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细胞。作者手稿；PMC 2010年10月16日发布。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2010年4月16日；141(2): 280–289.
数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2010.02.026
预防性维修识别码：项目经理2876819
NIHMSID公司：尼姆斯200583
PMID：20403324

线粒体融合是骨骼肌线粒体DNA稳定性和线粒体DNA突变耐受性所必需的

Xiuchen Chen先生,1,5 马克·维尔姆斯特,1,5 Yun E.Wang（王云）,1 安妮·乔敏,1,2 托马斯·普罗拉,3 J.迈克尔·麦卡弗里,4和大卫·C·陈1,2
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补充资料

总结

线粒体是高度流动和动态的细胞器，不断融合和分裂。这些过程允许线粒体交换内容物，包括线粒体DNA（mtDNA）。在这里，我们通过有条件地缺失融合所必需的线粒体GTPase丝裂原融合蛋白Mfn1和Mfn2，来检测线粒体融合在分化骨骼肌中的功能。线粒体融合蛋白的缺失会导致严重的线粒体功能障碍、代偿性线粒体增殖和肌肉萎缩。突变小鼠肌肉中线粒体DNA严重缺失，这是生理异常的先兆。此外，突变肌肉的线粒体基因组迅速累积点突变和缺失。在一项相关的实验中，我们发现线粒体融合的破坏在线粒体DNA突变水平较高的小鼠模型中强烈增加线粒体功能障碍和致死率。线粒体融合具有保护mtDNA完整性和在突变面前保护mtDNA功能的双重功能，很可能是与mtDNA突变相关的人类疾病的保护因素。

简介

线粒体融合和裂变已成为控制从酵母到哺乳动物线粒体功能的重要过程(Detmer和Chan，2007年a;Suen等人，2008年;冈本和肖，2005年;Hoppins等人，2007年). 在哺乳动物细胞中，三个大型GTPase对线粒体融合很重要，这需要内外膜的协调融合。线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2位于线粒体外膜上，参与膜融合的早期步骤(Koshiba等人，2004年;Meeusen等人，2004年;Song等人，2009年). 动力蛋白相关蛋白OPA1与内膜相关，对内膜融合至关重要(Song等人，2009年;Meeusen等人，2006年).

除了它公认的控制线粒体形态的功能外(Bleazard等人，1999年;Chen等人，2003年;Sesaki和Jensen，1999年)线粒体融合明显保护线粒体功能(Detmer和Chan，2007年a). 中的突变Mfn2公司和OPA1（作战行动1）(Alexander等人，2000年;Deletere等人，2000年;Zuchner等人，2004年)导致两种神经退行性疾病，分别是夏科特-马利牙2A型和显性视神经萎缩。神经退行性变在靶向突变的小鼠中也很明显Mfn2公司(Chen等人，2007年). 缺乏线粒体融合的细胞呼吸能力严重缺陷(Chen等人，2005年). 它们破碎的线粒体在功能上发生分化，导致膜电位和线粒体DNA（mtDNA）核仁的异质性，线粒体DNA核仁编码电子传递链的组成部分。这些结果导致了一个模型，即线粒体融合通过实现内容混合来保护线粒体功能(Detmer和Chan，2007年a;Chen等人，2007年).

由于这种成分混合，人们推测线粒体融合可能与人类细胞耐受高水平致病线粒体DNA的能力有关(Nakada等人，2009年;Nakada等人，2001年). 线粒体遗传学的一个显著特征是，大多数线粒体DNA突变是隐性的，在观察到对氧化磷酸化的影响之前，必须积累到很高的比例(迪莫罗和肖恩，2003年;泰勒和特恩布尔，2005年). 根据突变情况，异质细胞（包含突变型和野生型线粒体DNA）可以积累高达60-90%的致病性线粒体DNA分子，而不会显著降低呼吸活动(Rossignol等人，2003年;Chomyn，1998年). 在培养细胞和小鼠模型中，含有野生型和致病性mtDNA混合物的细胞在突破致病性mtDNA的高阈值之前，可以防止功能失常(Nakada等人，2009年;Ono等人，2001年). 这些观察结果表明，异质细胞中的细胞间混合可能是致病线粒体DNA基因组功能互补的基础(Nakada等人，2009年;Nakada等人，2001年). 然而，线粒体融合在功能互补中的拟议作用仍有待实验测试。

有关线粒体融合的其他基本问题仍有待探索。大多数关于哺乳动物线粒体动力学的研究仅限于培养的细胞和神经元(Detmer和Chan，2007年a;Suen等人，2008年). 这些研究表明，线粒体融合与线粒体沿细胞骨架的运输高度相关，因为线粒体在端到端或端到端碰撞时融合。然而，对线粒体动力学在大多数组织中的作用知之甚少体内包括骨骼肌纤维，它们具有高度代谢活性，常受线粒体功能障碍疾病的影响。精细的超微结构研究已经证明，骨骼肌中的线粒体紧密堆积，并以与肌体单位相关的定型方式排列(绪方和山崎，1997年). 这种独特的组织结构和明显有限的流动性引发了线粒体动力学在这种细胞类型中是否重要的问题。

