总结
整合素受体家族通过补充辅助分子在细胞间和细胞外基质（ECM）相互作用中发挥重要作用。其中之一是整合素胞质结构域相关蛋白-1（ICAP-1），它与β1整合素亚单位，并在体外负调控其功能。为了解决ICAP-1在体内的作用，我们消融了Icap-1小鼠的基因。在此，我们报道了ICAP-1在骨发育过程中对成骨细胞功能的意外作用。Icap-1-缺陷小鼠的成骨细胞增殖减少，骨矿化延迟，导致骨缝形成迟缓。体外研究表明，初生和永生Icap-1-无效成骨细胞在细胞外基质基质上的粘附和扩散增强，可能是由于β增加所致1整合素激活。最后，我们提供证据表明，ICAP-1通过调节整合素的高亲和力状态支持骨祖细胞的凝集，从而促进骨祖细胞分化。
关键词：动物、抗原、CD29、代谢、骨骼发育、钙化、生理学、细胞粘附、细胞分化、细胞增殖、细胞、培养的、颅面畸形、遗传学、侏儒症、遗传学、细胞内信号肽和蛋白质、遗传学、代谢、小鼠、敲除、成骨细胞、细胞学、生理学，成骨，蛋白质亚单位，遗传学，代谢，颅骨，胚胎学，生长发育，生理学，干细胞，细胞学，生理学
关键词：ICAP-1、整合素、细胞分化、细胞粘附、成骨细胞
结果
的生成Icap-1-缺陷小鼠
三个包含鼠标的PAC克隆Icap-1基因（也称为波德宁或Itgb1bp1号机组)进行了分离和表征。这个Icap-1基因跨度超过20kb，包含7个外显子(). 转录起始密码子和终止密码子分别位于外显子2和7。在人类中，已鉴定出两种ICAP-1亚型：ICAP-1α对应于全长蛋白（200-氨基酸），ICAP-1β代表较短的150-氨基酸长蛋白。短亚型来自外显子6的选择性剪接，该外显子包含β1整合素结合位点(Chang等人，1997年). 在小鼠中，我们无法使用RT-PCR扩增从不同成人组织分离的RNA来检测短亚型（数据未显示）。此外，EST和UCSC基因组注释数据库的搜索也没有提供老鼠的证据Icap-1β通过计算机爆炸搜索，编码ICAP-1的基因分别定位在小鼠12号染色体和人类2号染色体上。
老鼠的干扰Icap-1基因（A） 小鼠Icap-1基因和同源重组后的目标等位基因的部分结构。黑框代表外显子（E2到E7）。起始密码子（ATG）位于外显子2。在用BamH1消化和用指示的外部探针（ext-pb）杂交后，野生型和重组等位基因的预期片段大小分别为20和10kb。
（B） 猪尾DNA的Southern blot分析Icap-1+/+，Icap-1+/−和Icap-1−/−老鼠。
（C） 成年大鼠肾脏总RNA的Northern blot分析Icap-1+/+，Icap-1型+/−和Icap-1型−/−老鼠。过滤器与特定于Icap-1和Gapdh公司分别是。
（D） Icap-1的Western blot分析+/+，Icap-1+/−和Icap-1−/−大脑提取物。
（E-F）全山紫胶Z染色Icap-1+/−E8.5（E）和E14.5（F）的胚胎。
为了研究ICAP-1的体内功能，我们生成了一个Icap-1同源重组的无效等位基因。目标战略利用了lacZ公司插入带有内源性ATG和缺失外显子2和3的框架中的基因阻止功能性ICAP-1蛋白的表达(). 使用三个靶向正确的胚胎干细胞克隆来产生种系嵌合雄性。通过Southern、Northern和Western blot分析证实了无效突变(). 也不是Icap-1在纯合子突变的组织中检测到mRNA和ICAP-1蛋白(Icap-1−/−)老鼠。
为了确定杂合动物ICAP-1的表达模式(Icap-1+/−)在不同的胚胎和成年阶段收集，并进行LacZ组织化学(). 胚胎第8.5天（E8.5），全山染色显示发育中的心脏和面部间质中有微弱的LacZ活性(). 在后期，除肝脏外，LacZ活性在整个胚胎中逐渐可见(). 在组织切片上，在肝脏、脾脏、胸腺和肠上皮细胞中仅观察到中等LacZ活性，而其他组织表达高LacZ水平（数据未显示）。这些结果与之前公布的表达数据一致（Faisst和Gruss，1998）。突变杂合子小鼠表现正常。杂合杂交新生小鼠的Southern blot基因分型结果显示，纯合子突变体数量正常，表明ICAP-1在出生前没有限速功能。然而，当4周龄幼崽的孟德尔比率Icap-1+/−×Icap-1+/−和Icap-1+/−×Icap-1−/−对杂交种进行了评估Icap-1型−/−老鼠不见了(). 围产期死亡的原因尚不清楚。
