Quantification of random mutations in the mitochondrial genome

doi:10.1016/j.ymeth.2008.10.008

.2008年12月；46（4）：263-8。

doi:10.1016/j.meth.2008.10.08。 Epub 2008年10月21日。

线粒体基因组随机突变的量化

马克·维尔姆斯特¹, 杰森·比拉斯, 劳伦斯·A·勒布

附属公司

PMID： 18948200
预防性维修识别码： PMC2615251型
内政部： 10.1016/j.methy.2008.10.08

线粒体基因组随机突变的量化

马克·维尔姆斯特等。方法. 2008年12月.

.2008年12月；46(4):263-8.

doi:10.1016/j.meth.2008.10.08。 Epub 2008年10月21日。

作者

马克·维尔姆斯特¹, 杰森·比拉斯, 劳伦斯·A·勒布

附属

¹加利福尼亚理工学院生物系，1200 E California Boulevard，MC114-96，CA 91125，USA。vermulst@caltech.edu

PMID： 18948200
预防性维修识别码： PMC2615251型
内政部： 10.1016/j.methy.2008.10.08

摘要

线粒体DNA（mtDNA）突变有助于许多年龄相关疾病的病理学，包括帕金森病[a.Bender等人，Nat.Genet.38（2006）515，Y.Kraytsberg等人，Nat.Genet.38]，肌肉铸型[J.Wanagat，Z.Cao，P.Pathare，J.M.Aiken，FASEB J.15（2001）322]，以及癌症的转移潜力[K.Ishikawa等人，Science 320（2008）661]。线粒体DNA突变对多种人类疾病的影响使得理解线粒体突变的驱动机制变得越来越重要。为了对线粒体DNA突变的病因学和自然史提供新的见解，我们开发了一种检测方法，可以检测各种组织和实验环境中的线粒体突变[M.Vermulst等人，Nat.Genet.40（2008）4，M.Vermolst等，Nat.Genert.39（2007）540]。该方法称为随机突变捕获分析，依靠单分子扩增检测数百万野生型碱基中的罕见突变[J.H.Bielas，L.A.Loeb，Nat.Methods 2（2005）285]，并可用于分析哺乳动物中单碱基对水平的线粒体突变。

PubMed免责声明

数字

**图1。随机突变捕获分析的概念**
RMC分析利用了塔克一、一种限制酶，用于区分具有WT或突变的DNA分子塔克I限制站点。线粒体DNA消化后塔克一、尝试在塔克I限制站点（红色箭头）。这种PCR反应将只扩增限制位点（红框）中含有突变的DNA分子，使其对切割具有抵抗力。带有WT限制位点（绿色框）的扩增子不再是PCR扩增的模板。然后通过qPCR对这些突变分子进行量化。与限制性位点相邻的第二个qPCR反应对样本中的每个DNA分子进行定量。突变分子与总分子数的比率是突变频率的直接测量值，可用于计算每个碱基对的突变频率。

**图2。随机突变捕获分析示意图**
RMC分析包括4个步骤，细胞器分离、DNA提取、DNA消化和qPCR扩增。为了计算突变频率，mtDNA以96-well格式显示。在上述示例中，将10000个线粒体基因组分子插入到B-H行中。在每个孔中，尝试在塔克我限制网站。图中，9个以红色显示的微孔中含有一个放大的分子。对每一个PCR反应进行测序，证实TaqI限制位点存在突变。A排中从10000份到1份的连续稀释液用于确认每口井中的拷贝数，并对PCR效率进行重要控制。估计每孔1个拷贝（孔A5-A11），一些孔有，一些孔不包含扩增的DNA分子。突变频率可计算如下：；如果每个孔筛选10000个mtDNA拷贝，这相当于每个孔筛选40000个碱基对，因为塔克I位点长4bps，这些碱基对中的任何一个发生突变都会使其抗分裂。本实验共筛选出84口井，共计3.36×10口⁶已筛选个基点。发现9个突变体，突变频率为2.6×10^-6.

**图3。通过用引物对侧翼多个TaqI限制位点，RMC分析的检测流行率可以从点突变向DNA缺失倾斜**
在这个例子中，使用两个引物对用RMC测定法检测mtDNA突变。在A组中，mtDNA突变是用侧翼单个TaqI限制位点（红框）的引物（红色箭头）检测的。从该反应中恢复的大多数突变是单碱基缺失，发生频率为1×10^-5缺失也存在，但很少检测到，因为它们的流行率是mtDNA点突变的25倍。在面板B中，尝试了类似的反应。然而，这一次，突变是用侧翼3的引物对进行评分的塔克I限制站点。因此，由于线粒体DNA点突变，PCR产物的预期频率指数下降到1×10^-15相反，mtDNA缺失的发生率要高得多，因此，用这些引物对检测到的每一个突变都是缺失。

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