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美国国立卫生研究院： 美国国立卫生研究院197098
血管内皮生长因子受体2内吞运输调节动脉形态发生 ， 1 ， 2 ， 2 ， 三 ， 1 ， 1 ， 2 和 1, 4
安东尼·拉纳汉 1 康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院内科心血管科，邮编06520
卡连·赫尔曼斯 2 Vesalius研究中心，VIB Vlams Instituut voor Biotechnologie，3000 Leuven，比利时
菲利普·克莱斯 2 比利时鲁汶3000 VIB-Vlaams Instituut voor Biotechnologie Vesalius研究中心
乔安娜·S·凯利-哈密尔顿 三 新罕布什尔州黎巴嫩达特茅斯医学院医学部心脏科，邮编03756
郑维庄 1 康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院内科心血管科，邮编06520
弗兰克·J·佐丹奴 1 康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院内科心血管科，邮编06520
皮特·卡梅里特 2 比利时鲁汶3000 VIB-Vlaams Instituut voor Biotechnologie Vesalius研究中心
迈克尔·西蒙斯 1 康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院内科心血管科，邮编06520
4 耶鲁大学医学院细胞生物学系，康涅狄格州纽黑文06520
1 康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院内科心血管科，邮编06520
2 比利时鲁汶3000 VIB-Vlaams Instituut voor Biotechnologie Vesalius研究中心
三 新罕布什尔州黎巴嫩达特茅斯医学院医学部心脏科，邮编03756
4 耶鲁大学医学院细胞生物学系，康涅狄格州纽黑文06520
补充资料 1
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摘要 VEGF是调节动脉形态发生的关键生长因子。 然而，这一过程中涉及的分子事件尚未阐明。 协同素缺失小鼠显示VEGF信号受损，动脉形态发生显著减少。 这里我们表明，这是由于含有VEGFR2的内体的延迟运输，使内化的VEGFR2在Y细胞上受到PTP1b的选择性去磷酸化作用 1175 现场。 协同素参与VEGFR2细胞内转运需要肌球蛋白-VI和肌球蛋白VI在小鼠中敲除或在斑马鱼表型中敲除协同素无效表型。 沉默PTP1b可恢复VEGFR2的激活，并显著恢复肌球蛋白-VI的动脉形态发生 −/− 击倒斑马鱼和合成蛋白 −/− 老鼠。 我们得出结论，激活VEGF介导的动脉形态发生级联需要VEGFR2 Y的磷酸化 1175 依赖于内化VEGFR2通过连接蛋白-肌球蛋白-VI复合物从质膜上转移的位点。 VEGF信号传导中的这一关键事件发生在细胞内位点，并由一种新的内体运输依赖过程调节。
简介 血管内皮生长因子（VEGF）在发育和成年生物体内的动脉形态发生中起着关键作用。 虽然VEGF-R1（Flt-1）、VEGFR2（Flk-1）和神经纤维蛋白-1这三种受体与VEGF-A结合，但VEGFR2信号被认为对血管形成至关重要。 尤其是Y的磷酸化 1175 在VEGFR2细胞质域中，用携带单个Y1175F突变的VEGFR2构建物替换VEGFR2基因是一个关键事件，导致血管生成失败和胚胎死亡( 樱井等人，2005年 ). 因此，VEGF依赖性VEGFR2激活和随后的信号传导所涉及的事件序列被认为包括生长因子与其质膜上酪氨酸激酶受体结合的常规步骤，然后是受体二聚化、激活和组装膜近端信号复合体。
之前我们已经描述了联结蛋白的缺失( gipc1号机组 )是一种单一的PDZ域支架蛋白，导致动脉形态发生和分支减少 −/− 内皮细胞对VEGF刺激的敏感性降低( Chittenden等人，2006年 ). Synectin是一种广泛表达的蛋白质，由多个实验室同时分离，作为RGS-GAIP的结合伴侣( De Vries等人，1998年 )，神经磷脂-1( 蔡和里德，1999年 )，语义素-4C( Wang等人，1999年 )和syndecan-4( Gao等人，2000年 )除其他外。 其功能尚不清楚，但可以控制细胞迁移( Gao等人，2000年 ； Tkachenko等人，2006年 )，细胞内贩运( Dance等人，2004年 )和细胞粘附( Lanahan等人，2006年 ). 最近的研究表明，细胞内转运和内吞似乎是联结蛋白功能的特别重要方面( Valdembri等人，2009年 ； Varsano等人，2006年 )
特别令人感兴趣的是联结蛋白与肌球蛋白VI的结合，肌球蛋白-VI是一种参与内体运输的逆行运动( Naccache等人，2006年 )这表明，对新内化受体的贩运依赖于联结蛋白-肌球蛋白-VI的调节可能会潜在地调节其信号传导。 虽然VEGFR2可能存在细胞内信号转导位点( Lampugani等人，2006年 )，控制来自内体的VEGFR2信号传导的分子事件尚不清楚。
由于动脉形态发生与VEGF有关，我们详细研究了VEGF刺激联凝集素后的各种事件 −/− 内皮细胞。 我们发现，当VEGF-A与VEGFR2结合时 165 并且随后细胞对VEGF-VEGFR2复合物的摄取正常进行，VEGFR2未能进入早期的内胚体室，仍然靠近质膜。 内化VEGFR2从质膜的转运需要形成连接蛋白-肌球蛋白-VI复合物，并破坏肌球蛋白V I表达表型-连接蛋白缺失。 异常的VEGFR2转运导致关键Y的磷酸化降低 1775 并通过PLCγ/MAPK和PI3-激酶/Akt途径减少下游信号的激活。 这反过来是由于小细胞内酪氨酸磷酸酶PTP1b的活性导致的，因为PTP1b表达的抑制恢复了该系统中的VEGF信号。
因此，通过将含有VEGFR2的内体从富含PTP1b的细胞膜环境中移开，VEGFR2依赖于连接蛋白-肌球蛋白-VI的转运在调节动脉形态发生中起着关键作用。
结果 合成素中VEGF刺激导致VEGFR2激活受损 −/− 动脉内皮细胞 我们之前已经证明了联凝集素 −/− 动脉内皮细胞（AEC）对VEGF刺激的反应性降低( Chittenden等人，2006年 ； Prahst等人，2008年 ). 为了进一步详细说明这一观察结果并确定潜在原因，我们检测了合子中VEGF的信号反应和VEGFR2的激活 −/− 和野生型AEC。
血管内皮生长因子对合成素的刺激 −/− AEC导致关键下游信号传导效应的激活减少，包括Akt和p42/44 MAPK（ERK-1/2）的激活( ). 为了探讨这一发现的原因，我们首先检测了来自联结蛋白的AEC中VEGF受体R1和R2的总表达和细胞表面表达 −/− 和室友合成素 +/+ 老鼠。 总细胞裂解物的Western印迹显示受体表达无显著差异( )或细胞表面生物素化蛋白( ).
协同素中的VEGF-A信号转导 −/− 原代内皮细胞 （A、B） ERK激活 A： 从联凝集素中分离的总细胞裂解物的蛋白质印迹 +/+ 和 −/− 内皮细胞。 按照50ng/ml VEGF-A指示的时间刺激汇合的、血清饥饿的细胞。合成素中p44/42 MAP激酶对VEGF-A-的反应磷酸化降低 −/− 与联结蛋白相关的细胞 +/+ 细胞。 B： 4个独立实验中ERK激活的定量（平均值±标准偏差，*P<0.05）
（C、D） VEGF受体表达 .合成蛋白中VEGFR1和VEGFR2的表达 +/+ 和 −/− 澳大利亚大学城。 C： 细胞表面生物素化和用中性亲和素珠沉淀200ug蛋白裂解物后，对总细胞裂解物进行蛋白质印迹。 注意到联凝集素中VEGFR-1和2的细胞表面水平相当 +/+ 和 −/− 内皮细胞。 D： 用中性亲和素珠沉淀200 ug蛋白裂解物后，用VEGFR2抗体对生物素化细胞提取物进行蛋白质印迹。 右侧面板代表VEGFR-2非特异性沉淀的对照，并表明在没有生物素化的情况下，VEGFR2不会沉淀。
（E、F、G） VEGFR2激活 ：VEGF-A激活VEGFR2 Y 1175 但不是Y 1054/1059 联凝集素减少 −/− AEC：合成素总细胞裂解物的蛋白质印迹 +/+ 和 −/− 血清饥饿和50ng/ml VEGF-A刺激后的AEC −/− 澳大利亚大学城。 G： VEGFR2 Y的定量分析 1175 基于4个独立实验的位点磷酸化。 （平均值±标准偏差，*P<0.05）（H） 可编程逻辑控制器 γ 激活 ：VEGF-A激活合成素中的PLCγ −/− AEC：从合成素中分离的总细胞裂解物的Western blotting +/+ 和 −/− 血清饥饿和50ng/ml VEGF-A刺激后的AEC −/− 澳大利亚大学城。 G： VEGFR2 Y的定量分析 1175 基于4个独立实验的位点磷酸化。 （平均值±标准偏差，*P<0.05）
（H） 可编程逻辑控制器 γ 激活 ：VEGF-A激活合成素中的PLCγ −/− AEC：从合成素中分离的总细胞裂解物的Western blotting +/+ 和 −/− 血清饥饿和50ng/ml VEGF-A刺激后的AEC。注意合成素中酪氨酸783上PLCγ1的磷酸化降低 −/− 澳大利亚大学城。 另请参见 图S1 .