表一
| 基因型 | 野生型 | 杂合的 | Icap-1无效的 |
|---|
| 十字路口 |
|---|
| (+/−) × (+/−) | | | |
| 预期（%） | 25 | 50 | 25 |
| P0（%）（n=128） | 27 | 49 | 24 |
| P28（%）（n=213） | 27 | 53 | 20 |
| (+/−) × (−/−) | | | |
| 预期（%） | - | 50 | 50 |
| P28（%）（n=34） | - | 60 | 40 |
生长迟缓和骨骼缺陷Icap-1−/−老鼠
纯合子突变小鼠出生时比野生型同窝小鼠稍小()这种大小差异在出生后逐渐增加。出生后十四天（P14），Icap-1−/−小鼠比对照小鼠矮5%-10%，体重减轻20%-50%。这些差异一直存在(和数据未显示）。大约三周大的时候，Icap-1−/−小鼠出现了明显的颅面部异常，其特征是颅骨呈圆顶状，鼻子变短变宽，眼睛肿胀(). 对5.5个月大的突变小鼠的X射线分析显示了几个额外的异常(). 颅骨穹隆变短变圆，脊椎棘突骨化不良(和插入）。在阑尾骨骼中，长骨的骨密度明显正常，但比对照组小鼠短约12%–23%。这些形态缺陷在远交系（混合C57Bl6/Sv129J）和自交系（CD1和C57Bl 6）中观察到，表明它们独立于遗传背景发生。
生长延迟、颅面畸形和骨矿化延迟Icap-1-缺陷小鼠（A） 的外观Icap-1+/+和Icap-1−/−P0窝交配。请注意Icap-1−/−小白鼠的体型比它们的对照窝小。的子集Icap-1−/−后代的胃是空的（箭头所示）。（B） 对照生长曲线(Icap-1+/+或Icap-1+/−)与Icap-1−/−（男性和女性）两个共同代表的同卵双胞胎的后代。在34天内每隔一天对小鼠称重。每个点代表30天野生型的平均±S.D.（C）侧视图（上面板）或俯视图（下面板），以及Icap-1-缺陷小鼠。注意Icap-1-与野生型相比，颅骨缺损。（D） X射线分析Icap-1+/+和Icap-1−/−550月龄小鼠。请注意，在Icap-1-null鼠标头骨形状受到严重影响，长骨较短，脊椎骨骨化不良（箭头和插入物用于放大）。（E） E16.5骨骼的茜素红/阿尔西安蓝染色。上颌（箭头）、前肢桡骨和尺骨（箭头）茜素红染色强度降低Icap-1型-无组织。（F） 新生儿期的茜素红/阿尔西安蓝骨骼染色。不同基因型之间的染色强度或图案没有明显差异。
延迟骨化Icap-1−/−胚胎
为了分析软骨和骨组织，纯合子突变和野生型动物的骨骼在不同发育阶段用阿尔西安蓝（染色软骨）和茜素红（染色钙化组织）染色。在整个发育过程中，突变胚胎和对照胚胎之间的阿尔辛蓝染色无法区分，这表明软骨形成在Icap-1型-缺陷小鼠(). 然而，在骨骼中茜素红染色减少Icap-1−/−早在E14.5时，小鼠就出现了骨化缺陷。阿尔扎林红染色减少在颅骨顶骨和额骨以及面部骨骼的上颌骨和下颌骨组件中最为明显（未显示）。E16.5时，颅骨和阑尾骨骼长骨周围的骨领中茜素红染色的减少更加明显().
在新生儿期，对照组和对照组长骨的茜素红染色相似Icap-1−/−动物()这表明项圈的骨化开始延迟，但在年的后期阶段会逐渐恢复Icap-1−/−老鼠。在颅骨区域，软骨颅（颅底的大部分）的出生后发育在Icap-1−/−老鼠。枕外骨、枕基骨、蝶骨基骨和蝶前骨的正常骨化显示了这一点()新生儿颅底软骨结合的正常形成和发展，P15、P21和P60对照Icap-1−/−动物(和数据未显示）。然而，新生儿颅骨骨化缺陷明显Icap-1−/−老鼠(). 额骨、顶骨和顶骨间（枕上）骨的尺寸减小，导致前、后囟门增大，矢状面和中（额间）缝合线加宽(). 在2个月大的时候，对照组小鼠已经完成了外斜面缝合线的骨化，但仍然有人字缝、矢状缝和冠状缝(). 在同一年龄段的突变小鼠中，外斜面缝合线的后部仍未分类（开放）(). 在一些Icap-1−/−观察到非骨化的阿尔西安蓝阳性区域从后外斜面缝合线延伸至额骨(). 此外，突变颅骨的顶骨发育不良，导致矢状和V形冠状缝缩短。骨缺损在骨骼的其他部位也很明显，例如15天大的突变小鼠的脊椎显示出非融合的椎弓根()在骨盆骨中，突变小鼠的耻骨和坐骨融合延迟().
