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分子生物学细胞。2009年8月1日；20(15): 3525–3532.
数字对象标识：10.1091/桶。02年03月09日
预防性维修识别码：PMC2719570型
PMID：19477917

线粒体膜融合过程中丝裂霉素和OPA1介导的序列步骤

知音歌,*† 玛丽亚姆·古哈尼,‡ J.迈克尔·麦卡弗里,§ 特伦斯·G·弗雷,‖和大卫·C·陈通讯作者*†
珍妮特·萧伯纳，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

线粒体融合需要内外膜的协调融合。三个大的GTPases-OPA1和丝裂原融合蛋白Mfn1和Mfn2对哺乳动物线粒体的融合至关重要。OPA1在显性视神经萎缩（视神经退行性疾病）中发生突变。在酵母中，体外内膜融合需要OPA1同源物Mgm1；然而，缺乏Mgm1的酵母在体内既没有外膜融合，也没有内膜融合，因为这两个过程紧密耦合。我们发现在体内OPA1-小鼠全细胞中可以很容易地观察到外膜融合，但这些事件不会进展到内膜融合。在缺乏禁令的细胞中也发现了类似的缺陷，这是OPA1正确处理所必需的。相反，双Mfn-null细胞既没有外膜融合也没有内膜融合。OPA1全细胞中的线粒体通常包含由单个外膜结合在一起的多个基质室，这与外膜与内膜融合的解耦一致。此外，与丝裂原融合蛋白和酵母Mgm1不同，相邻线粒体不需要OPA1来介导膜融合。这些结果表明，与酵母中的情况相比，哺乳动物有丝分裂素和OPA1介导了不同的序列融合步骤，这些步骤很容易解偶联。

简介

线粒体是通过膜融合不断交换内容物的动态细胞器。线粒体融合控制细胞器的形态，对维持线粒体网络的功能至关重要。融合的丧失与呼吸活性降低、胚胎死亡、细胞凋亡和神经退行性变有关(冈本和肖，2005年；Detmer和Chan，2007年；宣等。, 2008)。此外Mfn2公司和OPA1（作战行动1），两个参与线粒体融合的基因，导致人类神经退行性疾病夏科特-马利牙2A型（CMT2A）(祖克内尔等。, 2004)和显性视神经萎缩(亚力山大等。, 2000；德莱特等。, 2000)分别是。

线粒体融合是一个多步骤的过程，需要内外膜的协调融合，最终导致基质内容物的混合。研究了芽殖酵母外膜与内膜融合的协同作用(濑崎等。, 2003；Wong（王）等。, 2003；梅森等。，2006年；Hoppins公司等。2007年)。在酵母中，外膜蛋白Fzo1p和Ugo1p以及内膜蛋白Mgm1p对线粒体融合至关重要。在体外线粒体融合试验中，需要Mgm1p来融合线粒体内外膜(梅森等。，2006年)。然而，在体内，缺乏Mgm1的酵母没有外膜融合(濑崎等。, 2003)。Ugo1p与Fzo1p和Mgm1p形成复合物，并可能协调这两种蛋白质的活性(Wong（王）等。, 2003；Sesaki和Jensen，2004年).

在哺乳动物中，线粒体融合需要三种大的GTP酶的作用：线粒体融合蛋白（Mfns）Mfn1和Mfn2，它们是Fzo1p的直系同源物，以及动力蛋白相关蛋白OPA1，它是Mgm1p的直系同源物(陈等。, 2003；奇波拉特等。, 2004；陈等。, 2005；陈，2006)。哺乳动物线粒体外膜与内膜融合的协调可被药物治疗所破坏(马尔卡等。, 2005)，但这种解偶联的分子基础尚未确定。为了解决这些大的GTPase在线粒体融合过程中是否在不同的步骤发挥作用，我们开发了分析含有OPA1或两种丝裂原等位基因的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）线粒体外膜融合的方法。我们的结果提供了明确的证据，证明有丝分裂素作用早期，对外膜融合至关重要，而OPA1仅对内膜融合是必需的。此外，我们发现酵母和哺乳动物之间线粒体融合特性存在一些差异。

材料和方法

细胞培养与逆转录病毒表达

所有细胞系均在添加10%FBS、1 mM L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基中培养。细胞在含有5%CO的湿润环境中培养237°C时。