（I） 钙助熔剂 ：VEGF-A诱导的联凝集素中的钙水平 −/− AEC：结合蛋白中的钙通量 +/+ 和 −/− 隔夜饥饿后，在VEGF-A（250ng/ml）刺激后，在加载5uM Indo-1-AM的细胞中测量AEC。 注意合成素中钙通量减少 −/− 澳大利亚大学城。 （平均值±标准偏差，*P<0.05）。 另请参见 补充资料 .
由于关键酪氨酸残基上的VEGFR2磷酸化对VEGF信号的激活是必要的，我们接下来检查了Y 1054 （一般VEGFR2激活的标志物）和Y 1175 （PLCγ/MAPK和PI3K激活位点）。 Y没有显著变化 1054 磷酸化表明VEGFR2自身正在二聚化和磷酸化( ). 然而，Y值明显下降 1175 磷酸化，对应于观察到的p42/44 MAPK和Akt活化降低( ).
为了进一步证实VEGFR2磷酸化的这些变化，我们检测了额外的下游信号事件。 尤其是Y的磷酸化降低 1175 可以预期会导致PLCγ的激活降低，从而导致细胞内钙升高的降低。 事实上，Western blotting显示PLCγ磷酸化降低( 和 图S1A 和 补充信息 )和减少VEGF诱导的Ca 2+ 通量，通量( ).
肌球蛋白VI是一种联结蛋白结合伙伴，参与调节VEGFR2的激活 接下来，我们试图确定负责调节VEGFR2活性的联凝集素结合伴侣。 由于联蛋白结合神经纤维蛋白，联蛋白阴性内皮细胞中的神经纤维蛋白信号受损( Prahst等人，2008年 )，这种相互作用的缺乏可能是联结蛋白中VEGFR2活性降低的原因 −/− 澳大利亚大学城。 为了评估这种可能性，我们检测了VEGF-D治疗后ERK1/2的激活，VEGF-D-是VEGF家族的一个成员，通过VEGFR2以非依赖神经胶质的方式发出信号。 与VEGF-A类似，VEGF-D处理导致合成素中p42/44 MAPK和Akt的活化降低 −/− 澳大利亚大学城( 图S1B )表明合子中有缺陷的VEGFR2信号 −/− AEC不能用神经纤毛-1-联凝集素相互作用的缺乏来解释。
协同素可以通过其PDZ结构域结合其他细胞质蛋白，也可以结合肌球蛋白VI −/− 用携带全长野生型连接蛋白cDNA（Ad-Syn）的腺病毒构建物转导AEC，该连接蛋白构建物具有突变的PDZ结构域（Ad-Ssyn-PDZ） − )或删除肌球蛋白-VI结合域（Ad-Syn-MVI − ). 合成素转导 −/− 带有Ad-Syn病毒的AEC已完全恢复Y 1175 VEGF的位点磷酸化和Erk-1/2激活( ). 另一方面，用Ad-Syn或PDZ进行转导 − ( )或Ad-Syn-MVI − ( )构造没有恢复Erk-1/2激活或Y 1175 磷酸化。
连接蛋白在VEGF信号转导中的作用 （A–C） 协同素对联合素中VEGF信号转导的拯救作用 −/− 澳大利亚大学城 ：协同素 −/− 用含有GFP、全长联结蛋白（Ad-Syn，面板A）、带有突变PDZ结构域（Ad-Ssyn-PDZ）的联结蛋白的腺病毒转导AEC − （B组）或与突变肌球蛋白-VI结合位点（Ad-Syn-MVI-，C组）结合2天，饥饿，并用50ng/ml VEGF-a刺激。用pErk（Thr 202 /提尔 204 )和pVEGFR-2（酪氨酸 1175 )显示Ad-Syn而非Ad-Syn-PDZ的表达 − 或Ad-Syn-MVI − 恢复合成素中VEGFR2和ERK的VEGF激活 −/− 澳大利亚大学城。
肌球蛋白-VI中p44/42 MAP激酶和VEGFR2的（D–F）VEGF-A激活降低 −/− 澳大利亚大学城： 肌球蛋白VI总细胞裂解物的蛋白质印迹 +/+ 和 −/− 澳大利亚大学城。 用50ng/ml VEGF-A和ERK1/2和VEGF-R2 Y的磷酸化刺激融合的血清饥饿细胞 1175 然后确定。 注意到这两种蛋白质的活性降低。 ERK激活（E）和VEGFR2 Y的定量 1175 （F） 在4个独立实验的基础上进行。 （平均值±标准偏差，*P<0.05）
为了证实肌球蛋白VI确实参与了VEGF信号的调节，我们检测了肌球蛋白-VI中VEGF依赖的内皮细胞反应 −/− 澳大利亚大学城。 在用VEGF-A治疗后，我们观察到Erk-1/2活化降低( )减少VEGFR2 Y的磷酸化 1175 场地( )肌球蛋白-VI −/− 与肌球蛋白-VI相比 +/+ 澳大利亚大学城。
肌球蛋白-VI-连接蛋白复合物调节VEGFR2内吞 然后，我们探讨了肌球蛋白-VI依赖性调节VEGF信号的机制。 由于联结蛋白和肌球蛋白VI都参与胞内小泡的细胞内转运，我们研究了VEGFR2胞内转运的改变是否可能是联结蛋白中观察到的VEGF信号异常的原因 −/− 和肌球蛋白-VI −/− 澳大利亚大学城。
合成蛋白上的细胞表面VEGFR2 −/− ，肌球蛋白-VI −/− 和对照AEC用生物素标记，然后将细胞暴露于VEGF-A 165 在固定的时间间隔制备细胞裂解物，并通过Western blotting测定内化VEGFR2的量( ). 在联结蛋白和肌球蛋白-VI无效的AEC与正常AEC之间，VEGFR2内化没有显著差异，表明这两种蛋白都不参与受体内化。 联合凝集素中VEGF刺激后细胞表面VEGFR2摄取的FACS分析 −/− 和 +/+ AEC证实了这些观察结果( 图S2 和 补充信息 ).
VEGFR-2贩运协同素 −/− 和肌球蛋白VI −/− 原代内皮细胞 （A） 连接蛋白和肌球蛋白-VI中的VEGFR-2内化类似 +/+ 和 −/− 内皮细胞 : 将汇合后的血清饥饿细胞用生物素进行表面标记，并用VEGF-A刺激。剥离剩余的细胞表面生物素后，用中性亲和素珠沉淀细胞裂解物，并用Western blot检测VEGFR2，以确定内化的VEGFR2。 另请参见 图S2 .