颅骨骨化缺陷Icap-1突变小鼠（A–B）头骨的整体茜素红染色Icap-1+/+和Icap-1−/−新生小鼠。（A） 野生型和突变型动物的颅底矿化程度相当。（B） 颅骨穹隆的矿化。顶骨间（ip）、顶骨（p）和额骨（f）的矿化区域较小，在Icap-1−/−老鼠。棒材，2 mm。（C-H）野生型和全贴装茜素红/阿尔西安蓝染色Icap1号机组-空的2个月大的头颅。外斜面缝合区用C-E框住，用F-H高倍镜显示Icap1号机组-null（D，E）矢状缝合线较短，冠状缝合线呈V形且不规则，与野生型配偶相比（C）。在这个年龄段，野生型（F）的上睑缝合线（箭头）是闭合的，而Icap-1-缺陷小鼠-外斜面缝合线的后部没有骨化，并用阿尔西安蓝（G，H）染色。一些Icap-1−/−小鼠的额骨显示出非矿化的阿尔西安蓝阳性区域（H中的箭头）。钢筋分别为5 mm（C–E）和2 mm（F–H）。（I，J）21天龄野生型（wt）和Icap-1−/−（mt）小鼠。箭头指向在Icap-1-在对照动物中完成融合时，出现缺陷的小鼠。
颅骨中骨祖细胞增殖减少
由于颅骨穹隆在年受到严重影响Icap-1−/−我们决定将我们的分析重点放在颅骨的发育上。为了测试ICAP-1在发育中的颅骨中的表达位置，我们进行了LacZ染色(). 突变颅骨的整体染色显示，LacZ在颅骨前缘和缝合区强烈表达(). 头骨顶骨区的正面切片显示，正常小鼠的成对顶骨在中线被一条狭窄的矢状缝分开(). 然而，在突变小鼠中，两顶骨之间的距离较宽，没有典型的缝合组织(). 矢状缝合线是一条富含纤维的间充质条纹，两侧是浓缩的组织隆起物，这些隆起物被称为成骨前缘，含有可分化成成骨细胞并形成骨的骨祖细胞(). 在突变小鼠中，成骨前沿很薄，含有很少的细胞，导致顶骨生长受损，中间间质变宽(). LacZ染色显示较强Icap-1顶骨成熟成骨细胞、成骨前体成骨祖细胞和两前体间充质细胞中的启动子活性(). 正如预期的那样，来自野生型小鼠的可比组织切片显示没有LacZ公司表达式().
成骨前缘形成缺陷Icap-1−/−头盖骨（A） 新生儿颅骨的整体LacZ染色Icap-1+/+和Icap-1−/−动物。强大的LacZ活动，可视化Icap-1骨缝区和骨板边缘的表达Icap-1-颅骨缺损。棒状物为2mm。（B–C）苏木精-伊红染色的顶叶区额叶。围产骨骨化端（箭头）之间的距离在Icap-1−/−（C） 与野生型小鼠相比（B）。（D–E）通过野生型（D，F）矢状缝合线冻结的额叶断面Icap-1−/−（E，G）用苏木精和伊红染色的动物（D，E）或用于LacZ活性的动物（F，G）。请注意，野生型缝合线呈现出典型的浓缩细胞群，对应于成骨前沿（箭头），在Icap-1−/−老鼠。LacZ染色显示ICAP-1在该区域广泛表达。B、 骨；缝间间质；SO，枕上骨；P、 顶骨；F、 额骨；S、 矢状缝；五十、 人字缝；C、 冠状缝；如果，额间缝合。棒材为50μm。