通过在带有PA-GFP的框架中插入编码OMP25最后37个氨基酸的片段来构建PA-GFP-OMP25。OMP25的末端残基已被证明足以直接定位到线粒体外膜(内莫托和德卡米利，1999年)。为了构建mCherry-OMP25，通过PCR扩增mCherry，并在框架内克隆到OMP25的最后37个氨基酸。Mito-PA-GFP（由美国国立卫生研究院Richard Youle提供）、PA-GFP-OMP25和mCherry-OMP25亚克隆到基于Moloney的逆转录病毒载体pCLβW中。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA）将293T细胞与逆转录病毒构建物和生态型逆转录病毒包装载体pCL-Eco共转染产生逆转录病毒库存。

如前所述，为Phb1构建逆转录病毒shRNAi(陈等。, 2005)使用以下引物：

5′gatcccGACTTGCAGAAtGTCAATAttcaagagaTATTGACGTCCAAGTCttggaaa 3′

5′agcttttccaaaaaGACTTGCAGAAACGTCAATAtcttgaaTATTGACATTGCAAGTCggg 3′。逆转录病毒构建物以小鼠Phb1中的序列gacttgcagaacgtcaata为靶点。

聚乙二醇融合分析

表达线粒体靶向DsRed或mCherry的MEF与表达线粒体靶点增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的MEF偶联。第二天早上，细胞在室温下用PEG 1500（印第安纳波利斯罗氏）培养1分钟，然后用培养基清洗3次。然后将细胞在含有33μg/ml环己胺的培养基中培养1或7小时。将培养物固定在10%福尔马林中，然后用GelMount（加利福尼亚州福斯特市Biomeda）将盖玻片安装在显微镜载玻片上。

共焦显微镜和图像处理

共焦显微镜使用蔡司LSM 510 Meta显微镜和100×油浸物镜进行。活细胞在矿物油中保持在37°C。在表达mito-PA-GFP或PA-GFP-OMP25的细胞中，用设置在750nm的双光子激光对感兴趣区域内的线粒体进行光活化。在多轨道扫描模式下，用1-mW 543-nm氦氖激光器激发mt-DsRed成像，发射通过LP560-nm滤波器记录。EGFP或光激活PA-GFP通过25-mW 488-nm氩激光激发成像，发射通过BP 500–560-nm滤波器记录。

使用ImageJ软件进行图像处理和分析。在每个静止帧中手动选择单个线粒体，并记录其荧光强度，校正为背景荧光。随机选择线粒体进行定量分析。

电子显微镜

如前所述，为电子显微镜制备培养细胞(Perkins和McCaffery，2007年)。简单地说，细胞在室温下固定（3.0%甲醛、1.5%戊二醛、0.1 M己二酸钠、5 mM钙2+，2.5%蔗糖pH 7.4缓冲液），并储存在4°C。细胞在含有2.5%蔗糖的冰镇0.1 M二甲氨基甲酸钠中清洗3次，然后在Palade的OsO中固定4在黑暗中的冰上放置1小时。用0.06 M醋酸藜芦醇清洗3次后，用Kellenberger的醋酸铀酰在室温下在黑暗中对固定细胞颗粒进行染色并使其整体稳定。用50%乙醇（4°C）冲洗一次后，在4°C下通过分级系列乙醇（70%、95%、100%）对细胞进行脱水在室温下，分别在新鲜的100%丙酮中处理5分钟和3次，每次处理5分钟。然后将细胞渗透到混合良好的33%的Epon-丙酮树脂系列中3 h，66%的树脂系列中6 h，然后在室温下搅拌至少过夜，然后让样品在60°C的100%Epon块中聚合48 h。对于传统电子显微镜，用金刚石刀切取约80nm的切片，用2%醋酸铀酰和柠檬酸铅进行后染色。对于电子断层扫描，切割≈300 nm的切片，并用2%乙酸铀酰和柠檬酸铅进行后染色。在120 kV下操作的FEI Tecnai 12透射电子显微镜上记录2°（从−60°到+60°）的单轴倾斜序列，并在Tietz 214 CCD相机上记录图像之前，将胶体金颗粒（10 nm）用作校准的基准标记。断层图是根据倾斜序列计算、分段并按前面所述显示的(太阳等。2007年).

