细胞内皮细胞

先前的研究表明，VEGFR2内吞减少或贩运延迟会降低其信号输出(拉纳汉等人。，2010). 因此，联凝集素的缺失延迟了VEGFR2向早期内体的转运，并降低了ERK信号传导(拉纳汉等人。，2010). 因为NRP1被提议参与VEGFR2贩运(Salikhova等人。，2008；西蒙斯，2012年；西蒙斯和艾希曼，2012年；Ballmer-Hofer等人。，2011)并通过其细胞质尾部结合结合蛋白(蔡和里德，1999年；Horowitz和Seerapu，2012年)，我们评估NRP1细胞质结构域是否对NRP1和VEGFR2在原发性动脉EC中的共输运至关重要。

生物素化NRP1的时程分析编号1^细胞和暴露于VEGF-A后的WT EC₁₆₅显示了NRP1摄取的可比程度和速率(图5A和5B）。两种基因型EC中生物素化VEGFR2摄取的程度和速率也相似(图5C和5D）。共聚焦显微镜显示，在VEGF-A之前₁₆₅刺激后，VEGFR2和NRP1在质膜上的分布相似(图S5A） NRP1的细胞内分布(图S5B） 两种基因型在EC中也相似。在控制和编号1^细胞EC、VEGF-A₁₆₅刺激导致VEGFR2和NRP1在EEA1+内体中积累(图5E） ●●●●。然而，定量分析表明，VEGFR2和NRP1在EEA1+内体中的共定位在编号1^细胞15分钟时EC与WT EC的比较(图5E–5G）和30分钟(图5F、 5G，和第5章C） 在VEGF-A之后₁₆₅刺激。

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图5

EAA1+内体中VEGFR2和NRP1的内化正常，但Colocalization减少编号1^细胞动脉EC

细胞表面生物素化和VEGF-A后NRP1和VEGFR2内化的（A-D）Western blot分析₁₆₅WT刺激和编号1^细胞EC.（A和B）印迹在指定时间显示内化。（C和D）量化VEGF-A后5、15和30分钟的NRP1和VEGFR2内化₁₆₅相对于时间0的刺激（平均值±SEM，n=4）。

（E–G）VEGFR2和NRP1在WT和编号1^细胞VEGF-A后的小鼠₁₆₅刺激。（E） 刺激15分钟后，免疫标记VEGFR2、NRP1和EEA1的EC共聚焦图像。比例尺代表9μm。VEGF-A后15分钟和30分钟EEA1阳性囊泡中VEGFR2（F）和NRP1（G）共定位的定量₁₆₅刺激表明含有VEGFR2的EEA1内体的数量显著减少编号1^细胞相对于WT EC（根据Manders得出的重叠系数，n=每个时间点和单元类型的10个独立字段，平均值±SEM，^*p<0.05）。

另请参见图S5.

VEGFR2和NRP1在小鼠EEA1+内体中的出现减少编号1^细胞VEGF-A刺激后的EC表明，复合物要么积聚在前一个隔室中（Rab5+分选内体），要么更快地向下游隔室移动（Rab7+和/或Rab11+内体）。为了区分这些可能性，我们比较了VEGF-A后10分钟外周定位Rab5+内体中VEGFR2和NRP1的共定位₁₆₅刺激后30分钟，Rab7+与Rab11+的内体。在10分钟时，VEGFR2/NRP1复合物在编号1^细胞与WT EC相比(图6A–6C），表明NRP1的清除速度较慢^细胞/将VEGFR2与从Rab5+到EAA1+内体的NRP1/VEGFR2复合物进行比较。尽管VEGFR2和NRP1在上游隔室中延迟出现，但在Rab7+内体中30分钟时VEGFR2与NRP1的水平相似(图6D–6F）。这些数据也与先前的观察结果一致，先前的观察结果表明，在没有NRP1细胞质尾部的情况下，VEGFR2从EAA1内体加速运输到Rab7+内体(Ballmer-Hofer等人。，2011). 最后，与NRP1相比，WT中Rab11+内体中VEGFR2和NRP1的水平更高^细胞电子计算机(图6G–6I），再次与Rab5隔间的贩运延迟相一致。

