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。2007年11月；274（21）：5518-32。
doi:10.1111/j.1742-4658.2007.06068.x。 Epub 2007年10月3日。

Krit 1与微管和微膜的相互作用由Rap1和整合素胞质域相关蛋白-1调节

苏菲·贝劳德·杜福尔 1, 罗曼·戈蒂埃, 科琳·阿尔比杰斯·里佐, 皮埃尔·查丁, 伊娃·福罗伯特
附属公司

Krit 1与微管和微膜的相互作用由Rap1和整合素胞质域相关蛋白-1调节

苏菲·贝劳德·杜福尔等。 FEBS J公司。 2007年11月。

摘要

小G蛋白Rap1调节多种细胞过程，如整合素激活、细胞粘附、细胞间连接形成和细胞极性。识别Rap1效应器对更好地理解控制这些过程的信号通路至关重要。Krev相互作用捕获1（Krit1）是一种具有FERM（带四点一/ezrin/radidin/moesin）结构域的蛋白质，在酵母双杂交筛选中被鉴定为Rap1伴侣，但这种相互作用在随后的研究中未得到证实。由于证据表明Krit1在Rap1依赖性途径中发挥作用，我们重新审视了这个问题。在本研究中，我们通过生化分析证明Krit1与Rap1A相互作用，优先是与GTP结合的形式。我们表明，与其他FERM蛋白一样，Krit1采用两种构象：一种是N端NPAY基序与C端相互作用的闭合构象，另一种是与整合素胞质域相关蛋白（ICAP）-1结合的开放构象，ICAP是黏着焦点组装的负调控因子。我们证明，在体外Krit1、Rap1和ICAP-1之间可以形成三元络合物，并且Rap1在闭合和开放构象中都能结合Krit1 FERM结构域。与ICAP-1不同，Rap1不打开Krit1。使用沉淀分析，我们表明Krit1在体外通过其N和C末端与微管结合，并且Rap1和ICAP-1抑制Krit1与微管的结合。一贯地，YFP-Krit1定位于幼仓鼠肾细胞中以青色荧光蛋白标记的微管上，并在与激活的Rap1V12共表达时从微管中游离出来。最后，我们发现Krit1与含有磷脂酰肌醇4,5-P（2）的脂质体结合，Rap1增强了这种结合。基于这些结果，我们提出了一个模型，其中Krit1将通过微管递送到质膜，在那里它将被Rap1和ICAP-1捕获。

