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基因发育。2008年6月15日;22(12): 1577–1590.
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PMID:18559474

线粒体动力学与细胞凋亡

摘要

在健康细胞中,线粒体不断分裂和融合,形成一个动态的互联网络。调节细胞器分裂和融合的分子机制对于保持线粒体完整性是必要的,可能是通过促进DNA或蛋白质质量控制。这种网络在细胞色素时期的细胞凋亡过程中解体c(c)在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活之前,释放出更多更小的线粒体。最近的研究表明,参与线粒体分裂和融合的蛋白质也积极参与凋亡诱导。这篇综述将涵盖最近的进展,并提出线粒体裂变和融合机制如何与凋亡途径交叉的竞争模型。

关键词:Bax、Bcl-2、Drp1、Mfn2、OPA1、裂变

细胞凋亡介导真核细胞的分解代谢,这对后生动物的发育、成体组织的更新、宿主防御途径和癌症的防护至关重要。所有的细胞凋亡途径都集中在半胱天冬酶的激活上,半胱天冬酶是一种协调细胞有效和非炎症破坏的蛋白酶。导致caspase激活的两条主要途径已被很好地描述为:细胞表面受体启动的外源途径直接导致caspase8激活,以及由线粒体调节的内源途径。凋亡控制的线粒体阶段是caspase激活的上游,由Bcl-2蛋白家族介导。线粒体在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活中的一个众所周知的作用是调节蛋白质从线粒体内外膜之间的空间释放到胞浆。当细胞色素c(c)从线粒体释放出来,与细胞质中的APAF1结合,激活激活半胱氨酸蛋白酶9的凋亡小体的组装(2007年包和石). 线粒体释放的其他蛋白质,如SMAC/Diablo,在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活中起着不太重要的辅助作用,可能在长寿细胞中最重要(Potts等人,2005年).

Bcl-2家族蛋白调节细胞色素的释放c(c)和其他蛋白质通过外线粒体膜(OMM)(亚当斯和科里2007;Chipuk和Green 2008). Bcl-2家族的一些成员抑制细胞凋亡,如Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1,而其他成员,如Bax和Bak,则激活细胞凋亡。Bax和Bak积极诱导细胞色素c(c)细胞内和无细胞系统中线粒体的释放,这两者都被抗凋亡Bcl-2家族成员所抑制。由于抗凋亡Bcl-2家族成员在结构上与促凋亡成员极为相似,因此它们可能通过结合和抑制Bax和Bak发挥主导性阴性抑制剂的作用。另一类不同的蛋白质,包括Puma和Bim,称为BH3-only蛋白质,与Bcl-2家族蛋白质共享短基序并调节其活性。一种模型认为,在细胞凋亡开始时,BH3-only蛋白被诱导,然后结合并抑制抗凋亡Bcl-2家族蛋白,使促凋亡Bax和Bak渗透线粒体外膜释放细胞色素c(c)和其他蛋白激活半胱天冬酶并诱导细胞破坏(有关综述,请参阅Youle和Strasser 2008).

在细胞色素之前或与细胞色素同时存在c(c)释放并激活caspase上游,线粒体分裂成多个小单位。阻止线粒体分裂抑制细胞色素c(c)释放并延迟细胞死亡,将这种细胞器的形态发生机制与细胞死亡诱导联系起来。这篇综述将集中于这种断裂是如何发生的,尤其是线粒体分裂和融合机制如何参与线粒体外膜的通透性和凋亡激活。

线粒体裂变和融合机器

线粒体形态比最初想象的要动态得多。在许多粘附细胞类型中,线粒体形成细长的小管,不断分裂和融合,形成动态互连网络。融合过程对维持线粒体功能至关重要,因为线粒体融合的中断会导致线粒体内膜电位的丧失(Chen等人,2003年). 许多介导裂变和融合过程的基因产物已在酵母筛选中鉴定出来,大多数在哺乳动物中保存,包括裂变介体Drp1(酵母中的Dnm1)和Fis1,以及融合介体Mfn1和2(酵母中Fzo1)和OPA1(酵母菌中的Mgm1)(韦斯特曼2008). 然而,在哺乳动物中尚未发现酵母分裂介质Mdv1、Mdv1caf4和酵母融合介质Ugo1的哺乳动物同源物。在酵母中缺失的哺乳动物中发现了其他蛋白质,如Bax和Bax结合蛋白,嗜内素B1,它们影响线粒体形态发生,并将在这里结合凋亡调节进行考虑。

哺乳动物细胞中的裂变机制

动力蛋白相关蛋白1(Drp1)是一种大的GTPase,在哺乳动物细胞中介导线粒体分裂(有关综述,请参阅冈本和肖2005;Hoppins等人,2007年). 它似乎与其同源物动力蛋白有着共同的机制,动力蛋白是一种参与内体从质膜断裂的蛋白质。动力蛋白从胞浆聚集成螺旋状围绕内吞体颈部。这些动力螺旋收缩脂质小管(Danino等人,2004年)在体外,如果小管两端被锚定,扭转GTP裂解以介导脂质小管断裂(Roux等人,2006年). 大多数Drp1可溶解于细胞的胞浆中,在胞浆中往返于线粒体(Smirnova等人,2001年;Wasiak等人,2007年). 假设与酵母Dnm1的研究相似(Ingerman等人,2005年),Drp1在线粒体外膜周围的分裂位点组装成螺旋,以驱动裂变过程(图1). Dnm1螺旋的内径为109 nm,约为dynamin螺旋(内径20 nm)的5倍,与线粒体收缩位点的直径(111 nm)相匹配(Ingerman等人,2005年). 阻断Drp1 GTPase活性的突变产生抑制线粒体分裂的显性阴性突变,由于持续融合导致过度管状线粒体网络(Otsuga等人,1998年;Smirnova等人,2001年). 因此,Drp1似乎因螺旋的组装或随后螺旋直径的变化而收缩线粒体。

