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FEBS J公司。作者手稿；PMC 2008年11月11日提供。
以最终编辑形式发布为：
FEBS J.2007年11月；274(21): 5518–5532.
2007年10月3日在线发布。 数字对象标识：10.1111/j.1742-4658.2007.06068.x
预防性维修识别码：下午2580780
大厅：哈尔姆斯322435
PMID：17916086

Krit 1与微管和微膜的相互作用由Rap1和整合素胞质域相关蛋白-1调节

苏菲·贝劳德·杜福尔,1 罗曼·戈蒂埃,1 科琳娜·阿尔比奇斯·里佐,2 皮埃尔·查丁,1和伊娃·福罗伯特1中，2,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

小G蛋白Rap1调节多种细胞过程，如整合素激活、细胞粘附、细胞间连接形成和细胞极性。识别Rap1效应器对更好地理解控制这些过程的信号通路至关重要。Krit1是一种FERM蛋白，在酵母双氢筛选中被鉴定为Rap1伴侣，但这种相互作用在随后的研究中没有得到证实。由于有证据表明Krit1在Rap1依赖性通路中发挥作用，我们重新研究了这个问题。在这里，我们通过生化分析证明Krit1是一种特定的Rap1效应器。我们发现，与其他FERM蛋白一样，Krit1采用两种构象：一种是N端NPAY基序与C端相互作用的闭合构象，另一种是与ICAP-1结合的开放构象，ICAP-1是焦点粘附组装的负调控因子。我们证明，在体外Krit1、Rap1和ICAP-1之间可以形成三元络合物，并且Rap1在闭合和开放构象中结合Krit1 FERM结构域。与ICAP-1不同，Rap1不打开Krit1。使用沉淀分析，我们表明Krit1在体外通过其N和C末端与微管结合，并且Rap1和ICAP-1抑制Krit1与微管的结合。一贯地，YFP-Krit1定位于BHK细胞中CFP标记的微管上，并在与激活的Rap1V12共表达时从微管中去定位。最后，我们证明Krit1与PIP绑定2含有脂质体和Rap1增强了这种结合。基于这些结果，我们提出了一个模型，在该模型中，Krit1将通过微管传递到质膜，并在质膜中被Rap1和ICAP-1捕获。

关键词：氨基酸基序，动物，结合位点，Cricetinae，细胞内信号肽和蛋白质，代谢，膜蛋白，代谢，细胞膜，代谢，微管相关蛋白，化学，代谢，小管，代谢，模型，生物，模型，分子，蛋白质构象，转染，两种杂交系统技术，rap1 GTP-结合蛋白质，代谢
关键词：Rap1、Krit1、CCM1、FERM结构域、PTB、微管、PIP2

简介

小G蛋白Rap1（Krev-1）是Ras超家族的一员，自从发现它调节多种细胞过程，如整合素激活和细胞粘附、细胞扩散、细胞极性和细胞-细胞连接形成以来，它就被提到了前沿[1],[2][三]. 为了深入了解这些途径，已经确定了多种与活性Rap1GTP结合形式相互作用的效应蛋白。其中，富含淋巴组织的RAP1激活整合素αLβ2，很可能通过与αL整合素相互作用[4]RIAM与不同的肌动蛋白调节因子结合，参与结合并激活β整合素的整合素激活复合物[5]. VAV1和TIAM1通过Rap1GTP定位到细胞扩散位点，并作为Rac的交换因子[6]. ARAP3是RhoA和Arf6的GTPase激活蛋白，影响PDGF诱导的跛足足形成[7]. 在网柄菌中，Phg2促进趋化细胞前部肌球蛋白II的分解，促进丝状蛋白介导的前缘突起[8]. Afadin/AF6参与细胞-细胞连接的成熟[9].

Krit1（Krev Interaction Trapped基因）于1997年在酵母双氢筛选中被鉴定为Rap1伴侣[10]，但随后的研究并未证实它们之间的相互作用[11]从而得出Krit1不是Rap1合作伙伴的结论[12]. 然而，关于Krit1在Rap1调节的细胞过程中的潜在作用的一些证据促使我们重新考虑这个问题。首先，最近已经证明，整合素依赖于Rap1的激活需要talin结合到β整合素的细胞质尾部[13]. Talin是一种重要的整合素激活蛋白，将β整合素的胞质尾部连接到肌动蛋白细胞骨架[14]. ICAP-1（整合素细胞质域相关蛋白）是β1整合素的细胞质尾部的伴侣，已被证明与talin竞争与β1整合素的结合[15]. 与野生型细胞相比，ICAP-1阳性成骨细胞和成纤维细胞上的纤维连接蛋白受体构象活跃，β1依赖性细胞粘附增强[16],[17]. 相反，ICAP-1的过度表达会减少细胞扩散并破坏局部粘连[15]. 这些结果表明，在静息状态下，β1整合素通过ICAP-1与其细胞质尾部的结合而保持非活性。有趣的是，Krit1是ICAP-1的合作伙伴[11], [18]. 酵母双氢化物研究表明，Krit1与β1整合素竞争结合ICAP-1[11]提示Krit1可以减轻ICAP-1对β1整合素活化的抑制作用。第二个证据与Krit1基因突变相关的人类遗传病的存在有关。CCM1（脑海绵状畸形1）对应于以扩张的薄壁血管簇为特征的脑毛细血管畸形[19]. 这些病变通常出血，导致癫痫发作、局部神经功能缺损或中风。超微结构研究表明，这些病变的内皮细胞之间没有紧密连接，周围的基底膜肥大[20].