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图6

VEGFR2和NRP1受损贩运编号1^细胞动脉EC

（A–C）WT和编号1^细胞VEGF-A后10分钟，对小鼠进行VEGFR2、NRP1和Rab5的免疫标记₁₆₅刺激。共焦图像（A）（比例尺代表9μm）和量化（B）和（C）。根据Manders的重叠系数显示，含有VEGFR2和NRP1的Rab5+内体的数量在编号1^细胞相对于WT EC（n=每个时间点和细胞类型的10个独立字段，平均值±SEM，^*p<0.05）。

（D–F）WT和编号1^细胞在VEGF-A后30分钟，对小鼠进行VEGFR2、NRP1和Rab7免疫标记₁₆₅刺激。共焦图像（D）（比例尺代表7μm）和量化（E）和（F）。根据Manders的重叠系数显示，含有VEGFR2和NRP1的Rab7+内体的数量在编号1^细胞相对于WT EC，尽管这两种蛋白都在上游Rab5+室中积累编号1^细胞EC（n=每个时间点和细胞类型的10个独立字段，平均值±SEM）。

（G–I）WT和编号1^细胞在VEGF-A后30分钟，对小鼠进行VEGFR2、NRP1和Rab11免疫标记₁₆₅刺激。共焦图像（G）（比例尺代表12μm）和量化（H）和（I）。根据Manders的重叠系数显示，含有VEGFR2和NRP1的Rab11+内体的数量在编号1^细胞与WT EC相关，因为这两种蛋白质都在编号1^细胞EC（n=每个时间点和细胞类型的10个独立字段，平均值±SEM，^*p<0.05）。

另请参见图S6和第7部分.

研究NRP1和VEGFR2从Rab5+分选到EAA1+内体的延迟转运编号1^细胞EC代表了氯氰菊酯介导的内吞和转运的一般缺陷，我们研究了转铁蛋白受体作为通过氯氰菊酯途径内吞的典型膜蛋白(Sorkin，2004年). 我们在EEA1+内体中观察到类似量的转铁蛋白编号1^细胞和控制EC(图S6A和S6B）表明，在缺乏NRP1胞质尾部的EC中，氯氰菊酯介导的内吞的一般过程是正常的，并且从Rab5+到EAA1+内体的运输减少是VEGFR2/NRP1特有的^细胞复杂。

为了证明全长NRP1是有效VEGFR2贩运所必需的，并且NRP1在编号1^细胞EC对观察到的缺陷不负责，我们转导了突变体并用广告-编号1我们观察到VEGF-A后15分钟和30分钟₁₆₅刺激后，EEA1+内体中VEGFR2的比例显著高于广告编号1转导的编号1^细胞EC和类似于控制EC(图S7A和S7B）。这些实验表明，全长NRP1可以拯救有缺陷的VEGFR2贩运编号1^细胞欧盟委员会。

试剂和抗体

使用了以下试剂：来自人类血清的转铁蛋白、Alexa Fluor 488偶联物（Invitrogen T-13342）、人类纤维连接蛋白（BD Biosciences 356008）、VEGF-A₁₆₅（293-VE研发系统）、PTP siRNAs FlexiTube（R-PTP-mu[PTPRM]、DEP1、PTP1B、SHP1（PTPN6）；QIAGEN 1027416）、EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin（Pierce 21331）和固定化中性白细胞介素蛋白（Pierce29200）。抗体包括大鼠单克隆VEGFR2（Flk-1，克隆Avas12α1 Fitzgerald 10R-6549）、山羊多克隆NRP1（R&D Systems AF566）、山羊NRP1多克隆（Santa Cruz 7239）、山羊抗EEA1多克隆（圣克鲁斯6415）、兔多克隆抗EEA1（圣克鲁兹33585）、兔单克隆Rab5（细胞信号3547）、，兔单克隆Rab7（Cell Signaling 9367）、山羊多克隆抗VE-cadherin（Santa Cruz SC6458）、抗磷酸-VEGFR2（Tyr1175，Cell Signoaling 2478）、抗总VEGFR2（Cell Signaling 2479）、抗磷酸盐p44/42 MAP激酶（phospho-ERK，Cell signoaling 9106）、抗p44/42-MAP激酶，抗PTP1b（Upstate 07-088，BD 610139）、抗DEP-1/CD148（R&D AF1934）、抗PTPmu（Cell Signaling 4485）和抗SHP1（Cell-Signaling 3759）。我们使用了与辣根过氧化物酶（Vector Laboratories）结合或荧光标记（Life Technologies）的适当二级抗体。