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线粒体裂变机器。哺乳动物细胞中参与线粒体分裂的三种蛋白质(Drp1、Fis1和MARCH5)的定位示意图。

Drp1募集到线粒体以形成螺旋和线粒体分裂的机制尚不清楚。在酵母中,这种组装需要Fis1,一种固定在整个OMM中并均匀覆盖的四肽结构域蛋白(图1;铃木等人,2003;Dohm等人,2004年). 在酵母中,Fis1通过两种衔接蛋白之一Mdv1或Caf4将Dnm1招募到线粒体(Mozdy等人,2000年;Tieu和Nunnari 2000;Griffin等人,2005年). 然而,这些衔接蛋白的同源序列尚未在哺乳动物中鉴定出来,哺乳动物的Drp1似乎在缺乏Fis1的线粒体上组装(Lee等人,2004年). 尽管交联研究和荧光共振能量转移(FRET)技术与该假设一致,但Drp1是否直接与Fis1结合仍有待确定(Yoon等人,2003年). 在哺乳动物细胞中,肌动蛋白丝和微管似乎也在向线粒体募集Drp1中发挥作用(Varadi等人,2004年;De Vos等人,2005年).

目前尚不清楚线粒体内膜是如何分裂的。某些藻类中的线粒体,如梅洛拉蓝隐孢子虫(Kuroiwa等人,2006年)和黏菌粘液菌(Gilson等人,2003年)保留介导细菌分裂的原核GTPase的同源物FtsZ,FtsZ在线粒体基质室中组装成环状(Kuroiwa等人,2006年)调节细胞器分裂(Gilson等人,2003年).氰化汞也有Drp1和Mdv1同源物(Nishida等人,2007年)可能介导OMM裂变,但在酵母或哺乳动物中未发现FtsZ。在缺乏FtsZ的生物体中,基于线粒体内膜中的亚有机体位置,如果其在线粒体内膜融合中的主导活性可以反向工作,那么动力蛋白同源物OPA1将是介导线粒体内膜分裂的候选物。

另一种参与哺乳动物线粒体形态发生的蛋白质是嗜内素B1(也称为Bif-1和SH3GLB1),这是一种BAR结构域蛋白,定位于细胞胞浆并与Bax相互作用(Cuddeback等人,2001年;Pierrat等人,2001年). 与结合动力蛋白并参与内体断裂的内啡肽A1一样,内啡肽B1似乎可以调节膜的曲率(Peter等人,2004年)在体外使脂质双层变形为小管(Farsad等人,2001年). 细胞中亲内皮素B1的下调导致OMM从线粒体内膜解离,形成OMM的长小管(Karbowski等人,2004b). 如所示图2在某些缺乏内皮素B1的细胞中,相互连接的OMM链网将线粒体内膜结合的基质隔间隔开。这可能是由于在没有OMM断裂的情况下线粒体内膜持续断裂引起的。尽管缺乏OMM剪断,但Drp1似乎激活了内皮素B1敲除细胞中的内线粒体膜剪断,因为Drp1/内皮素B1联合敲除产生了与Drp1单独敲除类似的细长线粒体(Karbowski等人,2004b).

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内皮素B1敲除对线粒体外部形态的影响。HeLa细胞中RNA干扰导致的内皮素B1/Bif1/SH3GLB1敲除的共焦图像显示OMM小管网(绿色)连接碎片基质室(红色)。OMM的免疫荧光显示为绿色(α-Tom20),线粒体基质显示为红色(α-TRAP1)(图片由王春欣提供)。

MTP18(线粒体蛋白,18kDa)和神经节苷脂诱导分化相关蛋白1(GDAP1)是另外两种影响线粒体分裂的蛋白质。MTP18是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信号的下游效应器,已被提议通过向OMM募集Drp1来调节线粒体分裂(Tondera等人,2004年,2005). 定位于膜间隙的MTP18的敲除导致细胞色素c(c)从线粒体释放,尽管这种影响是否直接尚不清楚(Tondera等人,2004年,2005). GDAP1是一种线粒体外膜蛋白(Pedrola等人,2005年)该基因在夏科特-马利牙病4A型(CMT-4A)中突变。GDAP1过度表达导致线粒体断裂,对细胞死亡没有影响(Niemann等人,2005年)而下调GDAP1或某些患者突变形式的表达,这些突变形式被截断且不再定位于线粒体,则倾向于拉长线粒体,表明GDAP1在线粒体分裂中发挥正常功能。

哺乳动物细胞中的融合机制

线粒体分裂通常通过融合来平衡。在酵母中,这一过程已被广泛研究和审查(Cerveny等人,2007年;Hoppins等人,2007年;Merz等人,2007年),这里我们将考虑哺乳动物细胞中的融合机制,省略迄今为止仅在酵母中鉴定出的Ugo1。dynamin家族中的三个大GTPase Mfn1、Mfn2和OPA1在酵母和哺乳动物之间保存,它们介导线粒体融合(图3). 无细胞融合分析表明Mfn1和2介导OMM融合,而OPA1介导线粒体内膜融合(Meeusen等人,2004年,2006). OPA1定位于线粒体内膜,面向膜间隙(Olichon等人,2002年). 哺乳动物中的OPA1是由一个基因编码的,该基因具有八个由选择性剪接产生的转录变体(Deletere等人,2001年). OPA1的各种剪接变异体被差异地蛋白水解成长型和短型,在线粒体中产生一系列不同的OPA1亚型。与保留疏水结构域的长型相比,OPA1的分裂型更松散地附着在线粒体内膜上(Ishihara等人,2006年). 对酵母同源物Mgm1的研究表明,需要较短的蛋白水解处理形式的Mgm1与较长的形式结合来介导线粒体融合(Herlan等人,2003年). 多种蛋白酶,包括菱形家族成员(Herlan等人,2003年;McQuiban等人,2003年;Sesaki等人,2003年;Cipolat等人,2006年),帕拉莱金(Ishihara等人,2006年),和Yme1(Griparic等人,2007年;Song等人,2007年)已牵涉到OPA1处理。当穿过线粒体内膜的电化学电位降低时,OPA1的断裂加速,这表明OPA1的加工及其活性可以被调节,以协调线粒体的能量状态与细胞器形态(Griparic等人,2004年;Duvezin Caubet等人,2006年;Ishihara等人,2006年;Meeusen等人,2006年).