为了解决这些问题，我们检查了骨骼肌中缺乏线粒体融合蛋白功能的小鼠，发现这些小鼠会发展成致命的线粒体肌病。此外，我们发现线粒体融合通过几种不同的机制保护线粒体DNA功能。它维持线粒体DNA水平，保持线粒体DNA保真度，并使细胞能够耐受高水平的线粒体DNA突变。

结果

丝裂原融合蛋白Mfn1和Mfn2在骨骼肌中的作用

鉴于线粒体在骨骼肌中的独特排列，我们研究了线粒体融合是否在这种细胞类型中发挥重要作用。我们特别破坏了线粒体融合基因Mfn1公司和Mfn2公司在骨骼肌中，使用MLC-Cre转基因小鼠(Bothe等人，2000年). 这个MLC1f公司驱动Cre重组酶的启动子在分化的快收缩肌细胞中表达，而在肌细胞中不表达(Lyons等人，1990年). 令人惊讶的是，这种双突变小鼠（MLC-Cre/dm）被严重奔跑，体重仅为对照鼠的30-50%(表1)在6-8周龄前死亡。相反，其他基因型组合的小鼠（包括Mfn1公司−/− Mfn2公司+/−和Mfn1型+/− Mfn2公司−/−)存活下来并长到正常大小。

表1

7-8周龄MLC/dm小鼠的生理测量

测量双突变体控制P值
体重（雌性）11±2.6克，n=223±2.1克，n=6<0.0001
体重（雄性）10±2.4克，n=1130±3.6克，n=11<0.0001
体温35±1.1摄氏度，n=1037±0.3摄氏度，n=20<0.0001
非预测血糖50±14 mg/dL，n=2143±13 mg/dL，n=7<0.0001
空腹血糖26±2.8 mg/dL，n=278±12 mg/dL，n=10=0.0002
静息血清乳酸5.7±1.7 mmol/L，n=73.9±1.2 mmol/L，n=9=0.02
运动后乳酸9.5±2.3毫摩尔/升，n=54.7±0.65 mmol/L，n=5=0.002

测量值为数值±标准偏差。采用非配对t检验计算P值。对照组为双突变动物的混合基因型窝友。显示每次测量的动物数量（n）。

MLC-Cre/dm小鼠表现出严重的生理异常。他们在空腹和非空腹条件下表现出低血糖水平，体温降低(表1). 此外，我们在MLC-Cre/dm小鼠的血清中发现了高水平的乳酸，在运动组后最为明显，但在休息状态下也很明显。这些深刻的代谢异常表明，由于糖酵解而非氧化磷酸化的主要使用，葡萄糖在没有足够能量产生的情况下快速周转。

线粒体融合蛋白缺乏肌肉的线粒体缺陷

在肌肉的大体检查中，很明显MLC-Cre/dm小鼠的肌肉较小，比对照肌肉的红色更深(图1A)，表明线粒体质量增加。胫骨前肌（TA）的电子显微镜证实了这一解释，TA主要由快速抽搐纤维组成。在纵切面上，7周大的野生型骨骼肌显示出紧密并列的肌原纤维阵列，这些肌原纤维极为均匀且精确排列(图1C). 与先前对肌肉纤维结构的超微结构研究一致(绪方和山崎，1997年)，线粒体通常成对存在，位于每个I带的Z盘两侧。相反，7周龄MLC-Cre/dm肌肉中的线粒体分裂成圆形球体，其他缺乏线粒体融合的细胞中也有发现(Chen等人，2003年;Chen等人，2007年;Chen和Chan，2005年). 此外，在肌原纤维之间的空隙中有大量紧密堆积的线粒体(图1D). 这些线粒体聚集体充满纤维间间隙，破坏肌原纤维阵列的排列。我们还观察到4周大的双突变体肌肉中线粒体的增殖，尽管增长幅度较小，并且线粒体含量正常的区域得以保留(图S1). 弓状膜下间隙同样存在高度显著的线粒体堆积(图1I，J)类似于线粒体DNA突变引起的线粒体肌病的破烂红色纤维(迪莫罗和肖恩，2003年). 此外，突变肌肉中的纤维间线粒体和肌膜下线粒体都显示出典型的超微结构功能障碍迹象：它们肿胀，很少含有野生型线粒体所特有的致密嵴膜(图1E、F). 显微照片的定量显示，MLC-Cre/dm肌肉中线粒体的面积是野生型肌肉的几倍(图1B). 相反，肌肉只承载一个Mfn公司等位基因表现出较温和的组织学缺陷(图1B、G、H)偶尔出现异常线粒体斑块Mfn1型−/− Mfn2公司+/−肌肉(图1G).

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7周龄MLC-Cre/dm肌肉的线粒体缺陷

（A） 全套腓肠肌。双突变体肌肉（右）较小且呈深红色。（B）所示基因型肌肉线粒体面积的量化。线粒体所占面积是从至少10个具有代表性的电磁场中测量出来的，并归一化为野生型肌肉中线粒体所占的面积。星号（P<0.0003，未配对t检验）表示显著变化。（C–J）胫骨前（TA）纵切面的电子显微镜。标签：s，肌节长度；Z、 Z盘；m、 线粒体。（C、E和I）野生型。（D、F和J）百万分之一双突变体。（G）Mfn1公司−/−,Mfn2公司+/−.（H）Mfn1公司+/−,Mfn2型−/−（I和J）肌膜下线粒体。比例尺：C–F、I和J中0.5μm；G和H中为1μm。另见图S1.

