FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice

doi:10.1172/JCI44762

.2011年7月；121(7):2668-78.

doi:10.1172/JCI44762。

FGF依赖性调节小鼠VEGF受体2的表达

村上雅弘¹, T Nguyen地点, Kunihiko Hatanaka公司, 威廉·沙克特尔, 陈培余, 郑维庄, 布莱恩·布莱克, 迈克尔·西蒙斯

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FGF依赖性调节小鼠VEGF受体2的表达

村上雅弘等。临床研究杂志. 2011年7月.

.2011年7月；121(7):2668-78.

doi:10.11172/JCI44762。

作者

村上雅弘¹, T Nguyen地点, Kunihiko Hatanaka公司, 威廉·沙切特尔, 陈培余, 郑维庄, 布莱恩·布莱克, 迈克尔·西蒙斯

附属

¹美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院内科心血管科。

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摘要

许多研究表明血管生成性FGF和VEGF信号通路之间存在联系；然而，这种联系的性质尚未确定。为了评估这种关系，我们在体外和体内研究了内皮细胞中VEGF的信号转导，以及FGF信号转导的中断。缺乏FGF信号的内皮细胞对VEGF无反应，这是由于VEGF受体2（VEGFR2）的表达在VEGFR2增强子激活减少后下调所致。FGF通过激活Erk1/2介导VEGFR2表达。转录分析显示，Ets转录因子以FGF-和Erk1/2依赖的方式控制VEGFR2的表达。FGF信号缺陷的小鼠表现出血管完整性丧失和血管形态发生减少。因此，需要对内皮细胞进行基础FGF刺激，以维持VEGFR2的表达和对VEGF刺激的反应能力，并解释FGF和VEGF对血管形成的分级控制。

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数字

**图1。FGF对VEGF信号和VEGFR2表达的调节。**
(A类)用Ad-GFP或Ad-FGFR1DN转导并用FGF1（50 ng/ml）或VEGF-A（80 ng/ml）刺激5分钟的BAEC总细胞裂解物的Western blot。控制；p-，磷酸化；t-，总计。(B类)细胞cGMP水平的定量分析(n个= 3). (C)BAEC总RNA定量RT-PCR分析。*素食者2*用实时PCR测定mRNA水平，并将其归一化为*Gapdh公司*表达式。值表示相对于未处理BAEC的丰度（分配为1）。(天)在正常生长介质中用不同浓度的U0126处理BAEC 6小时后，分离出的总细胞裂解物的Western blotting。(E类)VEGFR2水平的定量分析。(F类)BAEC首先用Ad-Null或Ad-FGFR1DN转导，然后第二天用Ad-ME或Ad-ME-LA转导。对VEGFR2的表达进行定量PCR分析(n个= 3). (**G公司**)总细胞裂解物的Western blotting显示Ad-FGFR1DN转基因细胞经Ad-ME-LA处理后VEGFR2水平增加。用HA抗体检测ME-LA和FGFR1DN（分别为灰色和黑色箭头）**P（P）*< 0.05, ***P（P）*与各自的对照组相比，<0.01。

**图2。FGF信号控制VEGFR2增强子活性和其他内皮基因的表达。**
(A类)BAEC首先用Ad-Null或Ad-FGFR1DN转染，然后用Ad-ME-LA转染，并用含有*素食者2*第一内含子增强子和最小启动子。(B类)使用转染Ad-Null或Ad-FGFR1DN并转染WT的BAEC进行荧光素酶报告试验*素食者2*携带Ets结合位点突变的增强子或最小启动子结构（Pea3，G56T_G57T；Ets1，G303T_G304T；FOX:Ets，C378A_C379A）。(C)FOX突变导致增强子活性降低：ETS位点未被组成活性Erk2挽救。(天)对BAEC中与VEGFR2增强子结合的Ets1和Etv2进行ChIP分析（未转染或转染Myc-tagged-Etv2）。输入DNA，样本代表总输入染色质（1%）。(E类–**H（H）**)定量RT-PCR分析从用Ad-Null或Ad-FGFR1DN转导的BAEC中分离的总RNA。值表示相对于Ad-Null（赋值为1）的丰度。(我–**L（左）**)定量RT-PCR分析从用Ad-ME或Ad-ME-LA转导的BAEC中分离的总RNA**P（P）*<0.05与各自的对照或括号所示，学生的t吨测试。