结果

融合时相邻线粒体不需要OPA1

我们之前的研究表明，Mfn-null细胞（双零细胞缺乏Mfn1和Mfn2）和OPA1-null细胞都缺乏可检测到的线粒体融合活性(Koshiba公司等。, 2004；陈等。, 2005；歌曲等。2007年)如融合试验所测，该试验监测靶向线粒体基质的荧光蛋白的混合。线粒体融合蛋白的一个关键特性是，在融合过程中，它们需要作用于相邻的线粒体，支持其在连接线粒体外层膜方面的作用(Koshiba公司等。, 2004)。为了测试OPA1功能是否有类似的要求，我们进行了PEG细胞杂交分析，其中线粒体基质中含有DsRed的OPA1-完整细胞与线粒体基质中含EGFP的野生型细胞融合。在95%的细胞杂交中，我们检测到Ds红色和EGFP大量共定位，表明内外膜融合，产生线粒体基质内容物的融合(图1)。在7%的细胞杂种中，所有线粒体都显示DsRed和EGFP的共定位(图1B类；得分为“完全融合”）。在其他88%的细胞杂交体中，在一小部分线粒体群体中发现了DsRed和EGFP的明显共定位（评分为“部分融合”）。在这些OPA1全细胞/野生型细胞杂交体中，许多含有DsRed的线粒体是细长的小管，而OPA1全亲代细胞的线粒体则完全破碎。这一观察结果与线粒体发生了实质性融合的结论相一致。相反，两个OPA1非完整细胞之间的细胞杂交显示没有线粒体融合(歌曲等。2007年)。与之前的研究一致，当Mfn-null细胞与野生型细胞融合时，未检测到线粒体融合。

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线粒体融合对丝裂原融合蛋白和OPA1的不同要求。（A） 通过融合右侧所示的亲本细胞进行的三种PEG细胞杂交融合分析的代表性图像。在底部的两个面板中，突变细胞（Mfn-null或OPA1-null）表达mito-DsRed，而野生型细胞（WT）表达mito-EGFP。在底部面板中，野生型和OPA1全细胞之间的细胞杂交显示绿色（左侧面板）和红色（中间面板）荧光团的广泛混合。箭头表示细胞杂种中含有DsRed的一些细长线粒体小管。（B） PEG细胞杂交实验的定量。误差线表示3个独立实验的标准偏差，其中100个细胞杂交体得分。通过估算显示荧光团共定位的线粒体百分比对细胞杂种进行评分。完全融合表明细胞杂交中的所有线粒体都含有两个荧光团。带有融合和未融合线粒体的细胞杂种被记为部分融合。没有双重染色线粒体的杂交后代被认为没有融合。

上述结果表明，只有一个线粒体上需要OPA1才能促进一对线粒体之间的融合。然而，应该注意的是，多种OPA1亚型是通过不同的RNA剪接和蛋白质加工产生的。OPA1的长亚型锚定在内膜上，而短亚型没有明显的膜锚定。长亚型和短亚型的结合对于融合活动是必要的(歌曲等。2007年)。一个潜在的担忧是，如果发生外膜融合，OPA1的短亚型可能会在膜间扩散，这使PEG细胞杂交结果的解释变得复杂。为了解决这一问题，我们使用了最近的观察结果，即与正常细胞生长期间长型和短型相结合的要求相比，OPA1长型亚型单独在环己酰亚胺存在下可以促进融合(托德拉等。, 2009)。与本研究一致，我们发现尽管OPA1-完整细胞表达亚型1ΔS1，一种不可清除的长型OPA1亚型1(歌曲等。2007年)线粒体碎片，与环己酰亚胺孵育可形成更细长的线粒体（图S1、A和B）。Western blot分析表明，经环己酰亚胺处理的线粒体的伸长并不是由于产生短形式的OPA1（图S1C）。相比之下，表达亚型3的细胞在两种条件下都显示出线粒体碎片，这种细胞只产生短型。

由于环己酰亚胺在PEG融合试验期间用于抑制蛋白质合成，因此我们询问当仅存在于一个亲本细胞上时，膜结合的长型亚型1是否可以介导线粒体融合。当表达1ΔS1的OPA1-null细胞与OPA1-null细胞融合时，我们发现约50%的细胞杂种含有大量线粒体融合(图2)。这一观察结果进一步支持了这样一种观点，即OPA1与有丝分裂素不同，在相邻的线粒体上不需要促进融合。

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不同OPA1亚型亲本细胞杂种的线粒体融合。在野生型细胞、OPA1非完整细胞或表达所示OPA1亚型的OPA1-完整细胞之间的细胞杂交中测量线粒体融合。误差条表示3个实验的SD。