对Krit1蛋白及其亚细胞定位知之甚少。首先，Krit1 C-末端氨基酸序列与FERM结构域（存在于四点酮/Ezrin/Radixin/Moesin带中）具有同源性。FERM结构域将蛋白质定位在质膜上，在那里它们可以与磷脂酰肌醇和膜蛋白相互作用[21]. talin的FERM结构域与磷脂酰肌醇4，5-P相互作用2（PIP2)和β整合素的细胞质尾部[14]. 此外，具有FERM结构域的蛋白质通常以两种构象状态存在：一种是封闭的“非活性”构象，其中FERM结构区被蛋白质的另一部分掩盖；另一种是开放的“活性”构像，其中FERM-结构域被揭开。裂解、磷酸化或（PIP2)绑定是激活信号[21]. 第二，据报道Krit1与BAEC中的微管蛋白相互作用，并沿微管长度修饰微管[22]. 然而，这种相互作用受到质疑，因为本研究中使用的抗体在western blot上识别出一种较小的蛋白质。另一种抗体已经鉴定出一种预测大小的蛋白质，但Krit1的主要位置尚待确定[39]. 由于已知微管可以调节局灶性粘附组装的动力学[23],[24]，我们再次强调了这一重要问题。

在本文中，我们寻求Krit1与Rap1、微管和膜的相互作用。我们表明，Krit1与许多具有FERM结构域的蛋白质一样，采用闭合构象。该闭合构象由ICAP-1打开。重要的是，我们确认Krit1专门与Rap1相互作用，并优先与活跃的Rap1（GTP绑定形式）相互作用，从而结束了关于这一点的争论。我们发现Rap1在其闭合和开放构象中都与Krit1的FERM结构域结合，并且与ICAP-1不同，Rap1不开放Krit1。此外，我们证明Krit1、Rap1和ICAP-1可以在体外形成三元复合物。我们发现Krit1与体外聚合微管和PIP相互作用2在人造膜上。值得注意的是，我们证明了Rap1和ICAP-1在体外抑制Krit1与微管的结合，并且Rap1刺激Krit1结合膜。一贯地，YFP-Krit1定位于BHK细胞中CFP标记的微管上，并在与激活的Rap1共同表达时从微管中去定位。

结果

Krit1包含假定的FERM域并绑定到PIP2

原型ERM蛋白的FERM结构域的三维结构，即ezrin、radixin和moesin，已通过结晶学进行了解析[25],[26],[27]. 它们由以三叶草形状排列的三个子域F1到F3组成(图1A). F3亚结构域类似于PTB结构域，是一种与蛋白质NPxY基序结合的保守结构折叠[28]. 使用Blast程序对Krit1序列进行分析表明，Krit1的最后300个氨基酸残基与典型ERM蛋白（ezrin、radixin、moesin、talin）的F1、F2、F3亚结构域具有大约20%的同源性。尽管这是比较建模的下限，但我们还是能够根据与IP3复合物中基数F1和塔利班F2–F3的同源性，生成Krit1 F1和F2-F3亚结构域的模型。(图1B). 这些模型在分子动力学模拟中显示了非常稳定的二级结构和能量，有力地支持了Krit1 C末端折叠为FERM结构域的观点。

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Krit1包含假定的FERM域并绑定到PIP2

（A） Radixin-IP3共晶结构。IP3为黄色，F1（K53、K60、K63、K64）和F3（R273、R275、R279）结构域的基本残基为红色。色氨酸W58为绿色。（B） Krit1的F1、F2和F3结构域的同源模型。三个独立建模的子域被手动排列为radidin结构。F1（K475、K479、R485）和F3（K713、K720、K724）结构域的基本残基为红色。色氨酸W487为绿色。

（C） Krit1（1μM）与含有或不含2%PIP的质膜混合脂质体（0.75 mM）孵育2在不同NaCl浓度下。离心后，用SDS-PAGE分析上清液（S）和颗粒（P）中的蛋白质，并用荧光法定量。去除了不含脂质体的蛋白质沉淀。Krit1带以下的带是大肠杆菌污染物，也与PIP结合2.

FERM域的一个功能特征是其与PIP交互的能力2在质膜上。在radidin-IP3共晶体中，IP3与位于F1和F3亚结构域之间的基本裂口结合，并折叠在裂口疏水基的色氨酸周围[26] (图1A). 有趣的是，在我们的Krit1 FERM结构域模型中，在亚结构域F1和F3之间的缝隙中也发现了碱性残基，并且口袋底部的色氨酸是保守的(图1B)这意味着Krit1将具有与膜上磷离子结合所需的结构特征。因此，我们测试了Krit1与PIP结合的能力2包含膜。Krit1与添加或不添加2%PIP的人工脂质体孵育2NaCl浓度增加时。在100 mM NaCl下，70%的Krit1与PIP结合2含有脂质体，而不到10%与不含PIP的脂质体结合2表明Krit1主要与PIP相互作用2在这些脂质体上(图1C). 此外，盐浓度的增加降低了Krit1结合，突出了这种相互作用的静电状态(图1C).

Krit1以ICAP-1打开的闭合构象存在

有趣的是，除了其C末端FERM结构域外，Krit1在其N末端上还有一个NPAY基序，该基序与ICAP-1结合[11], [18]. Krit1的这种特性使我们不禁要问，这个基序是否能与Krit1 F3 PTB样的子结构域相互作用。为了验证这个假设，我们分别表达了His-tagged N末端（1到207 aa）和GST-C末端（207-end），分别称为Krit1-NTer和GST-HypoKrit1(图2A). GST下拉分析是通过以100 nM的浓度混合这两个片段进行的。值得注意的是，Krit1-NTer与GST-HypoKrit1和用作阳性对照的GST-ICAP-1特异性结合，但它不单独与GST结合(图2B). 为了测试NPAY基序是否参与这种相互作用，我们将Asn192和Tyr195突变为Krit1-NTer中的丙氨酸(图2A). Krit1-NTer APAA突变体与GST-HypoKrit1没有相互作用，与GST-ICAP-1的相互作用非常弱，如之前报道的那样[11] (图2B). 在另一项分析中，当以等摩尔浓度添加Krit1-NTer时，ICAP-1完全阻止了Krit1-NTer（5μM）与GST-HypoKrit1（3.5μM）的结合(图2C)，这与ICAP-1对Krit1-Nter的亲和力高于HypoKrit1的观察结果密切相关(图2B).