（B–D） VEGFR2贩运 ：缺乏血清的合成蛋白 +/+ 和 −/− 或肌球蛋白-VI- +/+ 和 −/− 用VEGF-A处理标记有抗VEGFR2（绿色）的AEC细胞5-30min。 然后固定，渗透，用抗EEA1标记（红色），并用免疫荧光显微镜观察。 显示了合成蛋白在不同时间点VEGFR2/EEA1共定位的量化 +/+ 和 −/− 面板C和肌球蛋白-VI中的AEC +/+ 和 −/− 面板D中的AEC（平均值±标准偏差，*P<0.05）
（E） 含VEGFR-2的小泡在连接蛋白中的运动 −/− 澳大利亚大学城： 用VEGF-A处理标记有抗VEGFR-2的血清饥饿细胞，并用延时显微镜追踪标记的囊泡。 每隔30秒采集一次图像，持续30分钟，并使用图像J测定囊泡的平均速度和增量（平均值±标准偏差，*P<0.05）。 塞雷也 图S3
接下来，我们使用宽视野显微镜检查了含VEGFR2内体的转运。 在VEGF刺激野生型AEC五分钟后，VEGFR2很容易被检测到，与EEA1存在所定义的最早内吞体群体相关，到15分钟时，在该内吞体室中检测到超过50%的内吞受体( ). 值得注意的是，VEGFR2与两种结合蛋白中EEA1阳性内体的关联明显延迟 −/− ( )和肌球蛋白-VI −/− ( )AEC表明，联结蛋白或肌球蛋白VI的缺失干扰了含有VEGFR2的早期内体的运输。
为了研究含VEGFR2的内体与EEA1内体延迟关联的原因，我们使用活细胞成像评估了VEGFR2囊泡的运动性。 VEGF治疗后，粘连蛋白中含VEGFR2内体的运动速度和平均步长显著降低 −/− 澳大利亚大学城( )和肌球蛋白-VI −/− AEC（未显示）与之前在肌球蛋白-VI阴性细胞中观察到的减少一致( Aschenbrenner等人，2004年 )
为了进一步探讨VEGFR2内吞转运如何影响其信号传导，我们敲除了两个Rab GTPase，它们要么负责晚期内胚体再循环到质膜（Rab11），要么负责内胚体向AEC溶酶体（Rab7）的移动。 在这两种情况下，VEGF诱导的P-ERK激活显著增加( )与含VEGFR2复合物在细胞质中停留较长时间的假设一致。 同时，我们还观察到VEGFR2内体与Rab7或Rab11阳性间隔的相关性降低( )在合成酶中 −/− AEC公司。
Rab7/Rab11 GTPases在VEGFR2信号转导中的作用 （A、B） VEGFR-2与内体标记物的共扩增： 血清饥饿的合成素 +/+ 和 −/− AEC用抗VEGFR-2（绿色）标记，然后用VEGF-A处理30分钟，固定、渗透并用抗Rab11（红色，A组）或抗Rab7（红色，B组）标记，并进行共聚焦显微镜检查。
（C） VEGFR-2与Rab11和Rab7的共定域作用在联合蛋白缺失细胞中延迟：使用Image J的共定位插件在至少10个独立的区域中对VEGFR2与Rab7和Rab11的共定位进行定量分析。 （平均值±标准偏差，*P<0.05）
（D） 用siRNA敲低Rab7、Rab11导致VEGF-A延长p44/42 MAP激酶的激活：协同素 +/+ 用抗Rab7或Rab11 siRNAs转染内皮细胞，48小时后，隔夜饥饿，用50ng/ml VEGF-A刺激。用pERK对总细胞裂解物进行Western blotting，显示Rab7和Rab11敲除后活性增加。
肌球蛋白-VI敲除对斑马鱼和小鼠动脉形态发生的影响 为了证明联结蛋白/肌球蛋白-VI轴在VEGF信号传导中起关键作用，我们评估了斑马鱼和小鼠中肌球蛋白V I表达降低的效果，并将其与之前描述的联结蛋白表型进行了比较。 已在斑马鱼中鉴定出哺乳动物肌球蛋白VI的两种共节理，其表达模式已在之前描述过( Kappler等人，2004年 ； Seiler等人，2004年 ). 肌球蛋白VIb( 肌6b )只在内耳和侧线器官的毛细胞中表达，而肌球蛋白VIa( 肌6α )在受精后1至5天，斑马鱼胚胎的头部和躯干中分布更广。 一座完整的山 就地 斑马鱼杂交 肌6α 受精后28小时的反义或正义核糖探针（hpf）分析证实了先前报道的myo6a在神经管和体节中的普遍表达( ). 此外，背主动脉和后主静脉表达myo6a( )，类似于斑马鱼胚胎中的连接蛋白表达( Chittenden等人，2006年 ).
Myo6aKD对斑马鱼动脉发育的影响； Mysosin VI基因干扰对小鼠的功能影响 （A，B）通过28 hpf斑马鱼胚胎躯干的横截面，全山染色 就地 使用myo6a特异性反义（a）或义（B）核糖探针进行杂交。 Myo6a在神经管（NT）、体节（S）、背主动脉（黑箭头）和后主静脉（白箭头）均有表达。 观察到的表达模式是特定的，因为使用感测探针杂交时未观察到信号。 （C，D）16 hpf的背面视图 Tg（fli1:EGFP） y1个 胚胎，头在上面。 对照组胚胎（C）GFP+成血管细胞从侧板中胚层以有序的前后向拉链样模式向中线迁移，并在那里组装成原始轴向血管。 相反，在myo6a中 杜兰特 胚胎（D）一部分成血管细胞（箭头）沿着其侧内侧运动停滞，其他的未能保持其正确的定型轨迹，导致明显的混乱迁移模式。 （E，F）穿过树干的横截面 Tg（fli1:EGFP） y1个 30 hpf的胚胎，使用抗GFP抗体（绿色）进行整体免疫染色，并用DAPI（蓝色）进行复染； 头朝上。 与对照胚胎（E， E类 '），myo6a 杜兰特 胚胎的背主动脉（箭头）明显变薄，管腔明显缩小，而后主静脉（箭头）未受影响（F，F'）。 E’和F’分别是图E和F中轴向血管的放大倍数。 ( G、 H（H） )树干部分的侧视图 Tg（fli1:EGFP） y1个 40hpf胚胎； 向左转。 对照组胚胎( G公司 )ISV从腹侧体节边界附近的背主动脉两侧萌芽，向上到达神经管的侧背顶，在那里分裂、拉长并融合形成DLAV。 然而，在myo6a中 杜兰特 胚胎( 小时 )ISV通常由纤细的内皮细胞（箭头）组成，和/或沿其背部轨迹停滞（箭头），从而损害DLAV的正常形成（星体）。 比例尺表示面板A、B、E–F’中的10μm，面板C、D、G、H中的5μm。另请参阅 图S3和S4 .
（I，J）根据年龄和性别匹配的（I）肌球蛋白VI重建的代表性全肾显微CT图像（分辨率16μm；n=3） +/+ 和（J）肌球蛋白VI −/− 老鼠。 肌球蛋白VI分支明显减少 −/− 老鼠。
（K） 显微CT图像的定量分析表明肌球蛋白VI中直径<100μm的血管总数显著减少 −/− 相对于肌球蛋白VI的小鼠（白色条） +/+ 老鼠（黑色条）。 （平均值±扫描电镜，*P<0.05）
（五十） 激光多普勒图像的定量分析表明，股动脉结扎后14天，肌球蛋白VI的后肢再灌注发生显著变化 −/− 相对于肌球蛋白VI的小鼠（白色条） +/+ 老鼠（黑色条）。 （平均值±SEM，*P<0.05）
动脉发育中Myo6a敲除现象-联蛋白敲除 然后，我们检查了myo6a敲除现象是否与联蛋白敲除后观察到的动脉缺陷相类似。 为此，我们在单细胞期胚胎中注射 肌6α -特异性反义吗啉寡核苷酸Myo6a-ATG1选择性靶向 肌6α 翻译起始点( 补充信息 ). 使用已建立的荧光素酶融合报告物分析，Myo6a-ATG1剂量依赖性地抑制报告物的翻译，这表明它是有效的，而反转对照吗啉基Myo6a-Ctr即使在测试的最高剂量下也是无效的( 图S3A ). 宏观检查显示，Myo6a-ATG1剂量依赖性地影响注射胚胎的形态完整性。 注射最大剂量（每个胚胎10.5纳克）后 肌6α 击倒（myo6a 杜兰特 )前两次胚胎发育畸形或死亡； 这些胚胎被排除在外。 myo6a的其余部分 杜兰特 胚胎具有正常到轻微弯曲或缩短的体型； 两个dpf使其轴血管和体间血管的血流迟缓或消失。 此后，大多数myo6a 杜兰特 胚胎开始出现心包水肿。
可视化myo6a中的血管缺陷 杜兰特 更详细地说，我们在 Tg（Fli1:EGFP） y1个 斑马鱼。 在Myo6a-Ctr和注射缓冲液的对照胚胎中，血管发育正常( ). 在16 hpf时，对照胚胎中的成血管细胞以有序的拉链状模式从侧板中胚层向中线迁移，并向前后方进行( ， 表S1 ). 这些内皮祖细胞聚集在原始血管索中，然后通过24hpf发育成发光的背主动脉和后主静脉。 32%的myo6a 杜兰特 胚胎中，一小部分成血管细胞在16hpf时沿其路径向中线停滞，而其他细胞则以无组织的拉链式模式无序迁移( ， 表S1 ). 内皮祖细胞的异常迁移损害了背主动脉的形态发生。 高达77%的myo6a 杜兰特 胚胎发育出一条异常薄的主动脉，内腔大小显著减小，呈线状结构，而后主静脉在30hpf时发育正常( 表S1 ). GFP的整体免疫染色显示对照组和myo6a的后主静脉未闭 杜兰特 胚胎( )而myo6a的主动脉腔异常小 杜兰特 胚胎( ). 总的来说，成血管细胞异常迁移和肌6a中轴动脉的形成受损 杜兰特 胚胎与连接蛋白的早期血管缺陷非常相似 杜兰特 胚胎( Chittenden等人，2006年 ).