鉴于线粒体功能障碍的生理和超微结构证据，我们使用细胞色素组织化学染色c（c）氧化酶（COX，复合物IV，棕色染色）和琥珀酸脱氢酶（SDH，复合物II，蓝色染色）活性直接评估呼吸复合物的功能。在1周龄和2周龄野生型小鼠的肌肉切片中，所有肌肉纤维都显示出均匀的COX染色(图2A、C). 在接下来的几周内，由于线粒体活性不同的特定肌纤维类型的分化，这逐渐成熟为成人肌肉的棕色棋盘状外观(图2E、G). 在MLC-Cre/dm肌肉中，染色模式在第1周是正常的，但在第2周出现轻度异常模式，一些纤维染色呈淡蓝色，表明SDH增加，COX活性降低(图2D，箭头）。这种异常的组织学模式在第4周和第7周变得非常明显，此时许多深蓝色纤维明显(图2F、H). 在人类线粒体脑肌病中，这种典型的蓝色组织学模式经常出现在因线粒体DNA缺陷导致的呼吸功能障碍病例中(迪莫罗和肖恩，2003年;泰勒和特恩布尔，2005年)，因为SDH活性仅由核基因组编码，而COX活性依赖于线粒体基因组。SDH染色增加与EM观察到的线粒体积累增加一致(图1B、D、J). 此外，在4周和7周时，双突变体肌纤维的直径明显较小。由于未发现纤维数量减少（数据未显示），因此这种较小的纤维尺寸是肌肉尺寸整体减小的原因。相反，Mfn1公司−/− Mfn2公司+/−和Mfn1公司+/− Mfn2公司−/−肌肉表现出正常的COX/SDH染色模式、正常的纤维大小，并且没有呼吸缺陷的系统性指标(图2I，J). 因此，在MLC-Cre/dm小鼠中发现的严重缺陷并不是由于Mfn2与Mfn1的特定功能所致。

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MLC Cre/dm肌呼吸功能缺损的时间分析

TA肌横切面进行组织化学染色，检测COX（棕色）和SDH（蓝色）活性。（A、C、E和G）野生型肌肉。（B、D、F和H）双突变体肌肉。蓝色染色表明线粒体功能障碍。注意D中的淡蓝色纤维（箭头）和F和H中的深蓝色纤维的初始外观。显示了样品的年龄。（I和J）显示肌肉的基因型和年龄。放大400倍。另请参见图S2.

丝裂原融合蛋白的丢失也导致骨骼肌纤维类型的组成发生显著变化。MLC-Cre/dm胫骨前肌肌球蛋白重链2A（氧化型IIA纤维的标志物）阳性纤维的比例增加，快速抽搐型IIB纤维的比例相应减少(图S2). 这些结果与线粒体生物发生可以驱动肌纤维类型转换的报道一致(Arany等人，2007年;Lin等人，2002年).

线粒体毒素对线粒体DNA的稳定性和保真度很重要

鉴于MLC-Cre/dm小鼠线粒体肌病的组织学和生理学特征，我们研究了线粒体融合与线粒体DNA拷贝数之间的关系。值得注意的是，我们发现，来自双突变小鼠的7-8周龄肌肉每个核基因组仅包含约250个mtDNA拷贝，而来自年龄匹配的对照组的肌肉每个核基因包含约3500个mtDNA(图3A). 具有任一等位基因的小鼠Mfn1公司或Mfn2公司7-8周时mtDNA水平正常(图3A)及以后(图S3A).

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肌肉和MEF线粒体DNA的定量分析

（A） 分析7-8周TA肌肉中每个核基因组的线粒体DNA拷贝数。对照包括野生型，Mfn1公司+/−、和Mfn2公司+/−双突变体的室友。P=0.0002。（B） 双突变体TA肌肉线粒体DNA缺失的时间分析。显示了样品的年龄。P<0.008。图例表示（A）和（B）的基因型。（C） MEF中的线粒体拷贝数。显示基因型。P<0.0001。（D） 线粒体DNA水平的恢复百万分之一双空单元格。在感染表达丝裂原-DsRed（模拟）的逆转录病毒的突变细胞中测量MtDNA水平，Mfn1公司或Mfn2公司感染后2周和4周对线粒体进行分析。P<0.0001。在所有面板中，星号表示与对照相比的统计学显著变化，误差条表示3-5只动物或实验的标准偏差。为了获得单个DNA样本的mtDNA水平，进行了四次定量PCR。P值是通过未配对t检验获得的。另请参见图S3.