PEG融合实验中OPA1-Null细胞的外膜融合

为了研究丝裂原融合蛋白和OPA1在线粒体外膜融合中的功能，我们使用PEG细胞杂交试验，其中一个表达mCherry的亲本细胞系与OMP25的膜靶向序列融合(内莫托和德卡米利，1999年)，一种线粒体外膜蛋白。在用于PEG细胞融合实验的标准7小时时间点，我们发现OPA1-全细胞杂种在线粒体群体中广泛混合了mCherry-OMP25（图S2）。然而，在这些条件下，Mfn-null细胞也表现出外膜标记物的混合，尽管混合范围较小（图S2）。我们担心，标准PEG细胞杂交实验中使用的延长时间可能会导致外膜标记的虚假结果。当我们使用较短的孵育时间重复这些实验时，我们发现OPA1-完整细胞与Mfn-完整细胞中mCherry-OMP25的混合程度存在显著差异(图3)。在细胞融合后1小时，Mfn-null杂交后代几乎没有证据表明外膜融合，而95%以上的OPA1-null杂交代表现出明显的部分融合(图3B） ●●●●。这些结果表明，OPA1-null细胞发生外膜融合。然而，我们的结果也表明，PEG细胞杂交试验不是测量线粒体外膜融合的理想系统。Mfn-null细胞中残留的mCherry-OMP25混合可能反映了PEG融合分析的伪影。出于这种考虑，我们决定开发一种检测方法，以实时直接可视化外膜融合事件。

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OPA1缺失细胞中的外膜融合。（A） 三种PEG细胞杂交融合检测的代表性图像，通过融合右侧所示的亲本细胞并在细胞融合后1小时分析细胞来完成。用mCherry-OMP25监测线粒体外膜混合。在底部面板中，OPA1全细胞杂交显示绿色（左侧面板）和红色（中间面板）荧光团的部分混合。大插页是小盒子的放大图像。箭头突出显示插图中的单个线粒体。（B） 聚乙二醇细胞杂交实验的定量。根据以下内容进行评分和定量图1B、 但由于细胞在1h时仅表现出部分线粒体融合，部分融合类别进一步分离为大于或小于50%的线粒体显示荧光团混合的细胞。误差条表示3个实验的SD。

用新型外膜融合试验观察OPA1-Null细胞的外膜融合

我们进行了化验(卡博夫斯基等。, 2004；海格等。2007年)用于线粒体融合，使用光活化GFP（PA-GFP），一种GFP衍生物，其荧光在光活化后增加100倍(Patterson和Lippincott-Schwartz，2002年)。在本实验中，细胞同时表达线粒体基质靶向的mito-PA-GFP和mito-DsRed变体。在单个细胞内，一小部分线粒体标记的线粒体通过双光子激发被光激活，然后通过延时显微镜进行追踪。在野生型细胞中，线粒体融合导致光激活线粒体中的PA-GFP转移到非激活线粒体。由于线粒体融合导致内容物交换，此类事件的特征是PA-GFPs和DsRed荧光的突然逐步变化（图S3）。在线粒体融合活性高的细胞中，由于与周围线粒体的融合周期，活化线粒体中的PA-GFP荧光强度被稳定地稀释。然而，在线粒体融合很少或没有融合的细胞内，活化线粒体的PA-GFF荧光保持稳定，除了光漂白引起的褪色。正如预期的那样，OPA1-null和Mfn-null细胞在本试验中的表现相似，激活的mito-PA-GFP在20分钟的记录过程中仅显示出轻微的荧光下降(图4，A–C）。此外，在延时电影中对单个线粒体的检查没有发现基质混合的证据。在这两种细胞系中，我们将10个单独的光激活线粒体的荧光制成表格(图3、A和B）。在20分钟的记录过程中，两种细胞系中光激活线粒体的总荧光强度仅下降了7%(图3C） ●●●●。这种逐渐减少归因于光漂白，因为对延时电影的检查表明，单个线粒体的荧光强度逐渐降低，而没有与相邻线粒体进行荧光交换，野生型细胞中的光激活线粒体在10分钟内失去大部分荧光(图4C） ●●●●。