在分析血管发育的后续阶段时，我们观察到，在对照胚胎中，原发性（动脉）ISV在20 hpf时从主动脉分叉，并向背上移动到神经管的背外侧顶部，在那里分裂为尾端和吻侧分支， 延长并与其他节段的分支融合，形成48 hpf的背侧纵向吻合血管（DLAV）( ， 表S1 ). 在myo6a中 杜兰特 胚胎，最初的ISV萌芽是正常的，发生在适当的指定主动脉部位。 在合成酶中 杜兰特 胚胎，部分ISV未能从主动脉分支( Chittenden等人，2006年 ). 相比之下，所有ISV在myo6a中均正常从主动脉分支 杜兰特 胚胎，但在48%的变形体中，至少有五个ISV沿着其背部轨迹停滞，未能到达神经管的顶部，从而部分阻碍了DLAV的形成( ， 表S1 ). 此外，ISV的内皮细胞常常异常纤细( ). 因此，myo6a中的ISV缺陷 杜兰特 胚胎在质量上相似，但在数量上不如合成素敲除诱导的胚胎严重。 总之，背主动脉的受损形成及其动脉ISV在myo6a中萌芽 杜兰特 斑马鱼胚胎在synctin基因敲除后几乎表现出动脉缺陷。 所有描述的血管缺陷都是由Myo6a-ATG1以剂量依赖的方式诱导的( 表S1 ). 此外，这种血管表型是特异性的，因为另一种非重叠吗啉定位于 肌6α ，Myo6a-ATG2，剂量依赖性抑制荧光素酶融合报告子的翻译( 图S3 )导致无法区分的血管缺陷( 表S1 ).
Myo6a公司 杜兰特 引起与合成素类似的动脉细胞缺陷 杜兰特 斑马鱼 我们以前证明，联蛋白敲除可减少动脉内皮细胞的增殖( Chittenden等人，2006年 ). 为了评估敲低myo6a是否会导致类似的缺陷，我们测量了myo6a的动脉增殖 杜兰特 胚胎，使用与联合蛋白敲除类似的技术。 Tg（航班1:EGFP） y1个 胚胎在20hpf下与BrdU孵育，允许其生长至30hpf，之后动脉和静脉GFP + 溴化铀 + 内皮细胞计数( 图S4 ). 而增殖的静脉内皮细胞数量不受影响（肌6a中1.63±0.12个细胞/节 杜兰特 胚胎与对照胚胎1.61±0.14个细胞/切片的比较； N=9； P=0.83），主动脉内皮细胞增殖减少，myo6a的ISV减少 杜兰特 胚胎（肌6a中1.41±0.16个细胞/节 杜兰特 胚胎与对照组1.95±0.18个细胞/节； N=9； P<0.05）。 这些结果表明，尽管myo6a的敲除略低于syncent的敲除，但它会损害动脉内皮细胞的迁移和增殖，而不是静脉内皮细胞。
肌球蛋白VI敲除损害小鼠动脉形态发生 与斑马鱼不同，老鼠体内只存在一个肌球蛋白-VI基因。 肌球蛋白-VI缺失小鼠与联结蛋白缺失小鼠相似，比其同窝野生型小鼠小（17.9±2.9g对22.5±3.9g，p<0.01）。 显微CT血管密度评估显示肾内动脉数量较少( )和周边循环( )类似于联结蛋白敲除小鼠的发现。
为了评估肌球蛋白VI缺失对成人组织、肌球蛋白-VI股总动脉的动脉形态发生的影响 −/− 如前所述，结扎对照同窝小鼠，并使用激光多普勒测量血流恢复时间。 类似于合成酶 −/− 小鼠，肌球蛋白VI −/− 小鼠下肢血流恢复受损与动脉生长受损一致( ).
结合蛋白中VEGFR2去磷酸化 −/− 和肌球蛋白-VI −/− 内皮细胞 VEGFR2内体从质膜的转运延迟，并且观察到两种结合蛋白中VEGFR2的去磷酸化增加 −/− 和肌球蛋白-VI −/− 内皮细胞可能是由于这些细胞中长时间暴露于活化的VEGFR2的膜滞留或膜周酪氨酸磷酸酶所致。 为了测试这种可能性并鉴定所涉及的磷酸酶，我们使用siRNA敲除了合成素中的四种不同的磷酸酪氨酸磷酸酶 −/− 澳大利亚大学城( 图S5A )同时测量ERK1/2对VEGF的反应。 敲除PTP1b对恢复合成素ERK激活最有效 −/− 澳大利亚大学城( ). 此外，Y处VEGFR2磷酸化显著恢复 1175 ( ). 然而，在对照（野生型）AEC中敲除这些磷酸酶对ERK1/2磷酸化没有额外影响( 图S5B ). 有趣的是，PTP1b在动脉和静脉内皮细胞中的表达是相同的，连接素缺失对其表达没有影响( 图S5C )
磷酸酶敲除对VEGF信号转导的影响 （A，B）PTP1B敲低增加了合成素中的VEGF信号 −/− 澳大利亚大学城。 协同素 −/− 用指示的siRNA转染AEC 2天，饥饿，用50ng/ml VEGF-A刺激。用pErk和pVEGFR2（Y 1175 )显示PTP1b敲除后磷酸化增加（面板A），面板B显示pERK激活的量化（平均值±SEM，*P<0.05）。 另请参见 图S6 .
（C） PTP1B敲低对AEC迁移的影响 ：AEC从连接点迁移的相对距离 +/+ 和 −/− 在存在对照siRNA或PTP1b siRNA的情况下，对生长在纤维连接蛋白涂层培养皿上的小鼠进行“损伤”融合单层并用0.5%FBS或50 ng/ml VEGF-a刺激8小时后的测量 −/− PTP1B siRNA处理后细胞对VEGF的反应。平均值+/-SD，*=P<0.05。 带缝钢筋：连接 +/+ 用对照siRNA处理AEC； 灰色条：合成 +/+ 带PTP1b siRNA的AEC； 黑条：联凝素 −/− 带有控制siRNA的AEC； 白色条：合成 −/− 带PTP1b siRNA的AEC。
（D） 斑马鱼Myo6a和Ptp1b的Co-Knockdown效应：对变形胚胎动脉缺陷的定量分析表明，Ptp1b-ATG以剂量依赖性的方式部分挽救了Myo6a的敲除表型。 单个ptp1b 杜兰特 （6ng Ptp1b-ATG）不会诱发血管缺陷。 深蓝色条表示单个myo6a 杜兰特 （10.5ng Myo6a-ATG1），蓝色和浅蓝色条表示双ptp1b 杜兰特 ：myo6a 杜兰特 （10.5ng Myo6a-ATG1分别与3或6ng Ptp1b-ATG结合）。*， P<0.05；**， P<0.001。
确认VEGFR2 Y恢复的生理意义 1175 磷酸化、野生型和结合蛋白 −/− AEC暴露于PTP1b或对照siRNA，并测量对VEGF的迁移反应。 合成时 −/− 用对照siRNA处理的AEC迁移率显著低于对照AEC，暴露于PTP1b siRNA显著增加了迁移率，使其恢复到控制细胞水平，与观察到的VEGFR2 Y一致 1175 站点激活( ).
敲除ptp1B可挽救myo6a敲除后的动脉表型 符合我们的 在体外 我们预计，myo6a敲除后的动脉缺损是VEGFR2长期暴露于PTP1b磷酸酶活性的结果，从而抑制下游VEGF信号传导。 因此，我们沉默了ptp1b Tg（航班1:EGFP） y1个 斑马鱼胚胎使用靶向ptp1b翻译起始位点的ptp1b-特异性吗啉，即ptp1b-ATG。 与靶向吗啉类的myo6a类似，在嵌合萤光素酶报告基因测定中，Ptp1b-ATG剂量依赖性阻断报告基因的翻译( 图S3B ).