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线粒体融合器。参与线粒体融合的哺乳动物蛋白质在健康细胞中的亚线粒体定位示意图,包括丝裂原融合蛋白、OPA1、丝裂原PLD和Bak(见图例)。插入显示了拟在OPA1裂解中发挥作用的蛋白酶的定位。早老素相关菱形蛋白(PARL)是菱形蛋白家族的一员。

线粒体1和2(Mfn1,Mfn2)整合到OMM中,两个跨膜区域仅由面向膜间空间的两到三个氨基酸分开(桑特尔和富勒2001)将其N端GTPase结构域和C端卷曲线圈区域朝向细胞溶质(Rojo等人,2002年). 线粒体融合蛋白的GTPase活性对线粒体融合至关重要(Hales and Fuller 1997年;赫尔曼等人,1998年;桑特尔和富勒2001). Mfn1和Mfn2的C末端线圈区域通过相邻线粒体之间形成的同型或异型复合物介导线粒体之间的系留(Chen等人,2003年;Ishihara等人,2004年;Koshiba等人,2004年;Meeusen等人,2004年).

迄今为止,已鉴定出几种Mfn2结合蛋白,包括某些Bcl-2家族成员、MIB和Stoml2。Bax和Bak是两个促凋亡的Bcl-2家族成员,最近通过共免疫沉淀和荧光共振能量转移(FRET)研究表明它们与Mfn2和Mfn1相互作用(Brooks等人,2007年). Bcl-2、Bcl-xL和秀丽隐杆线虫CED-9已被证明通过与Mfn2而非Mfn1的共免疫沉淀进行特异性相互作用(Delivani等人,2006年). Bcl-2家族成员和有丝分裂素之间的相互作用将在后面的章节中详细讨论。线粒体结合蛋白(Mitofusin-binding protein,MIB)是中链脱氢酶/还原酶超家族的成员,主要定位于胞浆中。MIB的敲除导致线粒体网络的伸长,表明MIB调节线粒体裂变(Eura等人,2006年). 在健康细胞中与Mfn2的复合物中发现了口香糖样蛋白2(Stoml2)(Hajek等人,2007年)与面向膜间隙的线粒体内膜有关。敲除Stoml2可降低膜电位,但不会影响线粒体形态。

线粒体磷脂酶D(mitoPLD)是另一种参与线粒体融合的蛋白质(Choi等人,2006年). RNA干扰(RNAi)诱导的线粒体PLD表达缺失导致线粒体网络断裂。催化域突变的线粒体PLD-过度表达无法在线粒体PLD敲除细胞中重建线粒体融合,并导致野生型细胞线粒体断裂,表明酶活性对于线粒体融合是必要的。MitoPLD是一种通过C端跨膜锚定结合到OMM的二聚酶,其N端催化结构域面向胞浆。根据mitoPLD的拓扑结构,催化结构域可以插入相邻的OMM,并在线粒体融合蛋白介导的线粒体栓系后修饰脂质。mitoPLD已被证明可以水解心磷脂,产生磷脂酸。虽然磷脂酸在线粒体融合中的作用尚不清楚,但它可能通过改变膜脂环境来诱导膜弯曲或向线粒体募集其他蛋白质,其中任何一种都可能在膜融合事件中发挥作用。

Drp1和Mfn2的翻译后修改

最近,磷酸化被认为是调节Drp1介导的线粒体分裂的重要翻译后修饰。在有丝分裂期间,Drp1被Ser618的CDK1/cyclinB磷酸化激活(人类Drp1;大鼠Drp1中的585),导致线粒体断裂(田口等人,2007年). 相反,通过cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)介导的GTPase效应域(GED)内的Ser637(人类Drp1;大鼠Drp1中的Ser656)磷酸化,Drp1 GTPase活性失活,导致线粒体融合(Chang和Blackstone 2007;婴儿床和Strack 2007). 因此,Drp1活性可以由激酶进行正调控和负调控。

Drp1也被证明是sumoylation的底物,并通过酵母双杂交与SUMO1相互作用(Harder等人,2004年). SUMO1过度表达导致Drp1 sumoylation过度,导致线粒体断裂(Harder等人,2004年). SENP5是一种SUMO蛋白酶,可以使Drp1去甲酰化,胞浆SENP5的过度表达可以逆转SUMO1诱导的线粒体断裂(Zunino等人,2007年). 因此,Drp1的sumoylation似乎正调控其在线粒体分裂中的活性。