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Krit1 N和C末端部分通过NPAY基序结合在一起，ICAP-1破坏这种结合

（A） 所用Krit1碎片的示意图。FERM域：四点一，Ezrin，Radixin，Moesin；类PTB：磷酸酪氨酸结合域。ANK：安基林重复。（B） 100 nM Krit1-NTer WT或100 nM GST-HypoKrit1或GST突变株的GST下拉，遵循材料和方法中详述的实验程序。（C） ●●●●。在5μM ICAP-1存在下，3.5μM GST-HypoKrit1上5μM Krit1-NTer的GST下拉。在（A）中，GST融合用GST抗体进行免疫印迹。在（B）和（C）中，GST融合物用Ponceau红染色，Krit1-NTer和ICAP-1分别用His-tag和ICAP1抗体进行免疫印迹。输入相当于总蛋白质的1/20。这些结果代表了三个独立的实验。

这些结果表明，Krit1 C末端FERM结构域在体外与Krit1 N末端相互作用，并且这种相互作用需要ICAP-1结合基序NPAY。他们认为全长Krit1以闭合构象存在，N末端折叠在C末端，ICAP-1结合到N末端部分会破坏Krit1 N和C末端的相互作用。

Krit1以GTPγS结合形式优先与Rap1相互作用

为了回答Krit1是否是Rap1效应器的问题，即Krit1是否以GTP结合的形式优先与Rap1相互作用，我们进行了GST下拉测定。由于GST-全长Krit1在大肠杆菌中不溶，因此我们无法纯化它，因此我们研究了Rap1与GST-HypoKrit1的结合。通过GST下拉实验，我们比较了加载GDP或GTPγS的1μM Rap1与10μM GST-HypoKrit1的结合。除非另有规定，否则所有实验均采用Rap1 A亚型进行。Rap1与HypoKrit1的结合是特异性的，因为未观察到与GST的结合。Rap1GTPγS与HypoKrit1的结合强度是Rap1GDP的两倍，反映出活性Rap1对HypoKrit1的亲和力更高(图3A). 在相同的分析条件下，H-Ras GTPγS不与HypoKrit1结合(图3A). 因此，该实验表明Krit1是Rap1的特异性效应子。

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Rap1以Rap1GTP形式优先与Krit1 C末端结合

（A） GST-仅在10μM GST-HypoKrit1或GST上下拉1μM Rap1GDP、Rap1GTPγS或H-RasGTPγS。输入相当于总蛋白质的1/25。GST融合用GST抗体进行免疫印迹。分别用His-tag、ICAP-1和H-Ras抗体对Rap1、ICAP-1,H-Ras进行免疫印迹。（B） 10μM GST-HypoKrit1或10μM GST-HypoSKrit1ΔC上1μM RapGTPγS的GST下拉。输入相当于总Rap1的1/4。用His-tag抗体免疫印迹Rap1。这些数据代表了四个独立的实验。

Rap1与Krit1的C末端结合

Serebriiskii等人在最初鉴定的Krit1的N截断形式的50个最后a.a残基中为Rap1定位了一个结合位点[10]. 为了验证此结果，在GST-HypoKrit1中删除了此站点(图2 A). 由此产生的GST-HypoKrit1ΔC突变体的F3亚结构域有一半被截短。我们使用的实验条件与图3AKrit1 C-末端的缺失消除了Rap1GTPγS与GST-HypoKrit1的结合(图3B)，确认Rap1与Krit1 C末端FERM结构域结合。

Krit1、Rap1和ICAP-1在体外形成三元复合物

由于Krit1可以独立地与ICAP-1和Rap1相互作用，我们测试了这三种蛋白质之间是否可以形成三元复合物。我们从大肠杆菌中纯化了His-tagged全长Krit1，并通过将全长Krit 1与最终浓度为5μM的Rap1GTPγS和GST-ICAP-1混合来进行GST下拉(图4). Krit1与GST-ICAP-1特异性相互作用，而不仅仅与GST相互作用。这种相互作用很强，用Sypro Orange对蛋白质进行染色即可揭示。正如预期的那样，Rap1GTPγS没有与GST-ICAP-1相互作用。有趣的是，当Krit1和Rap1GTPγS一起添加时，Rap1GTPγS与Krit1一起在GST-ICAP-1珠上被拉下。Rap1的免疫印迹是揭示Rap1结合所必需的，表明Krit1与Rap1之间的相互作用弱于与ICAP-1之间的相互影响。因此，本实验表明这三种蛋白质在体外形成三元复合物。

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Krit1、Rap1-GTPγS和ICAP-1在体外形成三元复合物

5μM GST-ICAP-1融合或仅GST上5μM Krit1或/和5μM Rap1GTPγS的GST下拉。凝胶的Sypro Orange染色显示Krit1与GST-ICAP-1的结合。使用His-tag抗体通过western blot观察Rap1结合。这些结果重复了三次。