与以前的报告一致( 范德萨等人，1999年 )6 ng Ptp1b-ATG剂量不会导致大体形态畸形或血管缺陷（背主动脉薄，ISV形成受阻），也不会损害2 dpf的循环（未显示；N=147）。 然而，在联合注射实验中，Ptp1B-ATG部分修复了由最大剂量的Myo6a-ATG1诱导的特征性血管缺陷（未显示）。 在注射10.5 ng Myo6A-ATG1的胚胎中，71%和62%的胚胎分别表现出主动脉变薄或ISV停滞（N=90）。 相比之下，在联合注射10.5 ng Myo6A-ATG1和6 ng Ptp1b-ATG的胚胎中，只有50%和31%的胚胎出现相应的血管缺陷( ，N=179； 卡方分析分别为P＜0.05和P＜0.001）。 当低剂量的3 ng Ptp1b-ATG与10.5 ng Myo6A-ATG1（未显示）联合注射时，获得了定性相似的结果。 ptp1b和myo6a的共表达也延长了胚胎存活时间； 186 myo6a 杜兰特 胚胎严重畸形或死亡占51.6%； ptp1b的相应值为42.4% 杜兰特 ：myo6a 杜兰特 胚胎（3 ng Ptp1b-ATG；N=203；P<0.05）和24.5%的Ptp1b 杜兰特 ：myo6a 杜兰特 胚胎（6 ng Ptp1b-ATG；N=237；P<0.001）。 背主动脉和ISV缺损的部分修复 肌6α 击倒也是通过联合注入另一种 蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B -特异性吗啉，Ptp1b-拼接（N=144；两种血管表型均P<0.05）。 这种Ptp1b剪接吗啉靶向Ptp1b的第一外显子和内含子之间的剪接位点，并有效阻断剪接，如跨越第一内含子边界的Ptp1b区域的PCR扩增所证明的( 图S3C ). 相比之下，类似剂量的对照吗啉基Ptp1b-Ctr未能挽救myo6a敲除表型：Ptp1b Crl公司 ：myo6a 杜兰特 胚胎分别有72.7%和62.8%的背主动脉和ISV缺陷（N=161）。
敲除ptp1B可挽救联蛋白缺失小鼠的动脉表型 接下来，我们测试了PTP1b抑制对恢复血管内皮生长因子R2信号和合成素中动脉形态发生的有效性 −/− 老鼠。 为此，synctin −/− 和对照组小鼠进行股总动脉结扎，同时每天口服PTP1b抑制剂。 使用激光多普勒成像评估远端肢体血流显示，抑制剂治疗的synectin明显加速了恢复 −/− 流量恢复到对照小鼠水平的小鼠( ). 与未经处理的对照组相比，经抑制剂处理的对照动物表现出更高的流量趋势，但仅在第7天达到统计显著性。 为了评估动脉生成的程度，我们获得了肢体循环的显微CT图像( ). 在抑制剂治疗的synctin中，小动脉（>168μm）的数量在统计学上显著增加 −/− 老鼠( )大部分新动脉出现在非缺血的大腿区域( ).
合成素中PTP1B抑制的功能效应 −/− >老鼠 （A） 激光多普勒血流分析 ：合成酶 −/− 和 +/+ 对小鼠进行股总动脉结扎，并按所述给药PTP1b抑制剂或载体。 该图显示了缺血足的血流，用正常足的血流比率表示。 注意经PTP1b抑制剂处理的联结蛋白的流量显著增加 −/− 老鼠。 （平均值±SEM，*P<0.05，每组n=7）。
（B，C）动脉血管系统发育的显微CT分析：图表（面板B）显示了膝关节以上动脉血管系统的定量分析 −/− 和 +/+ 小鼠股总动脉结扎后14天，用PTP1b抑制剂或载体治疗。 （平均值±SEM，*P<0.05）注意到PTP1b抑制剂治疗的联凝蛋白在较小尺寸的动脉中显著增加 −/− 老鼠。 面板C中显示了具有代表性的micro-CT图像。
讨论 最近的研究表明，酪氨酸激酶受体一般和VEGFR2特异性信号不仅来自浆细胞膜，也来自内胚小室( 迪菲奥雷和德卡米利，2001年 ； von Zastrow和Sorkin，2007年 )而内吞作用的破坏可能会影响受体信号( Lampugani等人，2006年 ). 然而，这种依赖于细胞内吞的受体信号调节的具体分子机制尚未建立。 在这里，我们报告了VEGFR2从质膜向EEA1阳性内体的转运需要通过皮质区依赖连接素-肌球蛋白-VI的逆行转运，并且这种转运中的任何缺陷都会导致Y细胞依赖PTP1b的去磷酸化 1175 现场。 这反过来又导致胚胎发育和成人组织中动脉形态发生缺陷。
VEGFR2信号通路是通过在VEGF诱导的二聚体化后几个关键胞质域酪氨酸残基的磷酸化来实现的，而一些磷酸酪氨酸磷酸酶被认为能够将其熄灭( Nakamura等人，2008年 )，TC-PTP( Mattila等人，2008年 )、VE-PTP( Mellberg等人，2009年 ； Nottebaum等人，2008年 )，部门-1/CD148( Lampugani等人，2003年 )和Shp2均被报道对VEGFR2信号进行不同的调节( Mitola等人，2006年 ).
特别是，据报道PTP1b可对Y进行专门脱磷 1175 从而影响PLCγ-MAPK途径的激活( Nakamura等人，2008年 ). PTP1b是一种小的细胞质PTP( 布尔多等人，2005年 )位于内质网的细胞质表面。 这与另一种小细胞质PTP（TC-PTP）有直接区别，TC-PTP在Y轴对VEGFR2进行去磷酸化 1054/1059 （TK激活位点）和Y 1214 不影响Y的（p38MAPK激活位点）位点 1175 .
PTP1b的表达受许多因素控制，如缺血和缺氧，在胰岛素抵抗状态和肥胖中表达增加( 布尔多等人，2005年 )，与VEGF活性降低相关的条件。 PTP1b催化的去磷酸化需要受体的内吞作用，并发生在内质网表面的特定位置( Haj等人，2002年 ). PTP1b与VEGFR2共沉淀( Nakamura等人，2008年 )这表明这两种蛋白质之间存在物理相互作用，或者它们存在于同一蛋白质复合体中。 PTP1b表达减少导致ERK1/2激活增加，而其表达增加抑制ERK1/2的激活( Nakamura等人，2008年 ). 这表明PTP1b活性特别影响Y 1175 结合PLCγ和随后激活RAF-MEK-ERK级联所需的位点磷酸化。
PTP1b效应并不局限于VEGFR2。 当前研究的有趣之处在于观察到PTP1b抑制来自内吞室的EGF-R信号( Eden等人，2009年 )通过调节PLCγ结合位点（Y 992 )在EGFR中( Milarski等人，1993年 ).
据报道，跨膜受体型PTP也可调节VEGFR2活性。 因此，DEP1/CD148通过与β-连环蛋白和p120连环蛋白结合，与浆细胞膜上的VE-钙粘蛋白-VEGFR2复合物结合，并使VEGFR2去磷酸化( Lampugani等人，2006年 ). DEP1的缺失导致所有主要VEGFR2自身磷酸化位点的酪氨酸磷酸化增加，但令人惊讶的是，只会激活Src活性，而不会全面刺激VEGF依赖性信号( Chabot等人，2009年 ). VE-PTP是一种结构上与DEP-1相关的跨膜PTP，在发育过程中在血管系统中表达，在动脉内皮中优先表达。 VEGFR2-VEPTP相关性的降低导致大多数位点的受体磷酸化显著增加，但Y可能除外 1214 ( Mellberg等人，2009年 ).
因此，虽然各种PTP能够影响VEGFR2信号传导，但它们的作用位点对每种酶都是不同的和特定的。 由于VEGFR2内吞被认为在调节其信号传导中起着重要作用，因此从分子机制上将这两个事件联系起来是很重要的。 VEGFR2主要以网格蛋白依赖的方式在EEA1阳性的内体中内化，并且在极低程度上通过小窝蛋白或脂筏途径内化。 此外，活性PLCγ与内化的VEGFR2共分布，表明Y 1175 位点磷酸化发生在或维持在内胚体中。 网格蛋白表达减少导致VEGFR2和ERK1/2磷酸化降低( Lampugani等人，2006年 ).