MARCH5是一种新发现的跨膜泛素E3连接酶,定位于线粒体并在线粒体形态调控中发挥作用(Nakamura等人,2006年;Yonashiro等人,2006年;Karbowski等人,2007年). 它包含一个N-末端环指结构域和四个跨膜结构域,将MARCH5定位于OMM(图1). Yonashiro和Nakamura小组报告称,通过表达显性阴性突变体抑制MARCH5活性会导致线粒体断裂(Nakamura等人,2006年;Yonashiro等人,2006年). 然而,Karbowski及其同事随后报告称,抑制MARCH5会增加线粒体的伸长和相互连接,并导致Drp1过度募集到线粒体(Karbowski等人,2007年). 与均匀分布于线粒体周围的野生型MARCH5相比,MARCH5RING突变体定位于线粒体表面的Drp1。因此,MARCH5似乎参与了线粒体的裂变,可能是通过在裂变部位的Drp1螺旋的解体或翻转。

酵母有丝分裂素Fzo1,以及可能的Mfn1和2,受泛素化调节。在交配期间,酵母线粒体碎片和Fzo1水平下降。有趣的是,Fzo1的这种丢失通过化学抑制而减弱(Neutzner和Youle 2005)或基因失活(Escobar-Henriques等人,2006年)蛋白酶体。因此,Fzo1似乎从OMM中被去除,并作为一种特定的调节机制被降解。在营养生长期间,Fzo1被证明是Lys48泛素化的(Neutzner等人,2007年),表明线粒体外膜上蛋白酶体介导的降解过程模型,类似于跨膜蛋白去除和降解的ER-associated degradation(ERAD)途径。用蛋白酶体抑制剂处理细胞可以提高哺乳动物Mfn1和2的表达水平(Karbowski等人,2007年)这表明泛素-蛋白酶体途径也调节哺乳动物的有丝分裂素。

线粒体分裂机制在细胞凋亡中的作用

裂变机制在细胞程序性死亡中起着关键作用

线粒体分裂是细胞凋亡的早期事件,发生在半胱氨酸蛋白酶激活和膜起泡之前。该过程发生的时间与细胞色素非常接近c(c)释放,无论是在释放之前还是同时释放,因为可以很容易地看到碎片线粒体保留了细胞色素c(c)(图4). 尽管这种断裂似乎普遍与凋亡有关,但在没有凋亡的情况下,线粒体过度分裂也可能发生,例如暴露于破坏线粒体内膜电化学电位的解偶联剂时。例如,FCCP诱导的线粒体断裂在药物去除后是可逆的,留下正常的线粒体和健康的细胞。其他刺激,如病毒感染,也可以诱导与凋亡无关的线粒体断裂。例如,一种与Bcl-2家族成员相互作用以阻止线粒体凋亡的巨细胞病毒蛋白的表达(Arnoult等人,2004年;Poncet等人,2004年;Karbowski等人,2006年)vMIA(病毒线粒体局部凋亡抑制剂)导致线粒体网络断裂,同时起到阻止细胞死亡的作用(McCormick等人,2003年). 因此,虽然凋亡只是导致线粒体分裂的多种条件之一,但似乎总是与线粒体断裂有关。此外,线粒体过度分裂似乎是内在凋亡途径中的一个必要步骤,至少对细胞色素的正常速率而言是如此c(c)释放和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活,作为线粒体裂变机制的几个组成部分,Drp1、Fis1和Endophilin B1,与细胞程序性死亡进程有关。

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细胞色素c(c)在凋亡过程中释放。放线菌素D和z-VAD-FMK(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)处理的多个HeLa细胞的共聚焦图像。绿色代表细胞色素c(c)免疫荧光。(1) 具有长线粒体和细胞色素的健康细胞c(c)存在于线粒体中。(2)在细胞凋亡的早期,线粒体断裂,而一些细胞色素c(c)在细胞凋亡的后期,线粒体也逐渐破碎,但细胞色素c(c)开始在胞浆中可见。(4) 完全释放后,细胞色素c(c)不再位于线粒体内(由Mariusz Karbowski拍摄)。细胞色素的时间进程c(c)已经证明其相对快速和完整,表明线粒体断裂发生在细胞色素之前或期间c(c)发布过程。

Drp1介导细胞色素c(c)细胞凋亡过程中的释放

在细胞凋亡刺激时,Drp1被募集到线粒体外膜(Frank等人,2001年;Breckenridge等人,2003年;Arnoult等人2005年b;Wasiak等人,2007年)在裂变位置与Bax和Mfn2共定位(Karbowski等人,2002年). Drp1功能是线粒体凋亡分裂所必需的,因为显性阴性突变(Drp1K38A)的表达或RNAi对Drp1的下调会延迟线粒体断裂、细胞色素c(c)释放、caspase激活和细胞死亡(Frank等人,2001年;Breckenridge等人,2003年;Lee等人,2004年;Germain等人,2005年;Barsoum等人,2006年). 类似地,Drp1内生活性缺失突变的细胞株对过氧化氢诱导的细胞死亡(一种凋亡过程)表现出抵抗力(Tanaka等人,2006年). RNAi抑制Drp1活性(Lee等人,2004年;Germain等人,2005年)在Bax易位下游和细胞色素之前的一个独特步骤抑制细胞凋亡c(c)释放,使Drp1非常接近Bax在线粒体上的作用位点。

Drp1的翻译后修饰调节其在细胞凋亡中的作用

细胞中磷酸化突变体Drp1 S656D的表达导致线粒体伸长,并增加了对staurosporine和etoposide介导的凋亡的抵抗力(婴儿床和Strack 2007). 另一方面,随着Drp1中S656A突变,保守的PKA磷酸化位点的消除,导致线粒体碎片增加,对凋亡刺激的敏感性更高(婴儿床和Strack 2007).