Rap1与Krit1开放和闭合构象平等结合，但不开放Krit1

接下来，我们比较了Rap1与Krit1闭合构象和开放构象的结合。为此，我们通过GST测量了在缺少或存在10μM Krit1-NTer的情况下，10μM Rap1 GTPγS在3μM GST-HypoKrit1微球上的结合。重要的是，Krit-NTer与GST-HypoKrit1结合并不影响Rap1GTPγS与GST-HypoKrit1的相互作用(图5A). 相反，Rap1并没有改变Krit1-NTer与HypoKrit1的结合，这表明Rap1与Krit1结合的构象是闭合的，而不是开放的。此外，当添加10μM ICAP-1破坏了HypoKrit1和Krit1-NT之间的络合物时，Rap1GTPγS与GST-HypoKrit1之间的结合也没有改变，这意味着ICAP-1打开Krit1不会影响Rap1结合(图5A). 利用FLAG-tagged Krit1进行的FLAG下拉实验在全长Krit1上证实了这一结果。添加ICAP-1和Rap1并没有改变Rap1与Krit1的结合(图5B). 因此，Rap1和ICAP-1可以独立地与Krit1结合。总之，我们的结果表明，与ICAP-1不同，Rap1与C末端FERM结构域的结合不会诱导Krit1的开放，并且Rap1也与Krit1闭合和开放构象结合(图5C).

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Krit-Nter或ICAP-1未修改与HypoKrit1结合的Rap1

（A） GST比较-在没有或存在10μM Krit1-Nter和10μM ICAP-1的情况下，10μM Rap1GTPγS与3μM GST-HypoKrit1的结合降低。用抗-His抗体免疫印迹法检测Rap1和Krit1-Nter。抗ICAP-1抗体显示ICAP-1。（B） FLAG-将3μM Rap1GTPγS或7μM GST-ICAP-1下拉至FLAG-Krit1珠。对照对应于与未转染的BHK细胞孵育并作为FLAG Krit珠处理的珠。输入相当于总蛋白质的1/40。蛋白质用Sypro Orange染色。

这些结果代表了三个独立的实验。

（C） Krit1在与Rap1的二元络合物或与Rapl和ICAP-1的三元络合物中的构象模型。Rap1与Krit1闭合和开放构象的C末端结合。ICAP-1绑定在不干扰Rap1绑定的情况下打开Krit1。为了表示的清晰性，只表示了分子内折叠。然而，不排除Krit1两个分子之间的头尾分子间折叠。

Krit1在体外通过其N端和C端的两个位点与微管相互作用

以前已经证明Krit1与BAEC中的微管共定位[22]. 然而，这些研究中使用的抗体在western blot上识别出一个58kDa蛋白，该蛋白可能对应于Krit1的较短剪接变异体或另一个蛋白。为了解决这个问题，我们通过在蔗糖垫上沉淀来研究纯化的His标记全长Krit1与体外聚合微管（MT）的结合。当40 pmoles全长Krit1与200 pmoles纯化微管蛋白聚合的MT孵育时，60%的蛋白质与MT共沉淀(图6A)值得注意的是，Krit1制剂中含有的污染蛋白质，即使是与Krit1浓度相同的蛋白质，也不会与MT共沉淀(图6A)，强调了Krit1与MT相互作用的特异性。为了绘制负责这种相互作用的结构域，我们研究了Krit1不同片段在相同条件下的结合。Krit1-NTer片段与MT强烈结合（45%）。Krit1在其N端有六个赖氨酸和精氨酸的基本延伸，可以与MT相互作用。四种丙氨酸中氨基酸47KKRK50的突变几乎完全消除了Krit1与MT的结合(图6A)而该突变体仍能与ICAP-1相互作用（数据未显示）。GST-HypoKrit1也与MT相互作用。然而，与全长Krit1和Krit1-NTer相比，只有20%的GST-HYPoKrit 1与MT结合(图6A). 在控制范围内，GST本身并不与MT绑定(图6B). GST-HypoKrit1的F3亚结构域中的截断几乎完全消除了GST-hyboKrit1ΔC与MT的共沉积作用(图6A). 因此，有两个位点负责Krit1与微管的相互作用：一个位于蛋白质N末端部分的基本残基，以对MT具有高亲和力的残基46至50为中心，另一个位于对MT具有低亲和力的F3亚结构域上。

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Krit1通过其N端和C端的两个位点与体外微管直接相互作用，Rap1和ICAP-1抑制这种相互作用

在每个实验中，在不存在或存在紫杉醇稳定的MT的情况下培养40 pmoles的Krit1，该MT由150 pmoles纯化微管蛋白体外聚合而成，并在蔗糖梯度上离心。用SDS-PAGE分析上清液（S）和颗粒（P），用荧光法定量Krit1与MT结合的百分比。在无MT的情况下，Krit1沉淀已被减除。

（A） 使用不同的Krit1突变体鉴定Krit1上的MT结合位点。箭头表示Krit1 WT或突变体，T:Tubulin。每个实验重复两到四次。

（B） Rap1和ICAP-1抑制Krit1与MT的结合。将200摩尔的Rap1或ICAP-1添加到40摩尔的Krit1和聚合的MT中。每个实验重复三次。

Rap1和ICAP-1在体外抑制Krit1与微管的结合

在证明MT与Krit1的N-和C-末端结合后，我们询问ICAP-1或Rap1是否能够调节Krit1与MT的相互作用。因此，我们测量了200 pmoles Rap1GTPγS或GST-ICAP-1存在时，40 pmoles Krit1对MT的结合。仅Rap1GTPγS未被招募到MT，与MT结合的GST-ICAP-1少于10%(图6B). 值得注意的是，Rap1GTPγS和GST-ICAP-1均抑制Krit1与MT的结合，而GST单独对其无影响(图6B). 使用Rap1B同种型获得了类似的抑制作用（数据未显示）。然而，在这些浓度下，ICAP-1是一种比Rap1GTPγS更有效的抑制剂（80%抑制比50%）。ICAP-1效应不太可能是由于与Krit1竞争与MT结合，因为只有20 pmoles的GST-ICAP-1与150 pmoles微管蛋白结合，微管蛋白在MT中聚合，剩下约130 pmoles可用于与Krit 1相互作用。