颅骨的形态发生取决于骨祖细胞的数量及其在缝合线边缘向成骨细胞的分化。为了测试突变成骨前体中骨祖细胞数量减少是否是由异常细胞存活和/或增殖引起的，我们对新生小鼠进行了细胞凋亡分析、BrdU掺入分析和Ki67免疫染色。TUNEL分析和激活的caspase-3染色显示，正常和突变成骨前体的凋亡细胞数量非常少（数据未显示）。然而，Ki67和BrdU的标记指数在突变体中分别减少了40%和64%，表明在Icap-1-缺骨祖细胞群(). 成骨细胞祖细胞的增殖受到ECM相互作用和生长因子的严格调控。为了确定成骨前缘增殖减少是细胞自主缺陷还是由周围组织生长因子和/或ECM成分分泌受损引起的，我们从对照组和突变组小鼠的颅骨中分离出原代成骨细胞，通过逆转录病毒转导SV40大T抗原使其永生化，并测试其增殖率。与体内观察结果类似，Icap-1−/−电池（SV2.1-Icap-1−/−)与对照细胞相比，BrdU掺入率更低（SV6.5-Icap-1+/+)在体外(). 全长逆转录病毒感染Icap-1cDNA导入SV2.1-Icap-1−/−成骨细胞（SV2.1-Icap-1重新扫描)恢复正常增殖()证实ICAP-1缺失与增殖缺陷之间的联系。为了在分子水平上进一步表征增殖缺陷，我们对cyclin D1的表达进行了Western blot分析。接种后5小时，野生型或挽救的成骨细胞粘附在FN上导致cyclin D1表达增加。相反，Icap-1−/−在相同实验条件下培养的前成骨细胞显示cyclin D1表达显著降低(). 这些结果表明Icap-1−/−小鼠是细胞自主的。
颅骨成骨细胞增殖减少Icap-1无效小鼠（A） 新生儿矢状缝区增殖标记物Ki67的免疫检测Icap-1+/+和Icap-1−/−颅骨Icap-1−/−小鼠Ki67阳性细胞数量减少。方框表示（B）中用于KI-67和BrdU定量的区域。巴为25μm。（B） 对照和突变动物成骨前沿Ki67-和BrdU-阳性细胞的定量。误差条代表S.D.星号表示Icap-1+/+和Icap-1−/−（**，P<0.0001）。（C） 不朽颅骨成骨细胞。ICAP-1缺陷细胞（SV2.1-Icap-1−/−)与野生型细胞相比，BrdU标记指数显著降低（SV6.5-Icap-1+/+). 逆转录病毒转染Icap-1cDNA导入Icap-1−/−细胞拯救增殖缺陷（SV2.1-Icap-1重新扫描)（**，P<0.0001）。（D） SV2.1和SV2.1-Icap-1重新扫描细胞在1%FCS中培养24小时，然后将其移植到10μg/ml FN上。铺展5小时后，用PBS清洗细胞，并用RIPA缓冲液直接裂解到培养皿上。凝胶分离每条通道中30μg的蛋白质，然后转移到PVDF膜上，然后用抗细胞周期蛋白D1抗体进行蛋白质印迹。用抗肌动蛋白多克隆抗体对同一凝胶进行印迹，以使蛋白质负荷正常化。
Calvarial成骨受到干扰Icap-1-缺陷小鼠
骨祖细胞分化为成熟成骨细胞的特征是“骨特异性”细胞外基质分子的沉积，以及生长和转录因子的时空协同表达。研究颅骨骨骼分化Icap-1−/−小鼠，我们首先评估了新生颅骨额叶切片上成骨标志物的表达，如碱性磷酸酶（AP）、骨连接蛋白和I型胶原（Col1）(). 在野生型中，AP的活性仅限于发育中顶骨的类骨质区域和矢状缝成骨前部的前成骨细胞(). 骨结合蛋白表达与AP活性位点重叠()沿骨表面强，成骨前沿细胞弱。在突变组织中，具有AP活性的细胞数量在骨缝线边缘减少，从而限定了一个较小的成骨前部区域，该区域致力于成骨细胞分化(). 类骨表面的骨连蛋白沉积也减少，在成骨前部几乎不存在(). 同样，与野生型相比，突变型的骨表面和缝合边缘的I型胶原免疫染色显著减少().