Drp1 sumoylation也与细胞凋亡有关。在细胞凋亡过程中,Drp1 sumoylation增加(Wasiak等人,2007年)以及与OMM的Drp1关联增加和线粒体分裂增加。本研究表明,在线粒体断裂后,但在细胞色素之前,Drp1与线粒体的关联以Bax/Bak依赖的方式稳定c(c)释放。因此,Drp1的翻译后修饰影响细胞对凋亡的敏感性,并进一步将线粒体裂变机制与程序性细胞死亡联系起来。

一个重要的限制条件是,与下面的一些非哺乳动物示例相反,哺乳动物系统中对Drp1的抑制通常是不完整的,并且代表延迟而不是阻塞。这可能反映了抑制Drp1活性本身对哺乳动物细胞是致命的或有害的,和/或Drp1仅与Bax和Bak的活性间接相关,后者更集中地介导程序性细胞死亡。Drp1对Mfn1/2、OPA1甚至Miro-1的影响,Miro-1是最近发现的一种OMM GTPase,可介导caspase在果蝇属(Yi等人,2007年),可能是关键。如果死亡刺激如此之大,以至于Bcl-xL只能部分保护细胞,那么Drp1抑制可能对细胞活力几乎没有影响,即使细胞色素受到抑制c(c)释放是显而易见的(Parone等人,2006年).

除哺乳动物外,Drp1对许多其他真核生物的程序性细胞死亡至关重要,包括真菌、圆虫和苍蝇。在丝状子囊菌中柄孢霉线粒体动力学、细胞凋亡和寿命控制之间的联系(Scheckhuber等人,2007年). 的老化鹅绒委陵菜与正常丝状线粒体网络断裂成点状单位有关。通过减法杂交分析,Scheckhuber及其同事发现,在衰老阶段,一个编码Drp1同源基因PaDnm1p的基因表达增加,这与线粒体断裂增加有关(Scheckhuber等人,2007年). 值得注意的是,菌株缺乏帕德姆1平均寿命增加了11倍。重新引入帕德姆1恢复这种表型。此外,线粒体DNA重组是衰老的分子标志鹅绒委陵菜中未观察到帕德姆1突变体。类似地,在帕德姆1缺失菌株,可能是由于较长的丝状线粒体的氧化磷酸化效率较高。此外,帕德姆1缺失菌株对外源性DNA损伤剂足叶乙甙具有耐药性。线粒体动力学对衰老的影响也显示在酿酒酵母通过删除Dnm1号机组图1基因(Scheckhuber等人,2007年). 这些缺失菌株显示了寿命的延长和老母细胞适应性的改善。

虽然单细胞生物的作用不如后生动物清楚,但酵母被认为经历了一种程序性细胞死亡(Hardwick和Cheng 2004). 例如,酵母可能需要细胞死亡途径来应对环境压力或病原体的感染。Dnm1是Drp1的酵母同源物,已被证明在暴露于环境应激后促进线粒体分裂和细胞死亡(Fannjiang等人,2004年). 此外,大多数酵母菌株持续受到相关卫星dsRNA M病毒(“M杀手病毒”)的感染,这些病毒在交配期间通过细胞-细胞融合传播给新宿主。研究表明,酵母细胞对M1和M2杀伤菌株敏感,而缺乏Dnm1的突变体对这些病毒诱导的细胞死亡具有显著抵抗力(伊万诺夫斯卡和哈德威克2005). 这些研究表明,酵母中存在涉及线粒体裂变机制的细胞死亡途径。

秀丽线虫显示明确定义的发育性程序性细胞死亡,利用涉及Bcl-2家族成员和半胱天冬酶的既定遗传途径(Metzstein等人,1998年). 在这个模型中,已经发现使用显性负性Drp1突变体(Drp1K40A)降低Drp1活性会导致正常死亡的约15%的细胞存活不良,相当于已知促凋亡基因中功能缺失突变较弱的细胞存活数量塞得-3,塞得-4、和egl-1另一方面drp1(数字参考1)胚胎发生期间,约20%的正常存活细胞的线粒体断裂和凋亡增加(Jagasia等人,2005年).

最近的两项研究表明,Drp1介导的线粒体网络在凋亡过程中的断裂在黑腹果蝇(Abdelwahid等人,2007年;Goyal等人,2007年). 线粒体网络的破坏已被证明发生在体内生理发育程序性细胞死亡期间,以及当体外培养的原代苍蝇细胞暴露于各种凋亡刺激时,包括足叶乙甙、放线菌素D、环己酰胺和C6-神经酰胺(Goyal等人,2007年). 有趣的是,使用RNAi介导的敲除或基因突变抑制Drp1同时抑制线粒体断裂和细胞死亡的诱导(Goyal等人,2007年). Drp1突变果蝇的中枢神经系统增大,也表明发育性细胞死亡需要线粒体裂变机制(Goyal等人,2007年). 研究表明,Hid和Reaper在苍蝇细胞中的表达会导致线粒体形态和细胞色素的改变c(c)释放(Abdelwahid等人,2007年). 已经证明,这些变化与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活有关,尽管不是直接的结果,因为单靠半胱氨酸蛋白酶的激活不会导致这些线粒体的破坏。此外,通过突变降低Drp1活性可降低胚胎对凋亡的敏感性(Abdelwahid等人,2007年).

最近,一种被称为mdivi-1的Dnm1抑制剂被发现可以阻断酵母和哺乳动物细胞中的线粒体分裂,该抑制剂是通过化学库的酵母筛选鉴定出来的(Cassidy-Stone等人,2008年). 在诱导凋亡后,mdivi-1抑制Drp1向线粒体、细胞色素的移位c(c)释放,磷脂酰丝氨酸出现在细胞外膜上,这是细胞死亡的典型标志。重要的是,该化合物还阻断Bax和Bid介导的分离线粒体的通透性,这表明Drp1在Bax介导的线粒体通透性中的作用是非常直接的证据。

总之,这些结果表明,Drp1可能与裂变或融合机制的其他成分一起参与了介导线粒体膜通透性的过程。膜融合事件通常利用成孔结构域来启动脂质双层的融合,这种可能参与线粒体融合的成孔分子可能被凋亡机制劫持,从而使线粒体渗透。这种劫持可能发生在Bax和Bak在线粒体的融合/裂变焦点中与Drp1相遇的时候(图5A).