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数字

图1
图1。Krit1包含假定的FERM域并绑定到PIP2
（A） Radixin-IP3共晶结构。IP3为黄色，F1（K53、K60、K63、K64）和F3（R273、R275、R279）结构域的基本残基为红色。色氨酸W58为绿色。（B） Krit1的F1、F2和F3结构域的同源模型。三个独立建模的子域被手动排列为radidin结构。F1（K475、K479、R485）和F3（K713、K720、K724）结构域的基本残基为红色。色氨酸W487为绿色。（C） Krit1（1μM）与含有或不含2%PIP的质膜混合脂质体（0.75 mM）孵育2在不同NaCl浓度下。离心后，用SDS-PAGE分析上清液（S）和颗粒（P）中的蛋白质，并用荧光法定量。去除了不含脂质体的蛋白质沉淀。Krit1带以下的带是大肠杆菌污染物，也与PIP结合2。
图2
图2。Krit1 N和C末端部分通过NPAY基序结合在一起，ICAP-1破坏了这种联系
（A） 所用Krit1碎片的示意图。FERM域：四点一，Ezrin，Radixin，Moesin；类PTB：磷酸酪氨酸结合域。ANK：安基林重复。（B） 100 nM Krit1-NTer WT或100 nM GST-HypoKrit1或GST突变株的GST下拉，遵循材料和方法中详述的实验程序。（C） ●●●●。在5μM ICAP-1存在下，3.5μM GST-HypoKrit1上5μM Krit1-NTer的GST下拉。在（A）中，GST融合用GST抗体进行免疫印迹。在（B）和（C）中，GST融合物用Ponceau红染色，Krit1-NTer和ICAP-1分别用His-tag和ICAP1抗体进行免疫印迹。输入相当于总蛋白质的1/20。这些结果代表了三个独立的实验。
图3
图3。Rap1以Rap1GTP形式优先与Krit1 C末端结合
（A） GST-仅在10μM GST-HypoKrit1或GST上下拉1μM Rap1GDP、Rap1GTPγS或H-RasGTPγS。输入相当于总蛋白质的1/25。GST融合用GST抗体进行免疫印迹。分别用His-tag、ICAP-1和H-Ras抗体对Rap1、ICAP-1,H-Ras进行免疫印迹。（B） 10μM GST-HypoKrit1或10μM GST-HypoSKrit1ΔC上1μM RapGTPγS的GST下拉。输入对应于总Rap1的1/4。Rap1用His-tag抗体进行免疫印迹。这些数据代表了四个独立的实验。
图4
图4。Krit1、Rap1-GTPγS和ICAP-1在体外形成三元复合物
5μM GST-ICAP-1融合或仅GST上5μM Krit1或/和5μM Rap1GTPγS的GST下拉。凝胶的Sypro Orange染色显示Krit1与GST-ICAP-1的结合。使用His-tag抗体通过western blot观察Rap1结合。这些结果重复了三次。
图5
图5。Krit-Nter或ICAP-1未修改与HypoKrit1结合的Rap1
（A） GST比较-在没有或存在10μM Krit1-Nter和10μM ICAP-1的情况下，10μM Rap1GTPγS与3μM GST-HypoKrit1的结合降低。用抗-His抗体免疫印迹法检测Rap1和Krit1-Nter。抗ICAP-1抗体显示ICAP-1。（B） FLAG-将3μM Rap1GTPγS或7μM GST-ICAP-1下拉至FLAG-Krit1珠。对照组对应于与未转染BHK细胞孵育并加工为FLAG-Krit珠的珠。输入相当于总蛋白质的1/40。蛋白质用Sypro Orange染色。这些结果代表了三个独立的实验。（C） Krit1在与Rap1的二元络合物或与Rapl和ICAP-1的三元络合物中的构象模型。Rap1与Krit1闭合和开放构象的C末端结合。ICAP-1结合开启Krit1而不干扰Rap1结合。为了表示的清晰性，只表示了分子内折叠。然而，不排除Krit1两个分子之间的头尾分子间折叠。
图6
图6。Krit1通过其N端和C端的两个位点与体外微管直接相互作用，Rap1和ICAP-1抑制这种相互作用
在每个实验中，在不存在或存在紫杉醇稳定的MT的情况下培养40 pmoles的Krit1，该MT由150 pmoles纯化微管蛋白体外聚合而成，并在蔗糖梯度上离心。用SDS-PAGE分析上清液（S）和颗粒（P），用荧光法定量Krit1与MT结合的百分比。在无MT的情况下，Krit1沉淀已被减除。（A） 使用不同的Krit1突变体鉴定Krit1上的MT结合位点。箭头表示Krit1 WT或突变体，T:Tubulin。每个实验重复两到四次。（B） Rap1和ICAP-1对Krit1与MT结合的抑制作用。将200摩尔的Rap1或ICAP-1添加到40摩尔的Krit1和聚合的MT中。每个实验重复三次。
图7
图7
YFP-Krit1在转染的BHK细胞中与CFP标记的微管共定位，并被激活的Rap1离域。用编码YFP-Krit1或YFP-ARNO的质粒转染BHK细胞，用抗HA3F10抗体检测CFP-tubulin（A）和pMT2HA-Rap1V12（B）HA-Rap1 V12。比例尺：15μm。
图8
图8。Rap1刺激Krit1与膜的结合
（A） GST-HypoKrit1（0.5μM）与无或有Rap1GTPγS（3μM）的无凝集素囊泡（1 mg/ml）孵育。离心后，用SDS-PAGE分析上清液（S）和颗粒（P），并用荧光法定量。去除了不含脂质体的蛋白质沉淀。（B） 通过增加Rap1GTPγS浓度刺激Krit1与凝集素囊泡结合的剂量反应。每个实验重复三次。
图9
图9。Krit1与微管和质膜结合的调控模型
在细胞中，Krit1将以闭合的构象沿着微管向质膜运输。当到达膜时，Krit1会从MT中分离出来，并被活化的Rap1和ICAP-1在质膜上捕获。
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