为了确定线粒体DNA缺失与肌纤维缺陷之间的时间关系，我们分析了年轻MLC-Cre/dm肌肉中的线粒体DNA水平(图3B). 即使在最早的时间点，即1周大的时候，我们在MLC-Cre/dm肌肉中测得的线粒体DNA水平也明显低于对照组的同窝伙伴。由于野生型肌肉中mtDNA含量的快速增加，MLC-Cre/dm和野生型肌肉之间mtDNA水平的差异在接下来的几周内扩大。相比之下，突变肌肉中的线粒体DNA在出生后的发育过程中无法膨胀。因为这种线粒体DNA缺失在线粒体严重功能障碍的组织学证据之前变得明显(图2)，很可能是突变体中mtDNA水平的降低，至少部分是后来观察到的肌肉病理学的基础。

我们在缺乏Mfn1和Mfn2的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中进行了类似的mtDNA丢失观察(图3C)与这些细胞呼吸能力受损相一致(Chen等人，2005年). 相比之下，只有部分融合缺陷的MEF(Mfn1公司−/−或Mfn2公司−/−细胞）含有正常水平的线粒体DNA(图3C)并正常呼吸(Chen等人，2005年). 重要的是Mfn1公司或Mfn2公司在里面Mfn公司-双空MEF快速将mtDNA恢复到野生型水平(图3D)再次强调Mfn1和Mfn2共同的线粒体融合功能是导致缺陷的原因。此外，我们发现OPA1（作战行动1）-空细胞，缺乏线粒体内膜的融合，但擅长外膜融合(Song等人，2009年)，也显示mtDNA缺失(图3C)这表明基质室缺乏混合是导致融合缺陷细胞线粒体DNA丢失的最终原因。

为了进一步探索线粒体融合和线粒体DNA之间的联系，我们通过筛选线粒体DNA的点突变和缺失来询问线粒体基因组的保真度。我们发现7-8周龄MLC-Cre/dm小鼠的肌肉线粒体DNA点突变增加了5倍(图4A)删除量增加了14倍(图4C)与野生动物相比。我们通过询问线粒体基因组中的其他基因座，证实了这两种测量结果(图4B、D). 在双突变和野生型组织中，大多数缺失发生在短同源重复序列之间，而在双突变小鼠中，单碱基对替换谱发生了变化(图S4B、C).

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线粒体DNA突变的定量分析

（A–D）通过随机突变捕获分析定量TA肌肉中的mtDNA突变。基因型图例适用于面板A–D。误差线表示3-5只动物的标准偏差。星号表示与对照组相比在统计上有显著变化。P值是通过未配对t检验获得的。（A，B）量化两个独立位点的每个碱基对的点突变频率。P=0.03英寸（A）；P=0.05英寸（B）。（C，D）两个独立位点每个线粒体DNA基因组缺失频率的量化。在（C）中，年轻肌肉（7-8周）P=0.01，老年肌肉（8-13个月）P=0.02。在（D）中，年轻肌肉P=0.0003，老年肌肉P=0.04。总的来说，大约有2.5亿碱基对被筛查为点突变，7亿基因组被筛查为缺失。（E） 所示基因型10月龄骨骼肌mtDNA Solexa测序中mtDNA缺失事件表。“断点重复”表示涉及6–14个碱基对的直接重复的删除次数。另请参见图S4和表S1.

因为线粒体突变随着年龄的增长而积累(Vermulst等人，2007年;Vermulst等人，2008年a)，我们还检测了携带单等位基因的老年动物的线粒体DNAMfn1公司或Mfn2公司值得注意的是，我们发现8-13个月大的婴儿的肌肉组织Mfn1公司−/− Mfn2公司+/−小鼠mtDNA缺失增加约80倍（2.3×10−5/基因组）与对照肌肉（2.8×10−7/基因组）(图4C). 独立现场的分析证实了这一增长(图4D). 然而，我们发现点突变频率或线粒体DNA拷贝数在Mfn1公司−/− Mfn2公司+/负极或Mfn1公司+/− Mfn2公司−/−肌肉(图S3A、S4A)这表明线粒体DNA缺失产生的机制对线粒体融合的减少更为敏感。

为了以全基因组、无偏见的方式进一步证实mtDNA缺失增加的发现，我们分析了10个月野生型和Mfn1公司−/− Mfn2公司+/−Solexa测序肌肉。对于每个样本，我们获得了75个核苷酸序列，总的来说，分别包含3675万和4.425亿碱基对的mtDNA。读取的每个序列的两端都映射到mtDNA基因组上，并选择末端映射到不同位置的序列作为缺失的候选序列。为了尽量减少人为删除的可能性，我们只考虑了由4个或更多独立序列读取确定的删除(图4E). 在野生型肌肉中，我们没有发现这种缺失。相比之下Mfn1公司−/− Mfn2公司+/−该样本包含9个不同的缺失，通过62个独立的序列读取进行识别，因此代表了62个缺失事件。在每种情况下，断点连接发生在6–14个核苷酸的重复之间(表S1)，与我们之前的删除断点序列分析一致(图S4C). 这9个缺失可能在线粒体融合蛋白缺陷小鼠的mtDNA基因组中包含特别脆弱的区域。