YFP-Krit1在转染的BHK细胞中与CFP标记的微管共定位，并通过激活的Rap1从微管中去定位

为了在细胞环境中证实我们的体外结果，我们在BHK细胞中与YFP和CFP-微管蛋白共同表达Krit1。当作为阴性对照的YFP-ARNO信号在细胞液中扩散时，YFP-Krit1信号与CFP标记的微管信号重叠，表明YFP-Krit1定位于从MTOC到外周的微管。Rap1激活突变体HA-Rap1V12的共表达使细胞变平，细胞开始扩散，并显示出许多膜尖峰，仅HA-Rap1 V12也观察到这种表型（数据未显示）。值得注意的是，在表达BHK细胞的Rap1V12中，YFP-Krit1不再与CFP标记的微管共存。因此，这些实验支持我们的体外观察，即Krit1与微管结合，并且这种结合被Rap1GTP抑制。

Rap1增强HypoKrit1与凝集素囊泡的结合

Krit1的另一个特征是能够与磷脂结合。我们想知道与Krit1 FERM结构域结合的Rap1是否可以调节Krit1与膜的结合。值得注意的是，当将3μM的Rap1GTPγS添加到0.5μM的GST-HypoKrit1中时，我们观察到GST-HyboKrit 1与一个凝集素囊泡结合受到刺激(图8A). 一部分Rap1GTPγS也与囊泡一起沉淀。因为我们使用的重组未经修饰的Rap1本身不与脂质结合(图8A)，该部分实际上对应于与HypoKrit1复合的Rap1(图8A). 此外，Rap1GTPγS刺激GST-HypoKrit1结合到凝集素囊泡是剂量依赖性的，高达6倍(图8B).

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Rap1刺激Krit1与膜的结合

（A） GST-HypoKrit1（0.5μM）与无或有Rap1GTPγS（3μM）的无凝集素囊泡（1 mg/ml）孵育。离心后，用SDS-PAGE分析上清液（S）和颗粒（P），并用荧光法定量。在不存在脂质体的情况下的蛋白质沉淀已经被去除。（B） 通过增加Rap1GTPγS浓度刺激Krit1与凝集素囊泡结合的剂量反应。每个实验重复三次。

讨论

本文中，我们确认Krit1在体外与Rap1特异性相互作用，并优先与活性Rap1（GTP-结合形式）相互作用，这是Krit1成为Rap1“bona-fide”效应器的标准。我们首次证明了Krit1存在于一个封闭的构象中，其N末端与其C末端相互作用。与N端NPAY基序结合的ICAP-1破坏了这种相互作用，而与C端FERM结构域结合的Rap1则没有。此外，我们还发现Krit1、Rap1和ICAP-1在体外可以形成三元复合物。

Krit1在体外通过其N端和C端的两个位点与微管结合。值得注意的是，Rap1和ICAP-1在体外抑制Krit1与微管的结合。在转染的BHK细胞中，YFP-Krit1沿着CFP标记的微管定位，并通过活化的Rap1V12的共同表达从微管中分离出来。最后，我们证明Krit1与膜上的磷脂结合，并且Rap1增强了这种结合。

Krit1是Rap1的效应器

我们详细的生物化学研究表明，Krit与Rap1特异性相互作用，结束了关于这个问题的争论。事实上，正如下拉和无凝集素小泡沉降实验所示，N-截断的Krit1（我们称之为HypoKrit1）（对应于最初确定的酵母双杂交Rap1伙伴）和全长蛋白与Rap1相互作用。此外，HypoKrit1与Rap1GTPγS的亲和力高于与Rap1 GDP的亲和力，表明Krit1是Rap1的下游效应器。FLAG标记的全长Krit1也获得了类似的结果（数据未显示）。我们的结果与Zhang等人的结果有很大不同，Zhang等人未能观察到这两种蛋白质之间的相互作用[11]. 这种差异可能与所采用的方法有关。这些作者使用了Rap1和Krit1的体外翻译。产生的蛋白质数量可能不足以用于共同免疫沉淀，因为我们需要在手上观察这两种蛋白质的微摩尔浓度才能观察到复合物。一直以来，Krit1和Rap1B（Rap1A的一个非常接近的同源物）之间存在低亲和力的相互作用（Kd=4.7μM）[29]. 我们没有检测到之前报道的H-Ras与Krit1的任何相互作用[10], [30], [29]. 因此，Krit1似乎是Rap1的一个特异性效应器，表明它参与Ras-independent，Rap1依赖性途径。尽管有人提出Rap1可能与Krit1 F1子域结合，因为该子域与Ras结合域（RBD）的计算机化模型具有同源性[31]HypoKrit1ΔC和Rap1之间没有相互作用，这表明Rap1与PTB-like F3亚结构域相互作用。类似地，如共晶结构所示，talin和radixin FERM结构域通过其F3亚结构域分别与整合素和ICAM-2细胞质尾部相互作用[32],[33]. 有必要进行进一步的突变研究，以精确定位Krit1 FERM域上Rap1相互作用的位点。

与其他FERM蛋白一样，Krit1采用封闭和开放构象，并与PIP2结合

我们生成的Krit1最后300个氨基酸残基的分子模型证实了蛋白质C末端存在FERM结构域。FERM结构域参与将蛋白质定位到质膜。沉淀实验和晶体学研究表明，它们与PIP结合2（例如radixin[30]、塔林[34])通过脂质极性头部与F1和F3亚结构域之间存在的基本裂缝的相互作用。我们一致表明Krit1与PIP结合2有趣的是，在我们生成的Krit1 FERM模型中，几个基本残基暴露在F1–F3分裂中。对这些残基的突变分析将有助于确定PIP极性头部的结合位点2在Krit1上与radixin相似。

