Mitochondrial nucleoids maintain genetic autonomy but allow for functional complementation

doi:10.1083/jcb.200712101

.2008年6月30日；181(7):1117-28.

doi:10.1083/jcb.200712101。 Epub 2008年6月23日。

线粒体核仁维持遗传自主性，但允许功能互补

罗伯特·吉尔克森¹, 埃里克·A·肖恩, 伊夫林·埃尔南德斯, 怜悯M戴维森

附属公司

PMID： 18573913
预防性维修识别码： PMC2442202型
内政部： 10.1083/jcb.200712101

线粒体核仁维持遗传自主性，但允许功能互补

罗伯特·吉尔克森等。 J细胞生物学. 2008.

.2008年6月30日；181(7):1117-28.

doi:10.1083/jcb.200712101。 Epub 2008年6月23日。

作者

罗伯特·吉尔克森¹, 埃里克·肖恩, 伊芙琳·埃尔南德斯, 怜悯M戴维森

附属

¹美国纽约州纽约市哥伦比亚大学内科和外科学院神经病学系，邮编10032。

PMID： 18573913
预防性维修识别码： PMC2442202型
内政部： 10.1083/jcb.200712101

摘要

线粒体DNA（mtDNA）被包装成称为核仁的DNA-蛋白质组合体，但线粒体DNA通过核仁繁殖的方式仍有争议。有人提出了两种机制：核仁可以始终忠实地保持其mtDNA含量，或者核仁可以动态交换mtDNA。为了直接测试这些模型，融合了两个细胞系，每个细胞系都是部分缺失的线粒体DNA的同质性，其中缺失不重叠，并且每个细胞系的线粒体蛋白合成都不足，从而首次在类核水平明确显示了两个线粒体DNA。这两个mtDNA转位互补以恢复线粒体蛋白质合成，但始终保持在不稳定混合的离散核仁中。这些结果表明线粒体核仁紧密调节其遗传含量，而不是自由交换线粒体DNA。除了促进消除有害线粒体DNA突变的治疗方法外，这种遗传自主性还提供了一种解释线粒体遗传模式的分子机制。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**mtDNA和实验设计。**（A）讨论了mtDNA的线性化地图。WT人类mtDNA显示在顶部。FLP和CWΔ-mtDNA如下所示。白色方框表示每个Δ-mtDNA的删除区域。红框表示CWΔ-mtDNA FISH探针的位置和大小。绿框表示FLPΔ-mtDNA FISH探针的位置和大小。（B）细胞融合实验示意图。FLPΔ和CWΔ同质细胞系在PEG存在下融合，使其恢复，并置于尿嘧啶培养基中选择线粒体功能。同质FLPΔ（绿色）和CWΔ（红色）核仁显示为每个核仁有四到五个mtDNA拷贝。显示了两种互补模型：忠实模型，其中每个Δ-mtDNA（仅红色或仅绿色）在同质核仁中保持彼此分离；动态模型，其中Δ-mt DNA在核仁之间交换，导致异质核仁（红色加绿色）。

**图2。**
**杂交细胞系的mtDNA分析。**（A）线粒体DNA的长距离PCR。Lanes表示从所示细胞系的总细胞DNA中提取1 ng模板进行长距离扩增。引物将WT mtDNA分子的nt 3066（正向引物）扩增至nt 812（反向引物），扩增14320 bp，包含两个缺失区域。（B）杂交细胞株总DNA ND4和CO2/3的常规PCR。Lanes表示100 ng模板的PCR反应。（C） FC II 90天细胞的Southern blot分析，包括CW和FLPΔ-mtDNA限制位点的示意图，以及潜在FLP/CW重组分子的示意图。Δ-mtDNA均携带PvuII位点。FLPΔ-mtDNA携带一个SnaBI位点，但不携带Tth111I位点，而CWΔ-mt DNA携带Tth11I位点，但没有SnaBI.用列出的酶消化2μg细胞总DNA，转移到PVDF，并用与人类mtDNA nt 3778–6051对应的DNA进行探测。单线图显示了经过生酮选择、用SnaBI和Tth111I消化并电泳数天的FC II细胞的Southern印迹，以更好地分离FLP和CWΔ-mtDNA线性化分子，以检查是否存在FC重组限制性消化产物（13.7 kb和11.8 kb）两个亲本Δ-mtDNA限制产物的中间产物（FLPΔ-mt DNA，14.7 kb；CWΔ-mtDNA，10.8 kb）。

**图3。**
**培养细胞的双色FISH。**依次采集绿色（FLPΔ-mtDNA）和红色（CWΔ-mt DNA）图像。棒材，20μm。

**图4。**
**杂交细胞系的免疫荧光显微镜。**用抗线粒体编码的MTCO2的抗体对细胞进行免疫标记，用于荧光显微镜检查（绿色）。用线粒体追踪仪（红色）观察线粒体。棒材，20μm。合并中的轮廓框在合并细节中被放大。

**图5。**
**一种新的免疫荧光/FISH联合方法。**（A）首先对细胞进行MTCO2蛋白（蓝色）的免疫标记，随后通过FISH用针对FLPΔ-mtDNA（绿色）和CWΔ-mtDNA（红色）的探针标记mtDNA。缺乏初级抗体和/或FISH探针的指示对照显示出信号特异性。通过共焦显微镜观察细胞。棒，10μm。（B） WT和FC细胞的高分辨率免疫荧光/FISH图像。用常规显微镜观察细胞。棒材，10μm。

**图6。**
**FC细胞融合的时间进程。**（A）在缺乏尿苷的培养基中选择第22天和第32天，通过绿色/红色原位杂交观察FC I细胞的共焦显微镜图像。棒材，20μm。合并中的轮廓框被详细放大。棒，10μm。（B）用常规显微镜通过FISH观察FC II细胞的长期培养。箭头（第120天）表示基本同质细胞中的少数基因型核仁（表一）。棒材，20μm。（C）在选择的第4、22、32、104和274天对FC I细胞进行抗-MTCO2免疫荧光显微镜检查。在Photoshop中徒手添加了几乎没有MTCO2信号的细胞边界。如图5所示，在第22天和第32天检测到Alexa 350（蓝色）山羊抗兔二级抗体，图像通过ImageJ呈假绿色。棒材，20μm。

**图7。**
**FC细胞中的类核分离。**典型的FISH图像，使用传统显微镜进行可视化，用于生成表II中的共定位数据。FLPΔ-mtDNA标记为绿色，而CWΔ-mt DNA标记为红色，合并时同位化显示为黄色。图像J的同位化在最右侧显示为白色，说明像素同时具有明显的红色和绿色信号。WT和ρ⁰还显示了控件。棒材，0.5μm。

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