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线粒体形态发生机制和凋亡进展的竞争模型。(A类)线粒体病灶模型。发件人左边正确的,Bax(橙色)易位到线粒体并与Drp1、丝裂原融合蛋白和Bak(见图例)结合成病灶,导致线粒体分裂和细胞色素释放c(c)(红色小圆圈)从线粒体存储。(B类)细胞凋亡的嵴模型。Drp1(黄色)在OMM上形成收缩位点(左边)然后是少量的细胞色素c(c)通过Bax/Bak孔从膜间隙释放(中间的). (赖特)最后,嵴进行重塑,打开连接处以释放更多的细胞色素c(c)存储在矩阵中。

通过发现Drp1可变地影响不同蛋白质的线粒体释放,提出了另一种模型。例如,细胞色素c(c)在Drp1缺失的细胞中,释放可能比Smac/DIABLO更有效地被阻断(Parone等人,2006年;Estaquier和Arnoult 2007). Scorrano及其同事最初提出的模型(Scorrano等人,2002年)说明线粒体分裂和融合成分调节线粒体嵴,以影响膜间空间蛋白的释放,这些蛋白可能被嵴内靠近OMM的紧密膜连接选择性地保留(图5B). 与此模型一致,Drp1被证明可以调节由促凋亡BH3-only蛋白Bik启动的嵴重塑,Bik可能控制细胞色素c(c)线粒体膜嵴皱襞内的释放(Germain等人,2005年).

Fis1调节细胞死亡和衰老

Fis1或Drp1的下调抑制线粒体分裂并减少细胞凋亡,但它们似乎在通路的不同步骤起作用,因为只有Fis1的下调才能抑制Bax易位和构象变化(Lee等人,2004年). 减少图1使用shRNA的表达水平也会导致衰老相关的表型变化,包括细胞增殖减少、细胞粒度增加和细胞扁平化,以及线粒体持续伸长表型(Lee等人,2007年). 细胞衰老可能发生在细胞增殖和分裂延长后(复制性衰老),或由于亚致死应激(应激诱导的过早衰老)。有趣的是图1这种表达表现为亚致死应激,因为线粒体延长与活性氧水平增加和线粒体膜电位损失相关。Fis1和融合蛋白OPA1的同时或连续缺失逆转了伸长表型和衰老的诱导,提供了强有力的证据表明过度的线粒体融合是衰老相关细胞变化的原因。然而,同时敲除Fis1和OPA1并不能逆转凋亡抵抗,这表明凋亡表型不是细胞衰老状态的间接结果,也不是线粒体过度分裂的直接结果(Lee等人,2004年).

Fis1过度表达诱导线粒体分裂和凋亡(James等人,2003年)进一步将Fis1与细胞死亡联系起来。然而,重要的是要注意,蛋白质的过度表达会导致许多非生理应激,而多种OMM蛋白(如Tom20)的过度表达会诱导线粒体断裂。Fis1K148R在突入膜间隙的区域有点突变,保留了线粒体碎片的能力,但未能诱导细胞死亡(Alirol等人,2006年)表明Fis1在线粒体分裂和凋亡中的作用可以分离。

内皮素B1/Bif-1/SH3GLB1在Bax活性和凋亡中的作用

Bax在凋亡过程中易位到线粒体,并在细胞死亡时集中在线粒体表面(Youle和Strasser 2008). Bax形成病灶的线粒体上的位点通常与Drp1(和Mfn2)病灶共定位,并经常成为线粒体分裂的位点(Karbowski等人,2002年). 两组使用酵母双杂交筛选Bax结合蛋白独立发现(Cuddeback等人,2001年;Pierrat等人,2001年),内皮素B1(也称为Bif1和SH3GLB1)是一种直接将线粒体形态发生过程与凋亡诱导联系在一起的蛋白质。内皮素B1在酵母和哺乳动物细胞中结合Bax,尽管后者的相互作用似乎仅在诱导凋亡后短暂维持(Takahashi等人,2005年). 内皮素B1−/−小鼠自发肿瘤发生率增加(Takahashi等人,2007年)并且无论是内亲素B1 RNAi还是敲除都抑制Bax易位和细胞色素c(c)细胞凋亡刺激诱导的释放(Takahashi等人,2005年). 此外,在健康细胞中需要内皮素B1来维持OMM形态(Karbowski等人,2004b),与细胞凋亡过程中被破坏的膜相同。有趣的是,内皮素B1能够改变膜的曲率(Farsad等人,2001年)因此,可能会改变线粒体膜的形状,从而在细胞凋亡过程中诱导Bax插入和齐聚。改变单层曲率的脂质促进Bax插入双层膜(Basanez等人,2002年)这表明,在细胞凋亡过程中,内皮素B1向OMM的移位可能通过改变OMM的曲率促进Bax插入线粒体膜的特定区域。此外,内皮素B1包含一个SH3结构域,与内皮素A1与动力蛋白相互作用类似,该结构域可能结合有丝分裂素或Drp1中的PXXP基序。最近,来自内皮素B1的细胞−/−小鼠被发现缺乏自噬能力,而内皮素B1被发现部分定位于自噬体上的病灶(Takahashi等人,2007年)表明线粒体分裂和自噬之间的联系,正如最近用Drp1抑制所做的那样(Twig等人,2008年).