FERM家族的许多成员在其N端FERM结构域上进行C端分子内和/或分子间折叠[21]. 我们一致地证明了Krit1的N末端与其C末端的相互作用，这两部分是分开产生的。这两个结构域之间的顺式或反式相互作用同样可能导致闭合构象中的分子内折叠或反平行同二聚体样talin中的分子间折叠。此外，我们还证明了N端NPAY基序参与了相互作用，这表明FERM的类PTB F3亚域是C端对应物。因此，在moesin的休眠形式中，F3亚结构域被N末端延伸肌动蛋白结合尾结构域所掩盖[27]. 此外，我们还发现ICAP-1结合破坏了Krit1 N端和C端的相互作用。Krit1融合到YFP和CFP末端的荧光共振能量转移（FRET）可以在全长蛋白上验证这种相互作用以及ICAP-1对其的破坏。这可能是调节Krit1活性的关键机制。事实上，NPAY基序和PTB-like F3亚结构域都是其他伴侣的结合位点，例如ICAP-1、磷脂和未知伴侣，很可能是跨膜或膜周蛋白。掩蔽这两个位点可能会阻止Krit1与其他蛋白质相互作用，直到它被传递到靶点。研究表明，在激活p38 MAPK激酶的Rac/MEKK3/MKK3信号复合物的背景下，Krit1与CCM2基因产物malcalverin（PTB域蛋白）相互作用[35]. Krit1-CCM2相互作用不涉及NPAY基序，Krit1、CCM2和ICAP-1之间可以形成三元复合物。Krit1可能通过其与质膜上不同伙伴的相互作用，参与血管生成中几个相互联系的信号通路[35].

Rap1和ICAP-1调节Krit1在微管和膜上的定位

在FERM家族成员中，ERM蛋白和talin在膜蛋白和皮质肌动蛋白细胞骨架之间提供了一种调节性连接。Krit1上没有肌动蛋白结合位点的报道。始终，纯化的Krit1不会与体外聚合肌动蛋白相互作用（Eric Macia，个人通讯），YFP-Krit1也不会在细胞中定位到标记有卵磷脂的F-actin（数据未显示）。相反，我们证实了先前的报告，即Krit1是一种微管相关蛋白[22]通过表明它与细胞中的微管共定位，并与体外聚合的微管直接相互作用。此外，我们的结果表明，Krit1通过两个位点与MT结合：一个位于蛋白质N末端的碱基位点，位于对MT具有高亲和力的残基46至51上，另一个位于对MT亲和力低的F3亚结构域的C末端。N末端基本基序也被描述为功能性核定位序列[39]这表明它可能参与了Krit1在微管和细胞核之间的穿梭。值得注意的是，这两个位点对MT结合的贡献是相加的(图6A). 由于我们表明Krit1的N末端与C末端相互作用，因此这两个MT结合位点很可能在封闭蛋白质上形成一个连续的表面。我们发现ICAP-1和Rap1均抑制Krit1与MT的结合。关于这种抑制机制，可以提出两个假设。第一个是它们直接掩盖了与MT结合的表面。事实上，我们的结果表明，MT和Rap1都与Krit1的最后50个残基结合。对于介于残基46到51之间的基本拉伸，尚不清楚。ICAP-1进一步结合191NPAY（净现值）194动机。然而，在折叠的蛋白质中，这两个位点实际上是接近的，这是有可能的。第二个假设是，ICAP-1结合引起基本位点的结构变化，导致其对MT的亲和力下降。然而，ICAP1是一种比Rap1更有效的抑制剂，这一事实与在这些实验中使用的微摩尔浓度下其与Krit1的更强结合密切相关，对于第二部分，与C末端位点相比，基本拉伸对MT结合的贡献更大。

在细胞外周，Rap1在再循环的内体和质膜之间穿梭，其GTP形式定位于质膜[36]. 有趣的是，我们发现Rap1GTPγS刺激HypoKrit1与人造膜的结合。由于我们使用的未经修饰的Rap1不与膜结合，因此不会通过Rap1将HypoKrit1招募到膜上。相反，Rap1与Krit1 FERM结构域的结合很可能导致PIP2结合囊的构象改变，从而使HypoKrit1与PIP2具有更好的亲和力。我们试图观察Rap1刺激全长Krit1与asolectin囊泡的结合，即使在ICAP-1存在的情况下也没有成功，ICAP-1的结合应该会揭开Krit1 FERM结构域的面纱（数据未显示）。一些实验性的警告可能是导致这种负面结果的原因。在缺乏其C末端脂质锚定的情况下，Rap1朝向Krit1和膜的定位可能无法优化，因此复合物不能完全稳定。此外，ICAP-1可能不足以稳定Krit1的开放构象。蛋白质可能需要与另一个伴侣相互作用才能稳定打开。

Krit1在微管上的定位及其被激活的Rap1去定位与另一种Rap1效应器RAPL的报道结果非常相似。事实上，RAPL也定位于内皮细胞中的MT，并直接与体外聚合的MT结合[37]. 在伤口愈合分析中，RAPL定位于朝向前缘的MT上，这是Rap1高度激活的区域，其与Rap1的相互作用是定向迁移所必需的[37]. 此外，Rap1V12的共同表达也诱导RAPL与MT的分离[37]. 在淋巴细胞中，RAPL在趋化因子刺激下从核周区动态移动到前缘，活化的Rap1触发RAPL与αLβ2的结合，导致整合素重新分布到免疫突触[4]. 除了整合素激活外，Rap1还诱导细胞极化并促进细胞迁移。激活的Rap1的表达使淋巴细胞极化，在前部产生前缘，在后部产生尾足动物。它还刺激淋巴细胞内皮细胞迁移[38]内皮细胞的定向迁移[37]. 因此，通过MT网络将Rap1效应器传递到病灶粘连可能参与整合素的极化激活。总之，有报道称，在靠近细胞膜上粘附病灶的地方靶向MT[39]，以及MT对局灶性粘连翻转的调节[23], [24]. 基于我们的结果，我们提出了一个调节Krit1与MT和质膜结合的模型；在细胞中，Krit1将以闭合的构象沿着MT向质膜运输。当到达膜时，Krit1会从MT中分离出来，并被活化的Rap1和ICAP-1在质膜上捕获(图9). 然而，在没有ICAP-1的情况下，Rap1GTP将与Krit1结合，从而有利于其从MT中分离并与质膜结合，而无需将其打开。这种复合物可以作为一种储备物，将Krit1快速传递到质膜上的靶点。