成骨分化异常Icap-1−/−头盖骨通过顶骨和矢状缝的额断面Icap-1+/+和Icap-1−/−对新生小鼠进行（A）AP、（B，C）骨连接蛋白、（D，E）Col1（F）FGFR1和（G）FGFR3染色。（C，E）分别是（B）和（D）成骨前部区域的（400倍）放大视图。虚线表示骨边界和成骨前区。B、 骨；缝间间质。注意成骨和分化标记在Icap-1−/−组织。
对E17.5胚胎颅盖骨进行整体原位杂交以检测Cbfa1/运行x2（H） 或Bsp公司成绩单（I）Icap-1+/+和Icap-1−/−胚胎。顶部面板是对整个颅骨的概述，底部面板是对成骨前部的更近视图（在概述中装箱）。棒材为2 mm。
由于FGF受体的表达模式与成骨分化过程相关(Iseki等人，1999年；Rice等人，2000年)我们比较了野生型和突变型新生儿颅骨中FGFR1和FGFR3的表达。在对照组织中，在颅骨的成骨细胞、成骨前部的细胞和缝合间质中检测到这两种蛋白(). 在Icap-1−/−颅骨、FGFR1和FGFR3免疫标记较野生型弱，这种差异在成骨前区尤为明显(). 此外，在E17.5头上进行的全支架原位杂交显示，两种早期骨标志物的表达Cbfa1/运行x2和后面的标记骨唾液酸蛋白在突变小鼠中减少(). 再次，在骨区边缘观察到较弱的信号，反映成骨前沿内成骨细胞谱系中的细胞明显减少。总之，这些结果表明，在突变动物中通常不会形成成骨前缘。
为了测试定向细胞是否正常分化，从新生儿野生型和Icap-1−/−颅骨，在添加抗坏血酸和β-甘油磷酸的培养基中培养，诱导成骨细胞分化和矿化骨结节的形成(). 在分化培养基中培养两周后，几乎所有来源于对照颅骨的细胞中都有AP活性，表明它们属于成骨细胞系。Icap-1−/−颅骨细胞也开始表达AP，尽管水平较低（数据未显示）。培养四周后，将成骨细胞与Icap-1−/−茜素红显示颅骨含有较少且较小的矿化结节()和von Kossa染色（数据未显示）。同样，永垂不朽Icap-1−/−电池（SV2.1-Icap-1−/−)与野生型相比，AP染色和矿化结节形成显著减少（SV6.5-Icap-1+/+)和获救的电池（SV2.1-Icap-1重新扫描) (和数据未显示）。这些数据表明，ICAP-1的缺失损害了成骨作用，并确定了ICAP-1作为细胞自主因子在成骨细胞分化中的作用。
骨结节的形成Icap-1−/−颅骨成骨细胞有缺陷（A） 主要Icap-1+/+和Icap-1-缺失的成骨细胞在诱导培养基中培养4周，并用茜素红染色以监测骨结节的形成。Icap-1型−/−与野生型培养物相比，培养物显示出更少更小的矿化结节（箭头）(Icap-1+/+). 该结果代表了来自3种不同动物的至少3个独立实验。棒材，1 mm。（B）永生成骨细胞SV2.1Icap-1−/−，SV6.5Icap-1+/+或SV2.1-Icap-1重新扫描在诱导培养基中培养3周，通过茜素红染色鉴定矿化结节。Icap-1−/−与野生型或Icap-1重新扫描成骨细胞。通过3个独立实验计算平均值和S.D.（*，P<0.05，**，P<0.0001）
由于我们通常在颅骨或永生化骨祖细胞的细胞在体外汇合后诱导分化，因此突变株（SV2.1）的数量-Icap-1−/−)也不是野生型（SV6.5-Icap-1+/+)和获救的电池（SV2.1-Icap-1重新扫描)分化期显著增加（数据未显示）。总之，这些发现表明，除了细胞增殖缺陷外，还存在分化阻滞。
β1整合素在成骨前沿高度表达和激活
β1整合素在成骨细胞增殖和分化过程中起着关键作用(Moursi等人，1997年；Zimmerman等人，2000年). 由于ICAP-1与β1整合素链与整合素功能的体外调节(Bouvard等人，2003年)，我们分析了β1整合素在野生型和突变型颅骨体内的表达。在新生儿期，通过矢状缝和顶骨的额叶切片用抗β抗体进行免疫染色1多克隆抗体和单克隆抗体9EG7，可识别β1整合素(和数据未显示）。在对照小鼠的切片中，两种抗体都强烈标记了成骨前部和骨表面，而中间的间充质则微弱标记。相反，来自Icap-1-缺陷小鼠表现出明显的β1骨表面整合素染色，但成骨前角细胞染色非常微弱。这明显降低了β1染色主要是由于成骨前体细胞数量减少，而不是单个细胞表面表达减少，因为FACS分析显示β1整合素表达Icap-1−/−成骨细胞(，参见下文）。
β增加1整合素活性Icap-1−/−细胞（A） 用识别配体结合β1整合素。β1整合素在野生型细胞上高度表达并被强烈激活(Icap-1+/+)在成骨前部（箭头）和骨板表面（箭头）。在Icap-1−/−组织中，成骨前部的细胞显示出适度的活性β染色1整合素条为50μm。（B） FACS分析表明，β1整合素的表面表达（由MB1.2单克隆抗体测定）在Icap-1−/−原代成骨细胞（红色）与野生型成骨细胞相比（蓝色）。（C） 粘附性分析。粘附力Icap-1−/−FN和Col1的原代成骨细胞与Icap-1+/+细胞。粘附力以最大粘附力的百分比表示，并在两个不同动物的两个独立实验中测量两次（p<0.05）。（D） FACS分析表明FITC-Fn 7-10片段与Icap-1−/−成骨细胞（绿色）。（E） β的活化指数（AI）1整合素在Icap-1−/−成骨细胞。获得的最大AI用于标准化两个基因型组，并称为100。
ICAP-1对照β1整合素活性与骨祖细胞的凝集
为了进一步分析ICAP-1表达缺失对成骨细胞黏附的影响，使用从颅骨组织分离的原代成骨细胞进行检测。尽管β略有下降1表达式()，附着力Icap-1−/−与野生型成骨细胞相比，FN或Col1的成骨细胞适度但显著增加(). 这表明，与ECM底物的粘附增加是由于β1整合素Icap-1−/−成骨细胞。
为了研究ICAP-1表达的缺失是否干扰整合素的激活，我们评估了FN受体α的配体结合亲和力5β1野生型和Icap-1−/−原代成骨细胞。表达、纯化和FITC-标记与III型重复序列7-10（FN 7-10）相对应的FN的细胞结合域。利用FACS分析突变型和野生型原代成骨细胞在非饱和浓度下与Fn 7–10相互作用的能力。如所示，我们一直观察到Fn 7–10与Icap-1−/−成骨细胞与野生型细胞的比较。活化指数，将FITC-Fn 7–10与总β的特异结合标准化1表面表达水平在Icap-1−/−细胞与野生型细胞的比较().