**图3。FGF信号控制VEGF诱导的血管生成。**
(A类和B类)定量实时PCR分析*素食者2*(A类)和*素食者1*(B类)内收肌mRNA表达。从注射Ad-Null或Ad-sFGFR1-IIIc（5×10）的C57BL/6小鼠肌肉组织中分离出总RNA¹⁰病毒颗粒）注射Ad 7天后收获(n个=每组3人）。(C)插塞植入前7天，将Matrigel塞与FGF2或VEGF-A混合放置在注射Ad-Null或Ad-sFGFR1-IIIc的C57BL/6小鼠皮下。(天)Matrigel塞试验的定量分析。对Matrigel塞切片进行CD31染色，并计算血管数量(n个=每组3人）。(E类)在小鼠体内注射之前，将Ad–Flag-VEGFR2与Matrigel混合，并使用抗Flag抗体对Matrige1的切片进行外源性VEGFR2表达的免疫组织化学评估。比例尺：20μm。(F类)体内Matrigel塞试验的定量分析(n个=每组3人）。(**G公司**)体内基质胶塞测定的定量分析(n个=每组3人）。接受补充了VEGF-A和Ad–ME-LA的Matrigel的小鼠显示，在缺乏FGF信号的情况下，血管形成增加**P（P）*<0.05与相应对照或括号中所示。

**图4。Ad-sFGFR1-IIIc转基因小鼠的缺血后新生血管受损。**
(A类)后肢灌注的激光多普勒分析。Ad-Null、Ad–sFGFR1-IIIc或Ad–s FGFR3-IIIb（5×10¹⁰在诱导后肢缺血前7天注射病毒颗粒(n个=每组6人）。灌注变化显示为右后肢与左后肢的比率（R/L）。数据（平均值±SEM）由Student’st吨测试。(B类)股动脉结扎21天后，以16μm分辨率对小鼠后肢小腿部分进行显微CT重建。比例尺：273μm×52μm。(C)小牛显微CT图像的定量分析，表示为250个血管结构的总数*z（z）*轴切片(n个=每组4人）。数据为平均值±SEM(天)SDF-1α在缺血区小动脉中的表达。在对照组和Ad–sFGFR1-IIIc转基因小鼠中诱导后肢缺血；48小时后，采集缺血和非缺血腿的腓肠肌，并对SDF-1α和α-SMA进行免疫染色。比例尺：20μm。(E类)定量实时PCR分析*素食者2*缺血诱导7天后注射Ad-Null或Ad-sFGFR1-IIIc的C57BL/6小鼠肌肉组织总RNA的表达(n个=每组3人）**P（P）*< 0.05, ***P（P）*与Ad-Null相比<0.01。

**图5。内皮细胞FGF信号缺失会损害缺血后组织恢复和动脉生成。**
(A类)FGFR1DN小鼠的组织丢失。诱导FGFR1DN表达后，结扎对照组和FGFR1DN小鼠的右股动脉，造成后肢缺血。在诱导缺血7天后拍摄照片。(B类)第7天的组织损失得分（0，健康；1，黑指甲；2，黑脚趾；3，脚趾损失；4，足部损失）。数据通过Wilcoxon秩和检验进行分析(n个=20[对照]；14[FGFR1DN]；12[Ad–sFGFR1 IIIc和Ad–sFGFR3 IIIb]）。方框表示四分位范围；方框内的线表示中值；方框内的符号表示平均值；胡须表示第5百分位和第95百分位；条形表示最小值和最大值。(C)FGFR1DN小鼠缺血肌肉中的细胞凋亡。缺血诱导3天后，取腓肠肌进行TUNEL染色。凋亡细胞核（绿色）广泛分布于FGFR1DN小鼠的肌肉细胞中。比例尺：20μm。(天)TUNEL百分比⁺与DAPI相关的凋亡细胞⁺单元格(n个=每组3人）。(E类)小鼠后肢缺血后灌注的激光多普勒分析。灌注变化以右后肢与左后肢的比率表示(n个=每组5人）。数据为平均值±SEM(F类)股动脉结扎21天后，以16μm分辨率对小鼠后肢小腿和大腿部分进行显微CT重建。比例尺：332μm×96μm。(**G公司**)小牛显微CT图像的定量分析，表示为250个血管结构的总数*z（z）*轴切片(n个=每组3人）。数据为平均值±SEM**P（P）*< 0.05, ***P（P）*与相应的对照组相比<0.01。

**图6。内皮细胞FGF信号缺失会损害血管完整性。**
(A类)股动脉结扎3天后动脉血管的显微CT图像。箭头表示造影剂泄漏。比例尺：332μm×96μm。(B类)FGFR1DN小鼠缺血大腿的血管渗漏。诱导后肢缺血3天后，将FITC-右旋糖酐（2 mDa）注入颈动脉，并用荧光立体显微镜观察。箭头表示右旋糖酐外渗的部位；箭头表示股动脉的一级分支。(C)血管通透性的定量分析。后肢缺血3天后静脉注射Evans蓝色染料。然后用生理盐水灌注小鼠，取收肌下部进行定量(n个=每组3人）。(天)定量实时PCR分析*素食2*后肢缺血7天后从对照组或FGFR1DN小鼠缺血肌肉中分离的总RNA表达(n个=每组3人）**P（P）*与对照组相比<0.05。(E类)FGF-VEGFR2相互作用。FGF信号激活的Erk1/2转位到细胞核，并促进Ets与第一内含子增强子中FOX:Ets复合位点的结合*素食者2*这导致VEGFR2转录和表达增加。在缺乏基础FGF信号的情况下，VEGFR2表达下调，因此血管生成活性降低。

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