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Krit1与微管和质膜结合的调控模型

在细胞中，Krit1将以闭合的构象沿着微管向质膜运输。当到达膜时，Krit1会从MT中分离出来，并被活化的Rap1和ICAP-1在质膜上捕获。

Han等人最近在揭示整合素激活中依赖Rap1的途径方面取得了重大突破[13]. 他们的工作表明，Rap1促进talin与β3和β1整合素的细胞质尾部结合。他们表明，Rap1诱导形成整合素激活复合物，其中包含talin和RIAM，即Rap1效应器。已知RIAM与profilin和Ena/VASP结合[5]表明它可以在局灶粘附水平上参与肌动蛋白网络的形成[13].

关于β1整合素本身的激活，即其转换为高亲和力构象，我们目前的数据和Han的数据使我们假设，这种依赖Rap1的激活复合物可能含有Krit1。它与ICAP-1的结合将取代ICAP-1在β1整合素上的抑制位点，从而允许talin结合和随后的β1构象变化。进一步的工作正在进行中，以确定Krit1是否被微管网络靶向局灶性粘连，以及Rap1、RIAM和ICAP-1是否调节这种定位。此外，功能研究将研究Krit1对细胞粘附的作用，以确定Krit1是否参与依赖Rap1的整合素激活途径。

材料和方法

质粒结构

pcDNA4/V5-HISA-FLAG-Krit1和pcDNA4/V5-HISA-FLAG-ICAP-1由D.A.Marchuk（北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心）提供。Krit1在pET21d（Novagen，Fontenay-sous-Bois，法国）和pEYFP-N1（Clontech，Saint-Germain-en-Laye，法国）中被亚克隆，HypoKrit1（208至736）在pGEX-2T（Roche Diagnostics，Meylan，法国）中被亚克隆。Krit1-Nter（1–207）在pQE 30（Qiagen）和pETGEX-CT（日本国家遗传学研究所）中被亚克隆。Asn192Ala-Tyr195Ala取代，丙氨酸取代47KRKK公司50并使用QuikChange突变试剂盒（荷兰阿姆斯特丹斯特拉赫纳）引入aa 686的终止密码子。pMT2-HA-Rap1A和pMT2-HA-Rap1AV12由J.L.Bos（荷兰乌得勒支大学医学中心）提供。C-末端缺失（1–167）Rap1A被亚克隆到pET16b（Novagen）中。ICAP-1在pGEX-2T中被亚克隆。

重组蛋白的纯化

Krit1和Krit1 KRKKK/AAAA在大肠杆菌。大肠杆菌用0.2 mM异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷以0.8的光密度（OD600）诱导BL21（DE3）密码子+细胞（Stratagene），并在18°C下额外生长16 h。His-tagged Rap1、His-tag Krit1-Nter WT和APAA、GST-HypoKrit1、GST-HypoKrit1ΔC、Krit1-N ter-GST和GST-ICAP-1在大肠杆菌。大肠杆菌用0.2 mM IPTG在28°C下在外径0.8下诱导B121金（Stratagene）3小时。根据制造商的说明，使用镍树脂Ni-NTA（法国科塔博夫，Qiagen）纯化His-Tagged蛋白质或谷胱甘肽sepharose 4B（法国奥尔赛，GE Healthcare Europe GmbH）纯化GST融合。对纯化的His-tagged Krit1 WT和KRKK/AAAA进行透析，并在50 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.0）、120 mM NaCl、10%甘油、DTT 1 mM中进行浓缩。对所有其他蛋白质进行透析，然后将其浓缩在20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、120 m m NaCl和1 mM MgCl中2和10%甘油，并为His-tagged Rap1补充20μM GDP。根据制造商说明（GE Healthcare），用凝血酶切割纯化的GST-ICAP-1的一部分。使用Fuji LAS3000荧光成像系统，通过SDS-PAGE和Sypro Orange（Amresco、Interchim、Montlucon，France）染色凝胶的荧光分析测定蛋白质浓度。

利用GDP或GTPγS预加载Rap1

纯化的Rap1在30°C的50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、120 mM NaCl、1 mM MgCl中培养45分钟2、2 mM EDTA、10%甘油和2 mM GTPγS或GDP（罗氏诊断公司）。通过添加5 mM MgCl将加载的核苷酸稳定在核苷酸位置2.