先前的结果表明，融合缺陷细胞的线粒体群体在膜电位和线粒体DNA核仁的存在方面是异质的(Chen等人，2007年;Chen等人，2005年). 为了扩展这一发现，我们检查了Mfn公司-双空细胞在蛋白质含量上具有普遍的异质性。线粒体蛋白质组不平衡可能导致线粒体DNA不稳定，因为参与线粒体DNA代谢的蛋白质的精确化学计量可能对线粒体DNA的稳定性和保真度很重要。因此，我们定量分析了野生型和Mfn公司-细胞色素双零MEF免疫染色c（c）和hsp60，两种丰富的线粒体蛋白(图S3B、C). 在突变MEF中，细胞色素的信号强度比c（c）与hsp60相比，线粒体群体内的差异显著大于野生型细胞(图S3D、E). 这种增加的方差非常显著，导致双突变MEF中两个荧光团的相关系数降低（P=0.0001，n=10）。在线粒体基质中表达三种荧光蛋白时发现了类似的异质性（数据未显示）。这些观察结果表明，在没有内容混合的情况下，线粒体蛋白质组可能会变得不平衡。

易出错mtDNA聚合酶与Mfn1缺失之间的合成致死性

我们扩大了研究范围，以研究线粒体动力学和线粒体DNA突变之间的关系。有人提出，线粒体融合可能是哺乳动物细胞耐受高载量致病线粒体DNA的显著能力的基础(Nakada等人，2009年;Nakada等人，2001年). 为了测试这个想法，我们生成了Mfn1型−/−携带纯合子等位基因的小鼠波尔加D257A型. The波尔加D257A型敲除等位基因编码线粒体DNA聚合酶，其校对域缺失，导致细胞以加速的速度积累线粒体DNA突变(Kujoth等人，2005年;Trifunovic等人，2004年). 值得注意的是，无论哪一种都有单个突变体Mfn1公司或波尔加存活到成年后，这两种突变的结合导致了合成新生儿死亡(表2). 此外，波尔加D257A型杂合子小鼠，其突变负担也增加(Vermulst等人，2007年)，在缺乏Mfn1公司也。The synthetic lethality of波尔加D257A/D257AMfn1公司−/−小鼠并不是由于突变率增加，因为我们检测到在突变频率上没有显著差异波尔加D257A/D257A和波尔加D257A/D257AMfn1公司−/−胚胎(图S5). 测试两者之间类似的合成相互作用会很有趣波尔加D257A型和删除Mfn2公司然而，这种互动更难评估，因为Mfn2公司导致严重的神经退行性疾病，导致早期死亡(Chen等人，2007年).

表2

携带波尔加D257A型等位基因Mfn1公司背景不足。

PolgA基因型Mfn1基因型实际老鼠数量实际频率（%）预期频率（%）
+/++/+4876.25
+/++/−811212.5
+/+−/−3156.25
D257A型/++/+991512.5
第257页/++/−2073225
D257A型/+*−/−51812.5
D257A/D257A+/+3456.25
D257A/D257A+/−1021612.5
D257A/D257A**−/−106.25

将所示基因型的小鼠制成表格。采用卡方检验比较观察人群和预期人群。

*P=0.0003，
**P<0.0001。

为了在细胞水平上检验这种协同作用，我们建立了MEF并测量了它们的呼吸能力和ATP生成。氧极谱法显示极化AD257A/D257AMfn1公司−/−单元格与控件的比较(图5A). 这些耗氧率与ATP生成的动力学测量密切相关(图5B)，使用波尔加D257A/D257AMfn1型−/−细胞只产生野生型细胞中ATP含量的2.7%。为了确定呼吸链的特定部分是否受到影响，我们测量了基质驱动的耗氧量。最严重的缺陷出现在呼吸复合物I（减少20倍），而复合物III（4倍）和IV（2倍）的减少不太严重(图5C). 复合物I的严重减少可能是整体呼吸下降的主要原因，因为这些细胞中的大多数呼吸是通过复合物I进行的，并且对复合物I抑制剂鱼藤酮敏感。复合物I缺陷的严重性波尔加D257A/D257AMfn1公司−/−细胞可能反映了这样一个事实，即复合物I中存在7个mtDNA编码的亚单位，远远多于任何其他呼吸复合物。因此，复合物I比其他复合物更有可能因容易出错的PolgA导致线粒体DNA突变而失活D257A型功能。这些结果强调了混合线粒体网络对改善线粒体DNA突变的破坏作用的重要性。

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MEF中的氧极谱和ATP生成

（A） 所示基因型MEF的呼吸速率。内源性呼吸是未处理细胞的耗氧率，最大呼吸是添加解偶联剂二硝基苯酚后的耗氧率。显示了3个实验的标准偏差。（B） 通过复合物I产生ATP。使用基于荧光素酶的分析在1×106渗透细胞。指出了3个实验的标准偏差。（C） 所示基因型MEF的底物驱动呼吸速率。测定了底物谷氨酸/苹果酸（复合物I）、琥珀酸/G3P（复合物III）和TMPD/抗坏血酸（复合物质IV）驱动的耗氧速率。显示了两个实验的标准偏差。在所有面板中，与野生型相比，单星号（P<0.05）和双星号（P<0.01）代表显著变化。另请参见图S5.

讨论

我们的研究提供了对体内哺乳动物线粒体融合的功能。线粒体融合在骨骼肌纤维中起着至关重要的作用，尽管其亚细胞结构紧凑，线粒体位置精确。在没有线粒体融合的情况下，出现了一种与人类线粒体肌病惊人相似的病理特征，尤其是与线粒体DNA缺失综合征相关的(科普兰，2008年).