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Mfn-null和OPA1-null细胞中基质和外膜标记物的行为。通过分别测量Mfn-null（A和D）和OPA1-null（B和E）细胞中基质标记物mito-PA-GFP-OMP25（D–F）的稀释度来监测完全融合和外膜融合。面板A、B、D和E显示了整个20分钟记录过程中每20秒10个线粒体的个体标准化荧光痕迹。在少数记录道中，不连续性可归因于记录过程中的短暂散焦。对A和B中的数据进行平均，得出C中的痕量。对D和E中的数据求平均，得出F中的微量。在E和F中，与Mfn-null细胞相比，来自OPA1-null细胞的线粒体的PA-GFP-OMP25荧光下降幅度更大。利用野生型细胞中6个线粒体的数据获得C的野生型平均值；使用来自5个线粒体的数据获得F的野生型平均值。F的图例显示在C中。

为了研究线粒体外膜融合的问题，我们通过与OMP25的靶向序列融合，将PA-GFP定位到线粒体外膜，从而改进了光激活试验。我们在细胞中表达了mito-DsRed和PA-GFP-OMP25，并使用双光子激发来光激活感兴趣区域中的一小群线粒体。光激活后，每隔20秒通过延时显微镜监测细胞，持续20分钟。在野生型细胞中，线粒体融合导致紧密耦合的外膜和内膜融合（图S4）。这样的事件导致两种荧光标记物的荧光强度的逐步变化。当PA-GFP-OMP25标记的线粒体与未激活的线粒体融合时，其GFP荧光随着DsRed荧光的突然增加而逐渐下降。

在Mfn-null细胞中，我们发现PA-GFP-OMP25的行为与mito-PA-GFP相似，并且我们从未检测到外膜融合的证据(图4、D和F）。从Mfn-null细胞的延时图像中，我们跟踪并量化了单个光激活线粒体的荧光谱随时间的变化。这些图表明荧光强度是稳定的(图4D） ●●●●。连续记录20分钟后，光激活线粒体的平均荧光仅下降14%(图4F） ●●●●。该测定中稍高水平的光漂白可归因于成像PA-GFP-OMP25所需的更高激光功率，其具有比有丝分裂PA-GFP更低的荧光。

然而，在OPA1全细胞中，我们检测到频繁的外膜融合事件。20分钟后，光激活线粒体的平均荧光强度下降了42%(图4F） ●●●●。当分析单个光激活线粒体的PA-GFP-OMP25荧光强度时，大多数线粒体（10个中的7个）的荧光强度随机逐步下降，这高度暗示了线粒体外融合(图4E和​和5）。5)。虽然在OPA1全细胞中观察到频繁的外膜融合事件（见下文），但这些事件发生的频率低于野生型细胞(图4F） ●●●●。与这一观点一致，即使用外膜标记物进行分析，OPA1-完整细胞也有支离破碎的线粒体形态。

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OPA1-null细胞外膜融合事件的可视化。（A） OPA1-null细胞中一对线粒体中的PA-GFP荧光示踪（表达PA-GFP-OMP25和mito-DsRed）。线粒体b条是光激活的，最初含有高水平的PA-GFP荧光。线粒体一未经光活化，因此最初未显示PA-GFP荧光。在第2帧中，PA-GFP荧光逐步下降b条与之相匹配的是增加荧光一。与这些更改相对应的静止帧显示在右侧。荧光变化前后的帧显示为合并图像（顶部）、绿色图像（中部）或红色图像（底部）。标记参与每个外膜融合事件的相关线粒体。虽然发生了PA-GFP荧光交换，但DsRed没有转移。在我们的PA-GFP光活化条件下，DsRed被光漂白。因此，高GFP荧光和无DsRed荧光很容易观察到光激活线粒体。（B） 另一个类似于A的例子。显示的静止帧来自电影S1和S2。

对延时电影的检查显示了明确的外膜融合事件（补充电影1和2）。图5显示了OPA1全细胞延时电影中线粒体的荧光痕迹，以及选定的静止帧。在所示的两个病例中，荧光痕迹显示一个线粒体的PA-GFP荧光逐步下降，这与相邻线粒体的PA-GFP荧光逐步增加有关。相应静止帧的检查(图5)表明PA-GFP荧光已从第一个线粒体转移到相邻的线粒体，该线粒体没有光激活，因此最初仅包含线粒体-DsRed荧光。重要的是，没有丝裂原-DsRed荧光转移，表明在没有基质转移的情况下发生了外膜交换。荧光变化的逐步性质表明，一旦外膜混合开始，它将在20秒的记录间隔内完成。