GST下拉

在4°C的PD缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，120 mM NaCl，1 mM MgCl2，10%甘油，1%NP-40，2 mM DTT，蛋白酶抑制剂），最终体积为50μl。在1 ml PD缓冲液中清洗珠子三次，并用30μl Laemmli样品缓冲液洗脱。输入和结合蛋白通过凝胶的Sypro Orange（Amresco）染色或western blotting进行分析。

细胞培养和转染

在含有5%胎牛血清、10%胰蛋白酶磷酸盐肉汤、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的BHK-21培养基（荷兰韭菜Invitrogen BV）中培养幼仓鼠肾脏（BHK）细胞。根据制造商的说明，用Fugene6转染试剂（Roche Diagnostics）转染细胞。

FLAG下拉

用pcDNA4/V5-HISA-FLAG-Rit1转染BHK细胞。转染48小时后，用PBS冲洗细胞并在PD缓冲液中刮除。在4°C下培养15分钟后，将细胞在14000g下4°C离心30分钟。上清液与小鼠抗FLAG M2结合琼脂糖珠（Sigma Aldrich L'Isle d'Abeau Chesnes，法国）在4°C下培养2小时。将捕获在珠子上的FLAG-Krit1与3μM Rap1GTPγS、7μM ICAP-1或两者在4°C搅拌下孵育2小时。然后用PD缓冲液洗涤珠子三次，用200μg/ml的FLAG肽在PD缓冲液中洗脱结合蛋白。通过SDS-PAGE和Sypro Orange凝胶染色分析输入和洗脱蛋白。

微管沉积实验

管蛋白纯化和聚合物制备

纯化的羔羊脑微管蛋白在37°C的BRB50缓冲液中聚合15分钟（50 mM PIPES pH 6.8，ImM EGTA，1 mM MgCl2)含1 mM GTP、5 mM MgCl2和10%甘油[40]. 然后，在37°C下每10分钟添加8、80和800μM紫杉醇。将混合物分层于含有1 mM GTP和80μM紫杉醇的BRB50缓冲液中28μl 50%甘油上，并在25°C下在16000 g下离心10 min。将颗粒重新悬浮在同一缓冲液中。

沉淀实验

将大约150 pmoles微管蛋白对应的聚合微管与指示的蛋白质在25°C、20μl、pH值为7.5的BRB50缓冲液中孵育30分钟。将反应混合物分层到20μl 30%甘油的BRB50缓冲液中，缓冲液pH为7.5，在16000 g下在25°C下离心10分钟。将颗粒重新悬浮在40μl 15%甘油中的BRB50缓冲液（pH 7.5）中。通过SDS-PAGE和Sypro Orange染色凝胶的荧光分析（使用荧光成像或western blotting）确定与微管共沉积的蛋白质的百分比。

免疫荧光和细胞显微镜

用pEYFP-Krit1和pECFP-tubulin与pMT2-HA-Rap1VI2共转染BHK细胞。转染后24小时，将细胞固定在4%PFA中20分钟，并进行免疫荧光分析，如前所述[41]. 用3F10抗HA单克隆抗体（Roche Diagnostics）标记HA-Rap1V12。使用Leica TCS-SP5显微镜（Leica Microsystemes SAS，法国Rueil-Malmaison）进行共聚焦显微镜分析。

无凝集素囊泡和脂质体沉积实验

无凝集素囊泡和脂质体的制备

用反相法制备了无凝集素（Sigma-Aldrich）囊泡[42]采用挤压法制备了蔗糖脂质体（质膜混合物：40%PC、15%PE、20%胆固醇、25%PS、0.2%NBD-PE；2 mM脂质体）[43]. 除鸡蛋PC（Sigma Aldrich）和NBD-PE（Molecular Probes Europe，Leiden，Netherlands）外，氯仿中的脂质均从Avanti Polar Lipids购买

沉淀实验

蛋白质在25°C下与载糖脂质体或无凝集素囊泡在20 mM Tris-HCl pH 8.0、120 mM NaCl、ImM MgCl中孵育20 min2，10%甘油，1 mM DTT，并在20°C、400000 g下离心20分钟。通过使用荧光成像对Sypro-Orange染色凝胶进行荧光分析，确定上清液和颗粒中的蛋白质百分比。

Krit1 FERM域的建模

Psi-Blast系列[44]使用网络工具获得Krit1最后300个残基与不同模板序列的比对。radidin（pdb条目；1GC6）的结构被用作Fl FERM域的模板，talin（pdb条目的：1Y19）的结构则用作F2和F3 FERM域。考虑到Krit1的预测二级结构以及talin和radixin的二级结构，人工改进了比对。通过与MODELLER 7程序的比较建模，分别构建了100个Fl、F2和F3域模型[45]. 为每个FERM域保留最佳模型，并使用SCWRL在优化构象中重新定位侧链[46]和SCit web服务器[47]. 这些模型最终实现了能量最小化。使用GROMACS 3.2.1版中实现的Gromos 96力场，通过分子动力学模拟来分析这些模型的稳定性[48]. 由于结晶FERM畴中F1-F2-F3的空间排列具有良好的保守性，因此根据基在FERM域中的排列手动定位三个模型化Krit1子域。用Pymol（Delano Scientific LLC，美国）对结构进行可视化

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YFP-Krit1在转染的BHK细胞中与CFP标记的微管共定位，并被激活的Rap1离域。用编码YFP-Krit1或YFP-ARNO的质粒转染BHK细胞，用抗HA3F10抗体检测CFP-tubulin（A）和pMT2HA-Rap1V12（B）HA-Rap1 V12。比例尺：15μm。

致谢

我们感谢弗雷德里克·布朗在共焦显微术方面的出色技术支持。我们感谢Daniel Bouvard、Julie Milanini、Michel Franco和Eric Macia的有益讨论和批判性阅读。我们感谢D.A.Marchuk为我们提供Krit1和ICAP-1 cDNA，感谢J.L.Bos为我们提供Rap1 cDNA。我们感谢Alfred Wittinghofer提供H-Ras。这项工作得到了癌症研究协会的支持。

使用的缩写如下

机器翻译
微管
克里特1
Krev相互作用陷阱基因
CCM1（中央控制模块1）
脑海绵状畸形1
ICAP-1
整合素细胞质结构域相关蛋白
客运专线
磷酸酪氨酸结合域
FERM公司
波段四点一/Ezrin/Radixin/Moesin

工具书类

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