线粒体融合机制与细胞凋亡

丝裂霉素与细胞凋亡

细胞凋亡过程中的线粒体断裂可能是由过度分裂和/或融合不足引起的。细胞凋亡过程中线粒体上Drp1的积累表明,裂变速率的刺激可能介导线粒体断裂过程。然而,使用可光活化的GFP方法直接测量的线粒体融合被发现在线粒体外膜上形成Bax焦点的凋亡过程中被阻断(Karbowski等人,2004a).

更直接的证据也表明,抑制线粒体融合促进细胞凋亡。沉默Mfn1或Mfn2会导致线粒体断裂,并增加对凋亡刺激的敏感性(Sugioka等人,2004年). 此外,Mfn1或2的过度表达除了增加线粒体连接外,还导致Bax活化延迟,细胞色素c(c)释放和凋亡死亡,提示有丝分裂素在细胞死亡中起作用。

显性活性Mfn2的过度表达,Mfn2GTPase P-loop中的残基被活性Ras(Mfn 2G12V)的残基所取代,发现其抑制凋亡的效果优于野生型Mfn 2(Neuspiel等人,2005年). 与野生型Mfn2相比,Mfn2G12V显示核苷酸交换率增加,水解水平降低,表明与GTP的结构性结合状态,这会影响细胞凋亡,但不会进一步增加线粒体融合活性(Neuspiel等人,2005年;Jahani-Asl等人,2007年). 另一个Mfn2突变体在暴露于线粒体膜间隙(Mfn2W631P)的三个保守残基中的一个发生突变,无法保护细胞免受staurosporine和UV处理诱导的凋亡(Neuspiel等人,2005年). 然而,通过含有Mfn2G12V和Mfn2-W631P取代基的双突变体恢复了保护作用。

Mfn2也被证明抑制ERK/MAPK信号通路(Chen等人,2004年). 缺乏线粒体融合活性所需的C末端线圈结构域的Mfn2突变体仍然抑制ERK1/2激活(Chen等人,2004年)表明Mfn2对ERK1/2信号的调节独立于其在线粒体融合中的作用。自从ERK激活被证明可以介导细胞凋亡诱导以来(Cheung和Slack 2004),Mfn2可能通过抑制ERK信号保护细胞,而不依赖于Mfn2-线粒体融合活性。最近的两项研究表明,心肌细胞中Mfn2的过度表达(Shen等人,2007年)或血管平滑肌细胞(Guo等人,2007年)通过抑制Ras–PI3K–Akt信号诱导细胞凋亡。在此,建议Mfn2以促凋亡的方式发挥作用。

需要OPA1来保护细胞免受凋亡

OPA1缺失诱导细胞自发凋亡,在凋亡和线粒体形态发生之间提供另一个重要联系(Olichon等人,2003年). 这项开创性研究发现,Bcl-2过表达抑制OPA1 RNAi引起的细胞死亡,使线粒体融合在线粒体外膜通透性上游的细胞死亡中发挥作用。OPA1的过度表达可防止线粒体分裂并保护细胞免受线粒体途径引起的凋亡死亡,但不能通过绕过线粒体的外源途径诱导细胞凋亡(Frezza等人,2006年). 缺乏功能性GTPase和C末端GTPase效应域(GED)的OPA1突变体无法保护细胞免受细胞死亡(Frezza等人,2006年). 这些结构域是OPA1线粒体融合活性所必需的(Cipolat等人,2004年)表明这两种功能,即抗凋亡和线粒体融合,可能是相关的。然而,异位OPA1表达也保护了Mfn1、Mfn2双敲除细胞,但没有逆转其融合缺陷,这表明OPA1可以独立于介导线粒体融合而阻断凋亡。哺乳动物opa1该基因有来自外显子4、4b和5b选择性剪接的八种RNA转录变体(Deletere等人,2001年). 使用4、4b和5b siRNAs敲除OPA1转录本表明,含有外显子4的OPA1转录物对线粒体融合很重要,而含有外显基因4b或5b的变体则起到调节细胞色素的作用c(c)释放(Olichon等人,2007年).

OPA1、嵴重塑和凋亡

OPA1的下调不仅诱导自发凋亡和线粒体断裂,还破坏正常的嵴结构(Olichon等人,2003年;Arnoult等人,2005a;Frezza等人,2006年). 因此,由于大量的细胞色素c(c)似乎位于健康细胞的嵴内,有人认为完整的细胞色素c(c)如果没有嵴重塑,线粒体就无法释放(Scorrano等人,2002年). 嵴连接似乎由OPA1寡聚物结合在一起,该寡聚体由完整的内膜长型和更易溶解的蛋白酶加工短型组成。用tBid孵育分离的线粒体诱导OPA1低聚物的破坏(Frezza等人,2006年)改变嵴形态(Arnoult等人,2005a;Frezza等人,2006年). 此外,tBid诱导细胞色素的增加c(c)OPA1的过度表达阻止了从嵴内释放到膜间间隙,而Opa1公司GTPase结构域中突变的基因增加了嵴连接的宽度(Frezza等人,2006年). 综上所述,这些数据表明GTPase活性对OPA1亚型的寡聚化和保留细胞色素很重要c(c)在线粒体基质中。

然而,高浓缩线粒体的嵴连接足够宽,可以容纳细胞色素等小蛋白c(c)进入膜间空间(里德和格林2002). 其他滞留机制可能在抑制细胞色素方面发挥作用c(c)透化线粒体的释放,如细胞色素的结合c(c)心磷脂(Ott等人,2002年). 利用透射电镜的高分辨率技术研究了细胞凋亡刺激后嵴超微结构的变化,得出的结论是,尽管线粒体内膜的重塑发生在细胞凋亡过程中,但它发生在细胞色素之后c(c)释放(Sun等人,2007年). 嵴重塑还需要活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶,因为它被一种通用的半胱氨酸蛋白酶抑制剂阻断,使其位于细胞色素下游c(c)释放。