OPA1-Null细胞的超微结构

这些结果表明，尽管有丝分裂素对外膜融合至关重要，因此对内膜融合也至关重要，但OPA1仅在内膜融合中起作用。在OPA1-完整细胞中，经常发生线粒体外膜事件，但总是与内膜融合分离(图5)。这种不耦合的膜融合事件将导致OPA1-null细胞中含有多个基质室的线粒体。为了验证这一预测，我们通过薄片电子显微镜对OPA1缺失细胞的线粒体图谱进行了评分。与之前使用RNAi敲除的报告一致(奥利康等。, 2003；格里帕里克等。, 2004；弗雷扎等。，2006年)我们发现，OPA1-null细胞线粒体存在严重的超微结构缺陷，包括线粒体肿胀和嵴组织缺陷，如同心内膜。这种变化归因于OPA1在嵴维持中的作用(奥利雄等。, 2003；格里帕里克等。, 2004；弗雷扎等。，2006年；梅森等。，2006年)这似乎与它在膜融合中的作用不同。此外，我们发现许多线粒体具有多重基质。在280个得分的线粒体中，83个（30%）明显具有由单个外膜包围的多个基质室(图6、A和B）。在野生型或Mfn-null细胞中未观察到这种线粒体轮廓（图S5）。我们从许多线粒体的倾斜序列中计算出三维电子断层图，以确认内膜缺陷的性质，从分段断层图导出的两个三维模型的视图如所示图6C和​和6D。6D.在两者中，一个单独的外膜包围着两个单独的基质室。原则上，具有多个基质室的线粒体可能是由内膜分裂与外膜分裂不耦合或外膜融合与随后的内膜融合不耦合引起的。上述荧光成像实验表明，这可归因于后一个过程。

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EM断层扫描显示OPA1-完整线粒体中的多个基质。（A和B）常规薄片的电子显微照片显示线粒体似乎包含多个基质室，线粒体位于A的右下方，线粒体位于B的左下方和右下方。（C和D）根据分段电子断层图计算的三维模型视图。两者都显示线粒体至少有两个单独的基质室。外层膜呈半透明蓝色。（C）中的线粒体包含一个大的基质室，由一个呈白色的内界膜包围，其中一个大嵴呈红色，一个小嵴呈黄色，另外三个单独的膜室呈红色、洋红和绿色，与本节内的内界薄膜不相连；一个较小的、独立的矩阵隔间在顶部呈现为绿松石色。D中的线粒体包含一个较小的基质室，底部呈绿松石色，较大的基质室呈白色。后者包含另一个由红色和黄色的双层膜包围的大隔间。

细胞中类似缺陷缺乏抑制剂

禁止蛋白1（Phb1）和禁止蛋白2（Phb2）是位于线粒体内膜上的相关大蛋白复合物，对OPA1的正确蛋白水解过程至关重要(默克维思等。, 2008)。在缺乏抑制剂的情况下，OPA1被完全加工成短亚型，导致线粒体功能严重缺陷。我们的上述结果可以预测，缺乏前抑制素的细胞也可能在内膜融合中出现缺陷。为了验证这个预测，我们使用短发夹RNAi来敲低Phb1的表达。正如预期的那样，这一击倒导致Phb1水平降低（图S6）。Phb2的水平也同样降低，这与之前的结果一致，即这两种蛋白质的表达是相互依赖的(Merkwirth公司等。, 2008)。敲除Phb1还导致OPA1主要加工成短亚型的过程增加（图S6）。通过时间推移成像，我们很容易找到与内膜融合分离的外膜融合事件的例子(图7).

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Phb1敲除细胞中的解偶联外膜融合。Mito-DsRed和PA-GFP-OMP25在含有Phb1 shRNAi的野生型MEF中表达。在左侧面板中，线粒体一，含有高水平的PA-GFP荧光，与线粒体相邻b条，含有DsRed荧光，但很少有PA-GFP荧光。30秒后，在右侧面板中，PA-GFP荧光一已转入b条不交换DsRed。