我们的研究表明线粒体融合通过三种不同的途径保护线粒体DNA的功能。首先，线粒体动力学通过稳定线粒体DNA拷贝数来维持细胞健康。在芽殖酵母中，丝裂原融合蛋白Fzo1的丢失导致线粒体DNA的快速完全丢失(赫尔曼等人，1998年;Rapaport等人，1998年)导致呼吸功能丧失。相反，哺乳动物线粒体融合蛋白或OPA1的缺失只会导致线粒体亚群中线粒体DNA核仁的丢失(Chen等人，2007年). 在这里，我们表明，核仁的这种不均匀分布至少部分是由长期线粒体DNA缺失引起的。线粒体DNA水平在2个月时显著降低至野生型水平的7%，这可能是在线粒体融合蛋白缺陷小鼠中观察到的线粒体肌病的关键原因。与线粒体DNA耗竭的病因一致，线粒体DNA水平的降低早于明显的肌肉纤维功能障碍的组织学证据。此外，虽然野生型肌肉在出生后1至7周表现出线粒体DNA的快速增加，但线粒体融合蛋白缺乏的肌肉不能增加线粒体DNA水平(图3)表明线粒体DNA复制可能存在缺陷。为了进行比较，MLC-Cre/Tfam公司缺乏参与线粒体DNA包装、转录和复制的关键DNA结合蛋白的小鼠在4个月大时线粒体DNA水平保持在30%以上(Wredenberg等人，2002年). 因此，MLC-Cre/dm小鼠为与线粒体肌病相关的人类线粒体DNA缺失综合征提供了动物模型(科普兰，2008年). 然而，我们并不认为线粒体DNA缺失仅仅是突变肌肉线粒体功能障碍的原因；很可能无法混合线粒体内容物会进一步破坏线粒体功能。

其次，我们发现骨骼肌线粒体融合缺失导致线粒体DNA点突变和缺失增加。在双突变小鼠中，突变的绝对水平太低，无法解释严重的生理缺陷。相比之下，双突变小鼠的线粒体DNA点突变增加了几倍，而波尔加D257A/D257A突变小鼠有2-3个数量级的增加(Vermulst等人，2007年). 在旧的Mfn1公司突变小鼠的mtDNA缺失水平与波尔加D257A/D257A老鼠(Vermulst等人，2008年a). 虽然它们与生理表型的关系尚不清楚，但这些点突变和缺失的显著增加证明了线粒体融合对线粒体DNA保真度的重要性。有趣的是，一些由线粒体融合基因OPA1功能障碍引起的显性视神经萎缩病例与呼吸不足的肌肉纤维和线粒体DNA缺失的积累有关(Amati-Bonneau等人，2008年;Hudson等人，2008年).

线粒体DNA突变的积累可能由多种机制驱动。原则上，线粒体DNA突变的积累可能是由于线粒体DNA损伤的增加，修复受损线粒体DNA的失败，或者线粒体DNA受损后清除线粒体的失败。我们的发现百万分之一-双空细胞具有从一个线粒体到另一个线粒体的巨大蛋白质异质性，提供了一种可能参与这些过程的合理机制。如果蛋白质化学计量失衡，对线粒体DNA复制、维护、修复和清除至关重要的蛋白质复合体可能会运行效率低下或保真度较低。我们预计，未来的研究将揭示导致线粒体DNA不稳定的其他机制。

线粒体融合和线粒体DNA保真度之间的联系的证明提出了线粒体融合在与线粒体DNA突变相关的条件下是否起保护作用的问题。例如，与年龄相关的神经变性和肌肉萎缩与线粒体DNA突变密切相关(Chomyn和Attardi，2003年;Krishnan等人，2007年). 研究人类线粒体融合是否是影响线粒体DNA突变发生率的一个修饰因子将是一件有趣的事情。

最后，我们发现Mfn1的丢失与容易出错的线粒体DNA聚合酶不相容，这表明线粒体融合可以显著降低预先存在的线粒体DNA突变的有害影响，从而保护呼吸功能。含有波尔加D257A/D257A和Mfn1公司−/−突变表明一种关键的细胞类型已经受损。先前的实验表明，Mfn1和Mfn2在线粒体融合中起着很大的冗余作用，而这两种蛋白质的表达模式往往决定了哪种组织会受到任一基因缺失的选择性影响(Chen等人，2003年;Chen等人，2007年;Chen等人，2005年). 因此，受影响的细胞波尔加D257A/D257AMfn1公司−/−小鼠Mfn1的表达可能高于Mfn2。或者，它们可能对线粒体功能的变化非常敏感，并可能受到任一丝裂原融合蛋白缺失的影响。