细胞色素释放后,OPA1从线粒体释放c(c)(Arnoult等人,2005a). Arnoult及其同事提出了一种模型,即可溶性OPA1的初始泄漏会导致嵴连接处OPA1寡聚体的破坏,从而导致嵴结构的改变,从而促进额外的OPA1和细胞色素池的释放c(c)进入细胞溶质(Arnoult等人,2005a). 然而,Drp1K38A阻止线粒体释放OPA1(Estaquier和Arnoult 2007)表明在细胞凋亡过程中,释放是在Drp1和线粒体断裂的下游。因此,有证据支持和反对图5这表明线粒体形态发生蛋白如何调节细胞凋亡的其他假说应该被考虑。

Bcl-2家族成员调节健康细胞线粒体形态

虽然Bax和Bak具有既定的促凋亡能力,但最近的一项研究表明,这些蛋白质在健康细胞中对线粒体融合的调节作用(Karbowski等人,2006年). 在Bax/Bak双敲除(DKO)细胞中,线粒体融合减少,使用显性负性抑制剂Drp1K38A或RNAi抑制Drp1活性不会促进线粒体伸长,表明Bax和Bak激活线粒体融合而不干扰正常的裂变过程。与此模型一致,Bax和Bak的存在改变了健康细胞中Mfn2复合物的组装、迁移和沿线粒体的分布(Karbowski等人,2006年).

与Bax和Bak可以激活Mfn2以促进线粒体融合的证据一致,Bax和Bak在健康细胞中与Mfn1和Mfn2结合,表明它们可能通过直接相互作用调节线粒体融合蛋白功能(Brooks等人,2007年). 然而,这可能相当于健康细胞中Bax的一小部分,因为大多数Bax在胞浆中是单体的。有趣的是,Brooks等人证明,在细胞凋亡期间,Bak对Mfn2的亲和力降低,而对Mfn 1的亲和力增加(Brooks等人,2007年). 在凋亡刺激下,Bax易位到线粒体。因此,奇怪的是,在凋亡期间Bax–Mfn2相互作用没有变化(Brooks等人,2007年). 目前尚不清楚Bax和Bak如何在健康细胞中促进线粒体融合,以及在凋亡期间参与线粒体分裂。Bax和Bak在凋亡过程中都会改变亚线粒体的定位和构象,这可能会改变它们与Mfn2和嗜内素B1等蛋白质的相互作用,从而改变它们对线粒体形态发生机制的影响。

其他Bcl-2家族成员与Mfn2相互作用。CED-9,Bcl-2同源物秀丽线虫,通过结合APAF1同源物CED-4抑制细胞凋亡。在细胞凋亡过程中,EGL-1、秀丽线虫BH3-only蛋白,与CED-9结合,释放CED-4促进细胞死亡。Delivani及其同事表明,CED-9和Bcl-xL的表达通过与Mfn2的直接相互作用导致线粒体融合(Delivani等人,2006年). 哺乳动物细胞中CED-9过度表达导致线粒体融合,但不抑制凋亡,使这两个过程脱钩(Delivani等人,2006年). 这项研究还表明,CED-9突变蠕虫的线粒体形态异常,支持抗凋亡Bcl-2蛋白在维持健康细胞线粒体网络中的作用。

巨细胞病毒编码蛋白vMIA通过与促凋亡Bax和Bak蛋白的相互作用抑制细胞凋亡(Arnoult等人,2004年;Poncet等人,2004年;Karbowski等人,2006年). 基于其一级序列,vMIA与Bcl-xL几乎没有相似性,尽管这两种蛋白都能保护细胞免受各种凋亡刺激(Goldmacher等人,1999年). vMIA的表达也会导致线粒体网络的急剧破坏(McCormick等人,2003年). 抗凋亡和线粒体表型可能通过Bax和Bak的失活发生,而Bax和Bak是丝裂原依赖性融合所必需的。支持这一点的是,异位Bax能够逆转vMIA表达导致的片段化表型,而缺乏BH3结构域的Bax的表达使得Bax在凋亡诱导中不起作用,当vMIA被表达时,不能拉长线粒体(Karbowski等人,2006年). 有趣的是,Bak BH3结构域的突变也改变了其在凋亡过程中改变构象和与Mfn2分离的能力(Brooks等人,2007年). 总之,这些研究表明Bax和Bak BH3结构域在促进健康细胞凋亡和调节线粒体形态方面的功能可能存在联系。

总结

介导线粒体分裂和融合的分子机器的特性和机制正在迅速被理解。这为探索线粒体形态发生在蛋白质和DNA质量控制、程序性细胞死亡、衰老、自噬和活性氧生成等方面的拟议生理作用提供了工具。来自各种实验的证据表明,线粒体的形态本身并不直接参与细胞凋亡,但裂变和融合机制的成员参与了细胞凋亡。然而,这种作用的分子基础尚不清楚。目前缺乏对Bcl-2家族蛋白功能的统一假设,因为人们认为它们可以调节细胞凋亡秀丽线虫和哺乳动物通过不同的机制。了解Bcl-2家族成员如何与线粒体分裂和融合机制联系可能揭示一种共同的潜在功能。

致谢

我们感谢王春欣(Chunxin Wang)和卡博夫斯基(Mariusz Karbowski)提供的图片(分别为图2和图4),感谢田中Atsushi Tanaka和梅根·克莱兰德(Megan Cleland)对手稿的批判性评论和阅读。

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社