Floxed的腺病毒拯救编号1和编号1^细胞内皮细胞

悬浮的编号1EC在明胶涂层的培养皿上生长到60%-70%的汇合处，并在含有20%FBS的培养基中用Cre腺病毒处理过夜，多重感染率为100。清洗过的细胞或编号1^细胞然后用对照CMV治疗EC，编号1^细胞，编号1^浦东新区或全长NRP1过夜，清洗，再生长2天，然后在0.5%FBS中饥饿过夜。用50 ng/ml VEGF-A刺激细胞5分钟₁₆₅并在NP40缓冲液中溶解。

内皮细胞的siRNA转染

EC在明胶包被的培养皿上生长至60-70%汇合，并用200 pmol/培养皿的siRNA（QIAGEN FlexiTube siRNA或Santa Cruz siRNA）在含有0.5%FBS和TransPass R2转染试剂siRNA悬浮液的2 ml生长培养基中连续2天处理4小时（新英格兰生物实验室）。然后将EC在含有0.5%FBS的培养基中饥饿过夜，用50 ng/mlVEGF-A刺激5分钟₁₆₅并在NP40缓冲液中溶解。

转铁蛋白和EEA1的染色

用0.5%FBS饥饿细胞过夜，置于冰上20分钟，用Alexa Fluor488结合转铁蛋白在冰上孵育30分钟，用冷PBS冲洗三次，然后用血清在37°C下刺激不同时间。在用pH 2.5的冰冷PBS冲洗两次后，在室温下将细胞在PBS中4%甲醛中固定10分钟，并在室温下用含有0.1%Triton X-100和0.1%NP-40的2.5%甲醛渗透10分钟。然后用兔抗EEA1标记细胞，然后用鸡抗兔Alexa 568抗体标记细胞。使用ProLong Gold DAPI（生命科技）安装样品，并使用UltraVIEW VoX旋转圆盘共焦显微镜和60×油浸透镜（Perkin Elmer）以及配备Ti-E显微镜架（Nikon）对样品进行成像。使用Volocity软件的共定位模块进行图像分析。

VEGFR2、NRP1和EEA1或Rab5、Rab7、Rab11和PTP1b的克隆化

细胞被镀在涂有明胶的玻璃底皿（MatTek）上，用0.5%的FBS饥饿过夜，然后放在冰上。用10μg/ml大鼠抗鼠VEGFR2和山羊抗鼠NRP1孵育细胞15分钟，用冷PBS冲洗三次。用50 ng/mlVEGF-A刺激细胞₁₆₅，在37°C下孵育不同时间，用pH 2.5的冷PBS清洗两次，用冷PBS冲洗三次，然后在室温下在PBS中4%的甲醛中固定10分钟，并在室温下用含有0.1%Triton X-100和0.1%NP-40的2.5%甲醛渗透10分钟。用兔抗EEA1标记细胞，然后用鸡抗兔Alexa647二级抗体标记细胞。为了检测VEGFR2和NRP1，用鸡抗鼠alexa488和驴抗羊alexa568二级抗体标记细胞。对于Rab5、Rab7和PTP1b共染，NRP1一级抗体标记为鸡抗羊alexa647，而Rab5或Rab7一级抗体则标记为抗兔alexa568，PTP1b标记为抗鼠alexa568。对于Rab11染色，在标记前使用Rab11-RFP腺病毒转染细胞。使用ProLong Gold DAPI安装样品，并使用配备60×油浸透镜和14位电子倍增电荷耦合器件相机（8μm像素大小；哈马松C9100-50）的Perkin Elmer UltraVIEW VoX旋转圆盘共焦显微镜进行成像。z堆栈图像的阈值是使用（NIH Bethesda）（Baler、Landini和Rasband）的ImageJ MultiThresholder插件提供的MaxEntropy自动阈值方法获得的。根据Manders，使用ImageJ共定位分析插件JACoP（Bolte&Cordelieres）计算重叠系数。