虽然对新内吞蛋白质在氯氰菊酯包被的囊泡中向早期内体的转运知之甚少，但最近的研究表明，联结蛋白是这一步骤的重要调节因子。 因此，synectin参与TrkA的内吞( Lin等人，2006年 ； Lou等人，2001年 ； Varsano等人，2006年 )，谷氨酸1( Wieman等人，2009年 )和神经胶质-1( Valdembri等人，2009年 ). 协同素部分通过与APPL（衔接蛋白、磷酸酪氨酸相互作用、PH域和含有亮氨酸拉链）结合来实现这一点，APPL是一种招募RAB5以扩大APPL相关膜结构的蛋白质，是信号转导调控中的一个关键事件( Chial等人，2008年 ； Miaczynska等人，2004年 )，并且部分通过与肌球蛋白VI结合。
与其他肌球蛋白不同，肌球蛋白VI能够向肌动蛋白丝的负端移动，因此它与多种细胞过程有关，包括内吞、分泌和膜皱褶( 巴斯和肯德里克·琼斯，2008年 ). 此外，肌球蛋白-VI在未涂层的内吞囊泡中与联结蛋白共定位，并参与其通过质膜下的皮质肌动蛋白丝网络的运动( Chibalina等人，2007年 ).
在本研究中，我们通过证明含VEGFR2的内体的连接蛋白-肌球蛋白-VI依赖性转运在调节VEGF信号和动脉规格中起着关键作用来扩展这些观察结果。 小鼠中连接蛋白和肌球蛋白-VI表达的纯合性破坏或斑马鱼中其表达的下调会导致相似的表型，动脉形态发生减少，包括动脉血管系统的缩小、分支减少和成年组织中无法恢复动脉灌注。 这些表型可以追溯到Y的活化减少 1175 VEGFR2上特异性参与PLCγ-MAPK通路激活的位点，该通路与动脉形态发生有关。 反过来，Y降低的近端原因 1175 磷酸化是指VEGFR2内体从皮质区缓慢运输，在皮质区暴露于PTP1b，PTP1b使该部位去磷酸化。 在这种情况下，VEGF信号的损伤并不完全，因为一些VEGFR2内体最终能够离开质膜，并保持一定程度的PLCγ和ERK-1/2激活。 因此，联结蛋白或肌球蛋白-VI的缺失不是致命的，但两者都与动脉形态发生受损有关。
这些事件之间的联系通过全长联凝蛋白在无联凝蛋白的内皮细胞中恢复表型的能力来证明，而具有被破坏的肌球蛋白VI或PDZ结合位点的突变体没有这种活性。 后一种突变体阻止了合成素与APPL结合，这与Akt磷酸化受抑制的报道一致，Akt的磷酸化依赖于Y 1175 磷酸化( Saito等人，2007年 ). PTP1b表达被抑制后，联结蛋白无效细胞中的VEGF信号恢复，提示与PTP1b的联系，而其他VEGFR2相关PTP的敲除作用较小。 此外，动脉形态发生在成人连接蛋白中得到恢复 −/− 在缺血环境中使用特定抑制剂抑制PTP1b活性的小鼠。 最后，PTP1b的敲除在很大程度上恢复了肌球蛋白VI的发育性动脉形态发生异常 杜兰特 斑马鱼。
这项研究的发现表明了以下事件的顺序。 VEGF结合后，VEGFR2被激活，如Y磷酸化所示 1054/1059 网站。 这反过来导致其他VEGFR2酪氨酸的自身磷酸化。 然后，新激活的受体被内吞，进入网格蛋白阳性囊泡的膜下空间并与APPL结合( Miaczynska等人，2004年 )进而结合结合肌球蛋白-VI复合物( Lin等人，2006年 ； Varsano等人，2006年 )将VEGFR2小泡移动到EEA1阳性内体。 此时，Y的磷酸化 1175 变得明显，导致PLCγ/MAPK和PI3K-Akt级联激活。 反过来，这可能通过激活Ets转录因子促进动脉生成信号( 德瓦尔和布莱克，2009年 ； Watanabe等人，2004年 ).
在缺乏联结蛋白或肌球蛋白-VI的情况下，含有VEGFR2的小泡在Y 1175 该位点被PTP1b去磷酸化，导致PI3K/Akt和MAPK级联选择性下调，从而导致动脉生成缺陷和分支形态发生。 另一方面，Rab7或Rab11表达的下调增加了ERK的激活，因为它迫使VEGFR2内体在细胞质的“信号室”中花费更多时间
总之，我们的研究结果表明，联凝蛋白/肌球蛋白VI复合物是动脉形态发生的关键调节因子，并证明含有VEGFR2的内吞小泡的运输导致VEGF受体2信号的选择性调节。
方法 内皮细胞的腺病毒拯救 将细胞接种在10 cm的纤维连接蛋白涂层培养皿上，生长到60-70%的融合处，并在含有0.5%FBS的培养基中饥饿8小时。将腺病毒以100的MOI加入含有0.5%FBS的培养基过夜，第二天加入含有20%FBS的介质。 2-3天后，细胞在0.5%FBS中饥饿过夜，并用VEGF-A刺激 165 （50ng/ml）5分钟，然后用RIPA裂解缓冲液收集。
内皮细胞的siRNA转染 将含有0.5%FBS和Targefect siRNA悬浮液（靶向系统）的1ml培养基中的200摩尔/皿siRNA（Qiagen）添加到以70-80%的汇合液涂布在6cm纤维连接蛋白涂层培养皿上的细胞中，并在37°C下孵育2小时。 24小时后重复同样的程序。
细胞表面生物素化法分析VEGFR-2内化 细胞生长在10cm纤维连接蛋白涂层皿上汇合，并在含有0.5%FBS的培养基中饥饿过夜。用冷PBS冲洗后，用5ml/皿EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin（0.25mg/ml）在4°C的PBS中培养30分钟，用冷PBS+50mM甘氨酸淬火，并用1%BSA的冷培养基冲洗细胞。 然后在37°C下用VEGF-A（50ng/ml）刺激细胞。 在预先确定的时间点，用冷PBS冲洗细胞，并在冰上用谷胱甘肽（45mM）在75mM NaCL、75mM NaOH、1mM EDTA、1%BSA中培养20分钟。用冷PBS-碘乙酰胺（5mg/ml）淬灭谷胱甘酮。 用冷PBS和使用NP-40裂解缓冲液制备的蛋白裂解物冲洗细胞。 200μg裂解液在4°C下用50μl NeutraAvidin珠免疫沉淀过夜，然后用500μl NP-40裂解缓冲液冲洗，并重新悬浮在60μl 2×Lamelli的SDS样品缓冲液中。 样品通过SDS-PAGE进行分析，然后用抗VEGFR2（细胞信号传递）进行蛋白质印迹。
内皮细胞迁移试验 如前所述，通过“损伤”分析测量细胞迁移( Chittenden等人，2006年 )用含有0.5%FBS、20%FBS或0.5%FBS加VEGF（50ng/ml）的培养基处理细胞。 在每次实验中，对来自2口单井的每个条件下至少10次测量值进行了分析。
VEGFR-2和EEA1、Rab7和Rab11的克隆化 细胞被镀在纤维连接蛋白涂层的玻璃底板（MatTek）上，用0.5%的FBS饥饿过夜。所有抗体标签都在冰上进行。 用大鼠抗鼠VEGFR-2（10μg/ml）一级抗体标记细胞15分钟，用冷PBS冲洗，然后用鸡抗鼠alexa488二级抗体冲洗15分钟。然后用VEGF-A刺激细胞 165 （50ng/ml），然后在37°C下孵育0–30分钟。， 用pH 2.5的冰冷PBS清洗细胞，以去除剩余的细胞表面受体。 细胞在25°C、4%多聚甲醛下固定10分钟，并用2.5%PFA/0.1%Triton X-100/0.1%NP-40渗透10分钟。然后用山羊抗EEA1抗体标记细胞过夜，然后用鸡抗山羊alexa647二级抗体标记细胞。 样品在配备Sensicam QE冷却CCD相机（Cooks）、DG-4氙弧光源（Sutter）和60×油浸透镜的宽场荧光显微镜（Olympus IX-71）下观察。 QED软件（媒体控制论）用于图像采集。 使用图像J的共定位插件量化共定位。对于Rab7（Rab11）细胞的共定位，先用小鼠抗Rab7抗体（Rab十一）标记，然后用兔抗鼠alexa568二级抗体标记。 使用X63物镜（蔡司LSM 510 Meta）通过激光扫描共聚焦显微镜获取图像。
含VEGFR-2囊泡的活细胞显微成像 用大鼠抗鼠单克隆VEGFR2（10μg/ml）一级抗体标记细胞15分钟，用冷PBS冲洗，用鸡抗鼠alexa488二级抗体标记15分钟，再用冷PBS再次冲洗。将细胞置于显微镜台上，用添加0.5%FBS和VEGF-A的培养基处理 165 （50ng/ml），温度为37°C。 在配备有机玻璃封闭台的倒置显微镜（奥林巴斯IX-71宽视野）上进行时间推移成像，保持37°C和5%CO 2 图像由冷却软件控制（QED，Media Cybernetics）电荷耦合设备相机（SensiCam，Cooke Corp）使用滤镜和60×油浸物镜（Olympus）采集。 VEGF刺激后，每隔30秒采集一次图像，持续30分钟。 使用ImageJ处理图像，使用“手动跟踪”插件跟踪单个囊泡。
外科后肢缺血模型 这是按照前面的描述完成的( Chittenden等人，2006年 ). 在异氟烷麻醉下，使用摩尔红外激光多普勒成像仪（LDI；Moor Instruments Ltd）在36.5°C至37.5°C温度下进行激光多普勒血流成像。 使用Moor LDI图像处理软件V3.09对数据进行分析，并报告为右/左（R/L）后肢的流量比。
显微CT血管造影 使用1:1的铋（Sigma-Aldrich）和明胶（ICN-Biomedicals）混合物作为血管造影剂。 如前所述，进行显微CT图像的制备、采集和分析( Chittenden等人，2006年 ).