在原代和永生化成骨细胞的体外分化过程中，我们不断观察到Icap-1−/−与野生型细胞形成的细胞相比，细胞数量少、体积小、致密性差(). 因为骨细胞的分化需要细胞凝结的初始步骤(Globus等人，1998年；Ornitz和Marie，2002年)，这一步骤中的缺陷可能导致分化的改变或延迟。为了解决这个问题，我们使用悬滴技术在悬浮液中培养永生化骨祖细胞。在这些条件下，野生型或拯救细胞在48小时内聚集并形成致密的球体，而球体由Icap-1−/−细胞不太致密(和数据未显示）。由于ICAP-1缺失增加了整合素亲和力()，我们研究了β1处于激活状态的整合素将模拟ICAP-1缺陷。为此，我们用整合素激活单克隆抗体9EG7补充培养基，然后形成球形(). 当球体触发压实时Icap-1−/−细胞不受9EG7抗体治疗的影响，对照细胞或挽救细胞的压实持续延迟。这些发现表明，ICAP-1对整合素亲和力的调节是成骨细胞适当致密化所必需的。
骨结节形成缺陷和球状体压实Icap-1−/−成骨细胞（A） 永久SV6.5（野生型）或SV2.1(Icap-1−/−)体外诱导前成骨细胞分化15天，用相差显微镜观察骨结节的形成和组织。Insert是方框区域的放大倍数较高的视图；请注意，SV2.1单元的内聚性不如控制单元。（B） 球体由SV2.1形成，SV2.1被救出Icap-1cDNA或SV6.5前成骨细胞，并在37°C下孵育16小时后使用标准的悬滴试验方案进行分析。在每个实验条件下，我们每滴使用25000个细胞。对于抗体治疗，在浓缩过程中，在补充FN缺失血清的培养基中以最终浓度10μg/ml添加9EG7或对照抗体（ctl）。
讨论
在本论文中，我们报道了携带一种被破坏的Icap-1型基因。Icap-1-缺陷小鼠患有以轻度生长迟缓和严重颅面畸形为特征的成骨缺陷。我们重点分析颅骨异常，以明确成骨细胞分化的观点。
ICAP-1在成骨过程中起重要作用
骨形成（成骨）包括间充质组织直接转化为骨（膜内骨化）或通过软骨中间产物（软骨内化骨）(Zelzer和Olsen，2003年). 第一种机制负责颅骨拱顶扁平骨的产生以及长骨骨干周围骨领的形成。在Icap-1型−/−小鼠，膜内骨化受到影响，因为骨膜和颅骨的成骨都被延迟。阿尔西安蓝染色显示，突变小鼠软骨内骨软骨模板的形成基本未受干扰。由于ICAP-1也在软骨细胞中表达（数据未显示），我们不能完全排除突变软骨细胞的轻度分化和/或增殖缺陷，这也可能导致Icap-1−/−老鼠。我们将研究重点放在膜内骨化，并首次显示ICAP-1在成骨细胞分化中的重要作用。颅骨（额骨、顶骨和额骨间）的骨化在胚胎发育过程中显著延迟，导致出生时的囟门开放和缝合线变宽。这些症状反映了携带转录因子突变的小鼠颅骨异常Cbfa1/运行x2(Otto等人，1997年)和附件4(Yang等人，2004年)已被确定为成骨细胞分化的关键调节因子。它们之间显著的表型相似性Icap-1−/−小鼠和这些小鼠模型表明ICAP-1是一种新的、重要的成骨细胞发育调节因子。颅缝在出生后调节骨膨胀，并在大脑发育期间保持非骨化状态(Opperman，2000年). 缝合处的成骨作用包括在缝合边缘将间充质细胞分化为前成骨细胞和成骨细胞，随后沿骨板沉积胶原基质。颅骨生长增加导致缝合线过早闭合（颅缝骨裂），而骨生长延迟导致缝合线延迟。ICAP-1在成骨前沿表达，其缺乏导致成骨前沿成骨细胞数量急剧减少，进而阻碍颅缝的正确暂时融合。成骨前沿的成骨细胞数量减少是由于增殖减少和成骨细胞分化受损。