我们的发现可能适用于由mtDNA点突变和缺失引起的线粒体脑肌病的发病机制。这类疾病通常表现出“阈值效应”，因为只有当特定细胞系中致病性mtDNA水平突破临界水平时，临床症状才会显现(迪莫罗和肖恩，2003年;Rossignol等人，2003年). 根据对患者样本和实验杂交的研究，线粒体DNA缺失的阈值水平约为60%，而点突变的阈值可能高达90%(Rossignol等人，2003年;Chomyn，1998年;Chomyn等人，1992年). 有人提出，线粒体融合通过内容混合，使具有不同突变的线粒体基因组相互补充，从而对线粒体DNA突变提供保护(Nakada等人，2009年;Nakada等人，2001年). 即使单个线粒体内的基因组没有物理上的相互作用，这种互补也是可能的(Gilkerson等人，2008年). 我们的结果为这一假设提供了有力的实验支持，并表明线粒体融合可能改善遗传性mtDNA脑肌病的临床严重程度。在未来的工作中，重要的是要解决线粒体融合是否对与年龄相关的线粒体DNA缺失起到类似的保护作用，这种缺失同样只会在克隆扩增到较高水平时导致细胞功能障碍(Bender等人，2006年;Kraytsberg等人，2006年;Wanagat等人，2001年).

实验程序

小鼠繁殖与生理实验

MLC-Cre/dm小鼠和同窝对照小鼠是通过杂交MLC-Cre、，Mfn1公司+/−,Mfn2型+/−鼠标至Mfn1公司液氧磷/液氧磷,Mfn2公司液氧磷/液氧磷老鼠。波尔加,Mfn1公司动物是通过杂交繁殖的波尔加D257A型/+、Meox2-Cre、，Mfn1公司+/−鼠标至波尔加D257A型/+,Mfn1型液氧磷/液氧磷老鼠。这个Mfn1公司突变体(Chen等人，2003年;Chen等人，2007年),Mfn2公司突变体(Chen等人，2003年;Chen等人，2007年),波尔加D257A型突变体(Kujoth等人，2005年)、MLC-Cre(Bothe等人，2000年)和Meox2-Cre小鼠(塔尔奎斯特和索里亚诺，2000年)前面已经描述过。

对7-8周龄的小鼠进行生理学测量。使用Thermalert监测温度计TH-5（Braintree Scientific），用直肠探针测量体温。使用OneTouch Ultra2血糖监测系统（LifeScan）从尾静脉滴下一滴血，测量血糖水平。为了获得乳酸测量值，对用阿维汀麻醉的小鼠进行眼出血，并使用iSTAT系统（Abbott）在CG4+药筒中分析血液。小鼠在麻醉前在37°C下游泳20分钟。所有实验都得到了加州理工学院动物护理和使用委员会的批准。

组织学和EM分析

TA肌肉用于组织学分析，因为该肌肉含有高百分比的快速抽搐纤维，可表达MLC-Cre。对于COX/SDH染色，将新鲜解剖的肌肉包埋在最佳切割温度（OCT）化合物（Tissue Tek）中，并在液氮中冷冻。载玻片进行COX活性染色、水洗、SDH活性染色、清洗并安装在GelMount（Biomeda）中。染色方案来自华盛顿大学神经肌肉疾病中心网站(http://www.neuro.wustl.edu/neuromussar/index.html).

对于EM，用3%多聚甲醛、1.5%戊二醛、100 mM二羧酸盐（pH7.4）和2.5%蔗糖灌注小鼠。TA在切除前系在牙签夹板上，固定在伸出的位置。将夹板固定的肌肉固定1小时，然后按照前面所述进行处理和成像(Chen等人，2007年).

为了分析肌纤维类型，对新鲜冷冻的TA肌肉进行横向冷冻切片，并用小鼠IgG1抗MHC2A（ATCC HB-277）或小鼠IgM抗MHC2B（ATCC乙肝-283）进行免疫染色。使用Cy3-羊抗鼠（Jackson ImmunoResearch）或Alexa Fluor 555-goat抗鼠IgM（Invitrogen）作为次级抗体。

细胞培养和呼吸测量

先前建立的MEF保存在补充有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM；Invitrogen）中(Mfn公司-双null和OPA1（作战行动1）-空白细胞）或10%小牛血清（野生型，Mfn1公司−/−、和Mfn2公司−/−单元格）。用于极谱的MEF来源于e12.5胚胎，用表达SV40大T抗原的逆转录病毒感染以促进永生化，并保持在DMEM、10%胎牛血清、1mM丙酮酸盐和50μg/ml尿苷中。

如前所述，使用克拉克氧电极（氧气记录仪、汉萨泰克仪器）测量完整细胞中的耗氧量(Chen等人，2005年;维拉尼和阿塔迪，2001年). 基底驱动的耗氧量基本上如所述进行了测量(Duan等人，2003年)进行了以下修改。省略了呼吸缓冲液I中的第一次清洗，使用琥珀酸和甘油-3-磷酸通过络合物III驱动呼吸，并在呼吸缓冲液Ⅰ中测量N，N，N′，N′-四甲基对苯二胺二盐酸盐（TMPD）驱动的呼吸，而不是呼吸缓冲液Ⅱ。底物和抑制剂浓度如下：5 mM谷氨酸、5 mM苹果酸、200 nM鱼藤酮、5 mC琥珀酸、5 M M甘油-3-磷酸、12 nM抗霉素、400μM TMPD和10 mM抗坏血酸。