SIM显微镜

使用U-PLANAPO 60×/1.42 PSF、油浸物镜（奥林巴斯、中央山谷、宾夕法尼亚州）和CoolSNAP HQ获取图像²配备488、561和642 nm固态激光器（相干和MPB通信）的OMX版本3系统（Applied Precision）上像素尺寸为0.080μm的CCD摄像机（Photometrics，亚利桑那州图森市）。样品由通过衍射光栅的相干扰频激光光源照明，通过图像平面中的光阶干涉产生结构化照明，以创建3D正弦图案，横向条纹相距约0.270 nm。图案通过五个相位横向移动，每个z截面通过三个60°角旋转，间隔0.125 nm。曝光时间通常在200到500ms之间，并且调整每个激光器的功率以在16位动态范围的原始图像中以尽可能低的激光功率实现2000到4000计数的最佳强度，从而最小化光漂白。对原始图像进行处理和重建，以显示100–125 nm分辨率的结构(Gustafsson等人。，2008). 然后使用目标透镜和Softworx对准工具（应用精度）测量的预定偏移，在x、y和旋转方向上对准通道。

体外三维内皮管腔形成测定

如前所述，人脐带EC在2×10的三维胶原基质（2.5 mg/ml）中培养⁶/ml以评估其形成管腔和导管的能力(Koh等人。，2008). 在3天内用20 nM NRP1或对照siRNA处理EC两次，然后用表达LacZ对照、CA ERK、NRP1、NRP1^细胞或NRP1^浦东新区胶原蛋白凝胶含有200 ng/ml重组干细胞因子、白细胞介素-3、基质衍生因子1α和FGF-2(Stratman等人。，2011). 含有VEGF-A的培养基₁₆₅以及40 ng/ml的FGF-2和所述的减少血清补充剂II(Koh等人。，2008). 3天后，用戊二醛固定培养物，用甲苯胺蓝染色，并拍照。如前所述，通过使用Metamorph软件追踪每个区域的总管腔面积，从这些照片中量化EC管腔和导管面积(Koh等人。，2008).

整体贴装免疫标记

如前所述(Fantin等人。，2013)用4%甲醛将解剖的E12.5后脑组织固定在PBS中的冰上，清洗，用无血清蛋白块（Dako）孵育，并用山羊抗大鼠NRP1、山羊抗VEGFR2（R&D Systems AF566，AF644）或兔抗神经丝（Millipore AB1981）免疫标记，然后用Alexa488-共轭山羊抗兔IgG（分子探针）标记和Cy3-共轭兔抗羊Fab片段（Jackson Immuno.）。使用LSM710激光扫描共焦显微镜（蔡司）对样品进行成像。

碱性磷酸酶融合蛋白结合试验

如前所述(Fantin等人。，2013)，碱性磷酸酶（AP）-血管内皮生长因子₁₆₅融合蛋白与新鲜切割的E12.5后脑组织孵育，用PBS洗涤三次，每次20分钟，用4%甲醛在PBS中固定1小时，然后再次洗涤。将内源性AP在65°C下热灭活3小时。在含有100 mM Tris pH 9.5、100 mM NaCl和5 mM MgCl的缓冲液中与硝基蓝四氮唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（Roche）孵育后，检测到组织结合的、热稳定的重组AP活性为不溶性反应产物₂。使用配备Micropublisher 3.3摄像头（Q Imaging）的MZ16显微镜（徕卡）记录图像。

我们感谢昆滕·施瓦兹（Quenten Schwarz）和劳拉·丹蒂（Laura Denti）创造了本研究中使用的小鼠，并感谢詹姆斯·班布里奇（James Bainbridge）和克莱门斯·兰格（Clemens Lange）对氧诱导视网膜病变模型的帮助。我们感谢丽塔·韦伯（Rita Webber）和妮可·科普兰（Nicole Copeland）维持了这些研究中使用的小鼠。这项工作得到了国家卫生研究院对M.S.的拨款（HL62289）和对C.R.的威康信托初级研究员奖（095623/Z/11/Z）的支持。