ICAP-1调节成骨细胞增殖
我们以前曾报道过ICAP-1具有双重定位，存在于细胞质/膜和细胞核中(Fournier等人，2005年). 永生化成骨细胞中ICAP-1表达的缺失显著降低了细胞增殖和细胞周期蛋白D1的表达。因此，成骨前沿的增殖减少可能是由于细胞核中缺乏ICAP-1导致cyclin D1表达减少。这可能解释了在骨缝区观察到的用于成骨细胞谱系的细胞数量严重减少的原因Icap-1缺乏动物。
ICAP-1调节成骨细胞分化
成骨细胞分化是一个多步骤的过程，首先需要间充质细胞的初始凝结形成成骨前沿(霍尔和三宅一生，2000年). 在中间间质内膨胀骨边缘的颅骨骨发育过程中，可见成骨前部的细胞群。这种浓缩细胞群进一步分化并表达不同的成骨细胞标记物，如Runx2/Cbfa1、AP、骨唾液蛋白（BSP）等。我们对整合素或细胞黏附如何参与这一过程的了解很少有文献报道，但最近的报道表明，基质硬度在控制早期成骨细胞分化中发挥了意想不到的作用(Engler等人，2006年；McBeath等人，2004年).
β的重要作用1整合素也被报道用于体外成骨细胞分化。结果表明，Col1与α2β1整合素调节成骨细胞特异性基因表达和成骨细胞分化(Takeuchi等人，1996年；肖等人，1998年). 类似地，α5β1整合素与FN相互作用促进分化(Moursi等人，1997年)和生存(Globus等人，1998年)培养的颅骨成骨细胞。最后，β-1骨细胞整合素阻断β1整合素功能，减少对胶原和FN的粘附，减少皮质骨和扁平骨的骨量(Zimmerman等人，2000年). 虽然这些研究确定了β1整合素在成骨中的作用它们没有涉及整合素亲和力调节在骨发育中的作用。我们的数据首次证明，不仅β1整合素亲和力增加，但亲和力降低对体内外骨骼发育至关重要。
我们一致观察到成骨细胞在Icap-1-缺乏动物。甚至在成骨前区的早期标记Runx2的表达也显著降低。此外，体外分化试验显示Icap-1型与野生型或挽救细胞形成的结节相比，无效永生骨祖细胞更小，致密性更低。这减少了Icap-1-用悬滴技术进一步证实了细胞缺陷，表明成骨细胞冷凝需要ICAP-1，这是成骨细胞分化的关键和早期步骤。
我们的数据表明，增殖和分化缺陷是独立发生的，它们都有助于异常成骨。为了支持这一观点，我们观察到ICAP-1在Icap-1-有缺陷的成骨前细胞系完全恢复了其增殖速度，但在体外仅部分恢复了分化和形成结节的潜能。此外，在我们的分化试验中，我们通常使用融合细胞来排除增殖缺陷影响矿化结节的形成。事实上，我们只观察到分化期细胞数量略有增加，而对照组和Icap-1-缺乏文化。我们的数据表明Icap-1-前成骨细胞缺陷进一步限制了最终分化为成熟成骨细胞的祖细胞数量(). 在连接蛋白43缺乏的小鼠中也观察到了前体细胞凝集对成骨细胞发育的功能重要性(Lecanda等人，2000年).