为了测量ATP生成，细胞生长到80%的汇合点，收获，用50μg/ml洋地黄素渗透1分钟，然后再悬浮在反应缓冲液中（150 mM KCl、25 mM Tris-HCl、0.4 mM EDTA、0.1%BSA、10 mM磷酸钾、0.5 mM MgCl2和0.15 mM P1、P5-di（腺苷）五磷酸）。添加0.25 mM三乙酸盐、40 nM荧光素和1μg/ml荧光素酶后，在1×106每次测量的细胞数，在1 mM苹果酸和1 mM丙酮酸存在下，添加或不添加2μg/ml鱼藤酮。减去鱼藤酮存在时的ATP测量值，得出通过复合物I产生ATP的结果。

如前所述，通过逆转录病毒转导在MEF中表达Mfn1或Mfn2(Chen等人，2003年). 这两种Mfn结构的过度表达都是内源性Mfn水平的10倍以上，并且发现了唯一的线粒体定位，这与以前的研究一致(Chen等人，2003年;Chen等人，2005年;Detmer和Chan，2007年b).

DNA分离

为了分离线粒体DNA，首先对细胞或组织进行均质化，并根据之前公布的方案分离出线粒体部分(Frezza等人，2007年). 然后在含有0.5%SDS和0.2 mg/ml蛋白酶K的10mM Tris-HCl、0.15M NaCl和0.005M EDTA中溶解线粒体(Vermulst等人，2008b). 然后通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀纯化MtDNA。使用标准方案分离总DNA。

MtDNA定量

为了量化每个核基因组中mtDNA的数量，我们使用了以下引物：

  • mtDNA正向引物CCTATCCCTTGCCAT；
  • mtDNA反向引物，GAGGCTGTGCTTGTGAC。

为了量化核DNA，我们使用了一组检测6号染色体上Pecam基因的引物：

  • 核DNA正向引物ATGGAAGCCTGCCATG；
  • 核DNA反向引物TCCTTGTTGTTCAGCATCAC。

通过分析线粒体DNA和核DNA之间的阈值扩增差异（δ-δC（t）法），以及使用参考模板的标准曲线进行分析，对相对拷贝数差异进行量化。这两种方法提供了相同的结果。

MtDNA突变分析

如前所述进行随机突变捕获分析(Vermulst等人，2008b). 简单地说，mtDNA用TaqI消化5小时，每小时添加100单位TaqI。然后将MtDNA稀释成96孔格式，并用TaqI限制位点两侧的引物进行探测，以检测TaqI限定位点中包含突变的MtDNA基因组。第二对引物用于确定被询问的线粒体DNA基因组数量。PCR步骤如下：步骤1，37°C，10分钟；步骤2，95°C，持续10分钟；步骤3，95°C持续30秒；第4步，58/60°C持续1分钟；第5步，72°C持续1.5分钟；第6步，执行第三步44次；第7步，72°C持续4分钟；第8步，从65°C到95°C的熔化曲线；第9步，无限期保持在4°C。使用Brilliant SYBR-绿色I主混合液（Stratagene）进行25μl反应中的PCR反应，该主混合液含有10 pM正向和反向引物和1单位尿嘧啶DNA糖基化酶。以下引物用于DNA扩增：

  • MtDNA控制引物正向CCTATCCCTTGCCAT；
  • MtDNA控制引物反转（GAGGCTGTGTGAC）；
  • Taq634正向侧翼的MtDNA引物ACTCAAGGACTTGGCGGTA；
  • Taq634反向侧翼的MtDNA引物，AGCCATTTCTCCCATTTC；
  • Taq7667正向侧翼的MtDNA引物，AATTTCATCTGAAGACGTCCT C；
  • Taq7667反向侧翼MtDNA引物，AACGCTCTTAGCTTCATAGTGA；
  • MtDNA缺失正向位点1，CAAGGCACACACTCCTAT；
  • MtDNA缺失反向位点1，GCTTCCGAATGCTAGGCGTT；
  • MtDNA缺失前向位点2，ACTGACTTTCCAATTAGATTCTTG；
  • MtDNA缺失反向位点2，GAGAGATTTATGTGTAATGC。

所有推测的突变均通过测序和TaqI消化验证。

Solexa测序在加州理工学院基因组设施进行。根据制造商的说明构建mtDNA文库，并获得75个核苷酸的配对末端序列读数。为了确定候选缺失，每个读取的序列被修剪为70个核苷酸，并且使用程序Bowtie将每个末端的15个核苷酸映射到小鼠mtDNA基因组。末端映射到线粒体DNA基因组不同区域的序列读取被检索为候选缺失。使用该算法，可以识别序列读取的中心40个核苷酸区域内发生的缺失。然后手动验证候选删除。为了将假阳性率降到最低，分析中只包括由4个或更多独立读数确定的缺失。

补充材料

01

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02

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03

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致谢

我们感谢S.Burden博士和P.Soriano博士慷慨提供MLC-Cre和Meox2-Cre小鼠菌株。我们感谢加州理工学院基因组设施主任Igor Antoshechkin对Solexa序列数据分析的帮助。这项工作得到了DCC（R01赠款GM062967和埃里森医学基金会高级学者奖）和JMM（NCRR赠款1 S10 RR023454-01）的资助。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们提供这份手稿的早期版本。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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