讨论

酵母与哺乳动物线粒体融合的异同

我们的结果表明，OPA1和丝裂原在线粒体融合过程中以不同的步骤发挥作用。最重要的是，我们发现，在体内，哺乳动物细胞中OPA1的缺失并没有破坏线粒体外膜融合。我们的研究与之前在酵母中的体外研究一致，表明内膜融合需要Mgm1(梅森等。，2006年)。然而，需要注意的是，缺乏Mgm1的酵母在体内没有表现出外膜融合(濑崎等。, 2003)。这种差异表明哺乳动物细胞内外膜的融合不像酵母细胞那样紧密。造成这种差异的原因尚待确定。然而，值得注意的是，酵母中的衔接蛋白Ugo1与Fzo1和Mgm1物理结合，并被认为协调内外膜的融合(Wong（王）等。, 2003；Sesaki和Jensen，2004年；Hoppins公司等。, 2009)。到目前为止，还没有发现Ugo1的哺乳动物直系祖先。

我们还发现OPA1与丝裂原融合蛋白不同(Koshiba公司等。, 2004)不需要在相邻线粒体上进行融合。这种显著的区别意味着这两种GTP酶在线粒体融合过程中的分子机制不同。在酵母线粒体的体外融合试验中，两个线粒体都需要Mgm1p才能有效融合(梅森等。，2006年)。目前尚不清楚这种差异是否归因于所使用的不同融合分析，或者是否反映了哺乳动物和酵母线粒体融合之间的另一种差异。

神经退行性疾病的含义

虽然神经退行性疾病CMT2A和DOA都被认为是由线粒体融合减少引起的，但我们的结果表明，它们影响线粒体融合途径的不同步骤。这一认识可能有助于理解这些疾病的致病基础。由Mfn2突变引起的CMT2A是一种以最长外周神经变性为特征的疾病(祖克内尔等。, 2004)。相反，DOA是一种视网膜神经节细胞变性疾病，导致视神经萎缩(亚力山大等。, 2000；德莱特等。, 2000)。在这两种疾病中，一部分患者表现出更广泛和重叠的组织受累，这表明线粒体融合对更广泛的细胞类型很重要(Zuchner和Vance，2006年；哈德逊等。, 2008；赞纳等。, 2008；泽维亚尼，2008)。这两种疾病之间组织特异性差异的基础尚不清楚。值得探讨的是，它们的出现是否部分是因为Mfn2和OPA1在线粒体融合中的不同作用。

OPA1突变导致常染色体显性DOA，有些病例是由OPA1单倍体不足引起的(德莱特等。, 2002)。此外，OPA1蛋白减少50%的小鼠视网膜神经节细胞发生年龄依赖性变性(阿罗毗等。2007年；戴维斯等。2007年)。相反，我们的OPA1全细胞缺乏任何OPA1蛋白，与患者细胞相比，预计线粒体融合损失更严重。然而，即使在OPA1全细胞中也能保持外膜融合，这意味着DOA患者可能具有完整的外膜融合。

每个线粒体融合事件都会介导两个线粒体之间的显著重塑。四个脂质双层的融合不仅导致膜脂和蛋白质的混合，还导致线粒体基质的融合。在细胞水平上，丝裂原融合蛋白或OPA1的缺失会对线粒体功能造成严重后果，包括膜电位的异质性、线粒体DNA核仁的异质性以及呼吸能力的大幅降低(陈等。, 2005；陈等。2007年)。OPA1在嵴结构维持中的作用可能是(奥利康等。, 2003；格里帕里克等。, 2004；弗雷扎等。，2006年；梅森等。，2006年)虽然需要注意的是，当线粒体分裂受阻时，酵母Mgm1p对嵴结构来说是不必要的(濑崎等。, 2003)。相反，我们支持这样的模型，即线粒体内膜融合的缺陷是OPA1-全细胞中细胞缺陷的基础。这些观察结果表明，内膜融合可能是由于其在合并线粒体基质方面的作用，具有重要的生理功能。

补充材料

【补充资料】

致谢

我们感谢Steven Barlow博士在电子显微镜方面的帮助。我们感谢Xiuchen Chen博士（加州理工学院）在这项研究中的早期工作，感谢Chen博士和Christiane Alexander博士（Max Delbrück中心）使用OPA1-null细胞。这项工作得到了美国国家卫生研究院向哥伦比亚特区政府提供的GM062967赠款的支持，圣地亚哥基金会向T.G.F.Z.S.提供的Blasker科学技术赠款也得到了Elizabeth Ross Fellowship的支持。

使用的缩写：

CMT公司腓骨肌萎缩症
DOA公司显性视神经萎缩
Mfn公司线粒体融合蛋白。

脚注

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E09-03-0252)2009年5月28日。

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文章来自细胞的分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会