涉及β的以往工作1细胞致密化中的整合素(Robinson等人，2004年；Robinson等人，2003年). 我们的数据表明ICAP-1可能控制β1整合素在这个过程中通过调节激活/失活循环发挥作用。据我们所知，这是第一个直接证据表明整合素亲和力对细胞凝聚力和分化很重要。
材料和方法
抗体
先前描述过多克隆抗ICAP-1抗体(Bouvard and Block，1998年). 抗肌动蛋白、小病毒蛋白（h-Vin1）和蛋白（克隆8d4）的单克隆抗体来自Sigma-Aldrich（德国）。多克隆抗β1整合素血清是Johansson博士（瑞典乌普萨拉）赠送的。单克隆β1抗体9EG7和MB1.2分别来自法明根（法国）和博斯科博士（加拿大安大略省）的礼物。多克隆抗胶原蛋白I、III和骨连接蛋白/BM-40来自Dr.R.Timpl（德国马丁斯里德）。抗细胞周期蛋白D1、FGFR1和3的多克隆抗体来自SantaCruz（美国）、Novocastra（英国）和Roche（德国）的Ki67和5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）。
原代破骨细胞的分离和检测
如前所述，使用0.3 mg/ml I型胶原酶（Sigma）和0.25%胰蛋白酶（Gibco BRL）的混合物从新生颅骨中分离出原代小鼠成骨细胞富集细胞群(Bellows等人，1986年；Otto等人，1996年). 细胞在含有10%FCS的α-MEM培养基中生长。
分离成骨细胞的体外分化基本上如所述(Globus等人，1998年). 简单地说，每孔60.000个细胞被放置在24孔托盘中。在细胞融合培养3天后，将培养基切换至分化培养基（α-MEM、10%FBS、50μg/ml抗坏血酸、10 mMβ-甘油磷酸），并每隔一天更换一次。分化过程通过成骨细胞活性的AP染色和钙沉积的茜素红S染色来观察。
在粘附试验中，将原代成骨细胞（第2代）接种于0.5×105细胞置于96孔托盘中，托盘上涂有不同浓度的FN或Col1。将细胞在37°C下培养1小时，然后用PBS洗涤三次，然后在室温下用结晶紫溶液（0.1%结晶紫，20%甲醇）染色1小时。在水中清洗三次后，细胞在0.1%SDS中溶解1小时。使用Beckman Coulter的AD 340吸光度检测器在550 nm处读取吸光度。
如前所述，使用BrdU分析评估细胞增殖（Fournier等人，2003年）
成骨细胞的永生化
原代成骨细胞（第2代）感染了一种表达大SV40 T抗原的逆转录病毒(Fässler等人，1995年)，克隆并测试其在分化时诱导AP的能力(Mansukhani等人，2000年). 从克隆SV2.1Icap-1-本研究使用缺陷小鼠和来自野生型动物的克隆SV6.5。使用pCLMFG通过逆转录病毒感染挽救SV2.1细胞中ICAP-1的表达-Icap公司-IRES-EGFP载体。使用MoFlo细胞分选仪（Dako Cytomation）根据EGFP荧光对均质细胞群进行分选。以EGFP为标记物，通过Western blot、免疫荧光和FACS检测ICAP-1的表达。这种非克隆细胞群称为SV2.1-Icap-1重新扫描此后。
悬挂液滴中的压实试验
通过胰蛋白酶消化收获永生化细胞，并在DMEM培养基中洗涤两次。将含有25000个细胞的10μl DMEM-SVF培养基滴在倒置的10cm皮氏培养皿的盖上，并放置在含有8ml PBS的皮氏培养皿上。然后在72小时的培养时间内对球体进行压实，并使用配备数码相机的双目显微镜拍摄图像。
β活化指数1原代成骨细胞上的整合素
β活化指数1整合素的估计基本上如前所述(Calderwood等人，2004年). 简单地说，分离出原代成骨细胞，并将第2代细胞分为两个池，分别含有单独的Tyrode缓冲液或补充有5 mM EDTA的Tyrode缓冲液。在4°C下培养15分钟后，在有或无5mM EDTA的情况下，将细胞在有或没有FITC标记的Fn 7–10片段的情况下培养45分钟，在冰凉的Tyrode's中清洗，并在FACScan（Becton Dickinson）流式细胞仪上分析。使用CellQuest软件（Becton Dickinson）分析收集的数据。在平行细胞中分析β1用MB1.2单克隆抗体检测β1细胞表面的整合素。活化指数（AI）的计算如下：在MB1.2标记的情况下，通过减去Fn 7–10片段在EDTA存在或不存在一级抗体的情况下孵育获得的背景值来计算每个特定平均强度荧光（MFI）。AI=（（MFI Fn 7–10）-（MFI F n7–10+EDTA））/（MFI MB1.2）-（BFI MB1.2控制）。
RNA和蛋白质分析
根据制造商的建议，使用TRIzol试剂（GIBCO BRL）从成人肾脏中分离出总RNA。对于Northern分析，在1.2%琼脂糖-2.2 M甲醛凝胶上分离10μg总RNA，转移到Hybond+膜（Amersham），并用32P标签Icap-1型cDNA。
对于生物化学，成年小鼠的大脑在RIPA缓冲液（10%w/v）中均质化，并用于蛋白质印迹，如所述(Bouvard等人，1998年).