PTP1B抑制剂处理 PTP1B抑制剂由Merck Frosst Canada合成并提供，如前所述使用( Julien等人，2007年 ). 从股动脉结扎前两天开始，每天口服PTP1B化合物（或载体）（30mg/kg体重），注射量为10ml/kg体重。 载药溶液由0.5%甲基纤维素（Sigma-Aldrich）组成。
斑马鱼分析
斑马鱼吗啉基因敲除 Tg（fli1:EGFP） y1个 斑马鱼( 劳森和温斯坦，2002年 )保持在标准实验室条件下。 胚胎保存在28°C的0.3×Danieau/PTU（胚胎水）中。 以下基因特异性和对照反义摩洛哥寡核苷酸购自gene Tools（LLC，Corvallis）（参见 补充方法 有关序列详细信息）。 如前所述，使用荧光素酶报告分析测定了Myo6a-ATG1、Myo6a-ATG2和Ptp1b-ATG的沉默效率( Ny等人，2005年 )而使用来自2 dpf的Ptp1b-Splice注射胚胎的cDNA，对跨越第一内含子边界的ptp1β特异性序列进行PCR扩增，证明了Ptp1b-Splce的沉默效率。 按照之前描述的程序，将不同剂量的吗啉醇和不同组合的吗啉酸注射到单细胞至四细胞期胚胎中，以进行抢救实验( Stalmans等人，2002年 )胚胎在28°C的胚胎水中进一步孵育至16hpf、30hpf和40hpf。 在这些时间点，对每次实验中30到60个注射胚胎进行分析。 每个实验的外显率通过计算受影响的胚胎进行评分，每个实验至少重复三次。 手稿中显示的myo6a敲除的所有数据都是在注射10.5 ng myo6a-ATG1后获得的。 对照胚胎用注射缓冲液（0.1%酚红，0.4M KCl）注射。 胚胎的共焦成像使用蔡司激光扫描显微镜LSM510进行，488 nm激光发射由氩激光提供。
斑马鱼整体原位杂交和免疫染色 在4°C的4%多聚甲醛中过夜固定脱羧酸胚胎。 整体安装 就地 按照描述进行杂交( Stalmans等人，2002年 )，使用斑马鱼反义探针 肌6α . Tg（fli1:EGFP） y1个 用兔抗GFP抗体（Torrey-Pines Biolabs）和鼠抗BrdU抗体（Santa Cruz Biotechnology）对胚胎进行免疫染色。 染色后的胚胎首先包埋在1.5%琼脂糖中，然后在石蜡中，切片在7 mm处。切片分别用核固红和DAPI对杂交胚胎和免疫染色胚胎进行复染。 使用蔡司Axia成像仪显微镜进行分析。
统计分析 标准偏差在直方图中显示为条形，Hindlimb数据除外，其中误差条形表示平均值的标准误差（SEM）。 如果Student’s two-tailed的p值为0.05，则认为差异具有统计学意义 t吨 测试。 对于斑马鱼分析，采用齐方分析来确定显示特定血管表型的胚胎分数在治疗组之间是否存在差异。
致谢 我们要感谢Arie Horowitz（克利夫兰诊所基金会）提供的肌球蛋白VI构建物，Yan Huang（耶鲁）准备的腺病毒，Merck Frosst的Brian Kennedy和Robert Gordon提供的PTP1B抑制剂及其使用建议。
部分由NIH拨款HL84619（MS）和Leducq基金会跨大西洋网络拨款（MS、FJG和PC）支持。
脚注
出版商免责声明： 这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。 作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。 手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
参考文献 Allport JR、Lim YC、Shipley JM、高级RM、Shapiro SD、Matsuyoshi N、Vestweber D、Luscinskas FW。 MMP-9或中性粒细胞弹性蛋白酶缺乏小鼠的中性粒细胞在体外流动条件下的内皮细胞迁移无缺陷。 白细胞生物学杂志。 2002; 71 ：821–828。 [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Aschenbrenner L、Naccache SN、Hasson T。未涂层的内吞囊泡需要非常规肌球蛋白Myo6，才能通过肌动蛋白屏障快速转运。 分子生物学细胞。 2004; 15 :2253–2263. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Bourdeau A，Dube N，Tremblay ML。细胞质蛋白酪氨酸磷酸酶，调节和功能：PTP1B和TC-PTP的作用。 当前操作细胞生物学。 2005; 17 :203–209. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Buss F，Kendrick-Jones J.肌球蛋白VI在细胞内的细胞功能是如何调节的？ 生物化学与生物物理研究委员会。 2008; 369 :165–175. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Cai H，Reed RR.神经纤维蛋白-1相互作用蛋白的克隆和表征：一种与神经纤维蛋白1细胞质域相互作用的PSD-95/Dlg/ZO-1结构域蛋白。 神经科学杂志。 1999; 19 :6519–6527. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Chabot C、Spring K、Gratton JP、Elchebly M、Royal I。蛋白酪氨酸磷酸酶DEP-1在Akt活化和内皮细胞存活中的新作用。 分子细胞生物学。 2009年； 29 :241–253. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Chial HJ、Wu R、Ustach CV、McPhail LC、Mobley WC、Chen YQ。 APPL1和APPL2的膜靶向作用：寡聚并结合磷脂酰肌醇的动态支架。 交通。 2008; 9 :215–229. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Chibalina MV、Seaman MN、Miller CC、Kendrick-Jones J、Buss F.肌球蛋白VI及其相互作用蛋白LMTK2调节小管的形成和向内吞再循环室的转运。 细胞科学杂志。 2007; 120 :4278–4288. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Chittenden TW、Claes F、Lanahan AA、Autiero M、Palac RT、Tkachenko EV、Elfenbein A、Ruiz de Almodovar C、Dedkov E、Tomanek R等。通过连接蛋白选择性调节动脉分支形态发生。 开发单元。 2006; 10 ：783–795。 [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Dance AL、Miller M、Seragaki S、Aryal P、White B、Aschenbrenner L、Hasson T。肌球蛋白-VI靶向内吞小室的调节。 交通。 2004; 5 :798–813. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] De Val S，Black BL。内皮细胞发育的转录控制。 开发单元。 2009年； 16 :180–195. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] De Vries L，Lou X，Zhao G，Zheng B，Farquhar MG。GIPC是一种含有PDZ结构域的蛋白质，与RGS-GAIP的C末端特异性相互作用。 美国国家科学院院刊。 1998; 95 :12340–12345. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Di Fiore PP，De Camilli P.细胞内吞和信号传导。 不可分割的伙伴关系。 单元格。 2001; 106 :1–4. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Eden ER、White IJ、Futter CE。 多泡体内表皮生长因子受体信号的下调。 生物化学Soc Trans。 2009年； 37 :173–177. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Gao Y，Li M，Chen W，Simons M.Synerctin，syndecan-4细胞质域结合PDZ蛋白，抑制细胞迁移。 《细胞生理学杂志》。 2000; 184 :373–379. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Haj FG、Verveer PJ、Squire A、Neel BG、Bastiaens PI。 PTP1B对内质网表面受体去磷酸化的成像部位。 科学。 2002; 295 :1708–1711. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Julien SG、Dube N、Read M、Penney J、Paquet M、Han Y、Kennedy BP、Muller WJ、Tremblay ML。蛋白质酪氨酸磷酸酶1B缺乏或抑制延缓ErbB2诱导的乳腺肿瘤发生，并防止肺转移。 自然遗传学。 2007; 39 :338–346. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Kappler JA、Starr CJ、Chan DK、Kollmar R、Hudspeth AJ。 编码斑马鱼肌球蛋白VI亚型的基因发生无义突变，导致毛细胞机械传导缺陷。 美国国家科学院院刊。 2004; 101 :13056–13061. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Lampugnani MG、Orsenigo F、Gagliani MC、Tacchetti C、Dejana E。血管内皮钙粘蛋白控制VEGFR-2的内化和来自细胞内区室的信号传导。 细胞生物学杂志。 2006; 174 :593–604. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Lampugani MG、Zanetti A、Corada M、Takahashi T、Balconi G、Breviario F、Orsenigo F、Cattelino A、Kemler R、Daniel TO等。接触性抑制VEGF诱导的增殖需要血管内皮钙粘蛋白、β-连环蛋白和磷酸酶DEP-1/CD148。 细胞生物学杂志。 2003; 161 :793–804. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Lanahan AA、Chittenden TW、Mulvihill E、Smith K、Schwartz S、Simons M.内皮细胞中的协同素依赖性基因表达。 生理基因组学。 2006; 27 :380–390. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Lawson ND，Weinstein BM。转基因斑马鱼胚胎血管发育的体内成像。 发育生物学。 2002; 248 :307–318. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Lin DC、Quevedo C、Brewer NE、Bell A、Testa JR、Grimes ML、Miller FD、Kaplan DR.APPL1与TrkA和GIPC1相关，是神经生长因子介导的信号转导所必需的。 分子细胞生物学。 2006; 26 :8928–8941. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Lou X、Yano H、Lee F、Chao MV、Farquhar MG。GIPC和GAIP与TrkA形成复合物：G蛋白和受体酪氨酸激酶途径之间的假定联系。 分子生物学细胞。 2001; 12 :615–627. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Mattila E、Auvinen K、Salmi M、Ivaska J。蛋白质酪氨酸磷酸酶TCPTP控制VEGFR2信号传导。 细胞科学杂志。 2008; 121 :3570–3580. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Mellberg S、Dimberg A、Bahram F、Hayashi M、Rennel E、Ameur A、Westholm JO、Larsson E、Lindahl P、Cross MJ等。转录谱揭示了酪氨酸磷酸酶VE-PTP在调节VEGFR2活性和内皮细胞形态发生中的关键作用。 法赛布·J。 2009 [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Miaczynska M、Christoporidis S、Giner A、Shevchenko A、Uttenweiler-Joseph S、Habermann B、Wilm M、Parton RG、Zerial M.APPL蛋白通过内体室将Rab5连接到核信号转导。 单元格。 2004; 116 :445–456. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Milarski KL、Zhu G、Pearl CG、McNamara DJ、Dobrushin EM、MacLean D、Thieme-Sefler A、Zhang ZY、Sawyer T、Decker SJ等。蛋白质酪氨酸磷酸酶1B识别表皮生长因子受体的序列特异性。 生物化学杂志。 1993; 268 :23634–23639. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Mitola S、Brenchio B、Piccinini M、Tertoolen L、Zammataro L、Breier G、Rinaudo MT、den Hertog J、Arese M、Bussolino F。I型胶原通过SHP2蛋白酪氨酸磷酸酶依赖机制1限制VEGFR-2信号传导。 圆形Res。 2006; 98 :45–54. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Naccache SN，Hasson T，Horowitz A.将内化受体结合到GIPC/synectin的PDZ结构域将肌球蛋白VI招募到内吞囊泡。 美国国家科学院院刊。 2006; 103 :12735–12740. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Nakamura Y、Patrushev N、Inomata H、Mehta D、Urao N、Kim HW、Razvi M、Kini V、Mahadev K、Goldstein BJ等。蛋白质酪氨酸磷酸酶1B在血管内皮生长因子信号传递和内皮细胞细胞间粘附中的作用。 圆形Res。 2008; 102 :1182–1191. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Nottebaum AF、Cagna G、Winderlich M、Gamp AC、Linnepe R、Polaschegg C、Filippova K、Lyck R、Engelhardt B、Kamenyeva O等。VE-PTP通过血小板球蛋白维持内皮屏障，并通过白细胞和VEGF与VE-cadherin分离。 《实验医学杂志》。 2008; 205 ：2929–2945。 [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Ny A、Koch M、Schneider M、Neven E、Tong RT、Maity S、Fischer C、Plaisance S、Lambrechts D、Heligon C等。研究淋巴管生成的非洲爪蟾遗传蝌蚪模型。 自然医学。 2005; 11 :998–1004. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Prahst C、Heroult M、Lanahan AA、Uziel N、Kessler O、Shraga-Heled N、Simons M、Neufeld G、Augustin HG。 神经磷脂-1-VEGFR-2复合需要神经磷脂-1的PDZ结合域。 生物化学杂志。 2008; 283 :25110–25114. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Saito T、Jones CC、Huang S、捷克议员、Pilch PF。Akt与APPL1的相互作用是胰岛素刺激的谷氨酸转位所必需的。 生物化学杂志。 2007; 282 :32280–32287. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Sakurai Y、Ohgimoto K、Kataoka Y、Yoshida N、Shibuya M。Flk-1（VEGF受体2）酪氨酸残基1173在小鼠血管生成中的重要作用。 美国国家科学院院刊。 2005; 102 :1076–1081. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Seiler C、Ben David O、Sidi S、Hendrich O、Rusch A、Burnside B、Avraham KB、Nicolson T.肌球蛋白VI是斑马鱼感觉毛细胞顶端表面结构完整性所必需的。 发育生物学。 2004; 272 :328–338. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Stalmans I、Ng YS、Rohan R、Fruttiger M、Bouche A、Yuce A、Fujisawa H、Hermans B、Shani M、Jansen S等。选择性表达VEGF亚型的小鼠视网膜中的动脉和静脉模式。 临床研究杂志。 2002; 109 :327–336. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Tkachenko E、Elfenbein A、Tirziu D、Simons M.Syndecan-4聚集以PDZ依赖的方式诱导细胞迁移。 圆形Res。 2006; 98 :1398–1404. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Valdembri D、Caswell PT、Anderson KI、Schwarz JP、Konig I、Astanina E、Caccavari F、Norman JC、Humphries MJ、Bussolino F等。神经毛蛋白-1/GIPC1信号调节内皮细胞中α5beta1整合素的流量和功能。 《公共科学图书馆·生物学》。 2009年； 7 ：e25。 [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] van der Sar AM，de Fockert J，Betist M，Zivkovic D，den Hertog J.斑马鱼蛋白酪氨酸磷酸酶-1B对早期胚胎发育的多效性作用。 国际开发生物学杂志。 1999; 43 :785–794. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Varsano T、Dong MQ、Niesman I、Gacula H、Lou X、Ma T、Testa JR、Yates JR、3rd、Farquhar MG。GIPC被APPL招募到外周TrkA内体，并调节TrkA的贩运和信号传递。 分子细胞生物学。 2006; 26 :8942–8952. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] von Zastrow M，Sorkin A.内吞途径的信号传导。 当前操作细胞生物学。 2007; 19 :436–445. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Wang LH，Kalb RG，Strittmatter SM。一种PDZ蛋白调节跨膜信号蛋白M-SemF的分布。 生物化学杂志。 1999; 274 :14137–14146. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Watanabe D、Takagi H、Suzuma K、Suzum I、Oh H、Ohashi H、Kemmochi S、Uemura A、Ojima T、Suganami E等。转录因子Ets-1介导缺血和血管内皮生长因子依赖性视网膜新生血管形成。 《美国病理学杂志》。 2004; 164 :1827–1835. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] Wieman HL、Horn SR、Jacobs SR、Altman BJ、Kornbluth S、Rathmell JC。 谷氨酸1 PDZ结合基序在生长因子调节谷氨酸1降解和贩运中的重要作用。 生物化学杂志。 2009年； 418 :345–367. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 
