Rap1上调和激活质膜调节T细胞粘附

内源性Rap1在PM上表达

为了比较GFP-Rap1和内源性Rap1的定位，我们使用间接免疫荧光分析了多种Rap1细胞系。我们发现，与GFP-Rap1在活细胞中成像获得的可重复结果不同，间接免疫荧光显示的内源性Rap1模式对固定和渗透方法敏感。在COS-1和MDCK细胞中，观察到的最具重复性的模式是一种广泛分布的细胞质泡，与内体一致，这与Pizon等人（1994年）未观察到PM染色。然而，转染GFP-Rap1的细胞在活体成像时显示出融合蛋白的明确PM定位，在固定、渗透和Rap1染色时显示出仅在细胞膜上染色（未公开数据）。这一结果表明，用现有的抗Rap1抗体进行间接免疫荧光染色，灵敏度不足以检测PM处的Rap1，或者固定和渗透导致PM处Rap1蛋白或其相关抗原表位的选择性丢失。因此，我们使用一种独立的方法亚细胞分离分析内源性Rap1的PM。使用不连续的蔗糖密度梯度和连续的Optiprep梯度，我们从MDCK细胞的匀浆中获得了高度富集于高尔基体、内体和PM膜中的组分。高尔基、内体以及PM组分分别高度富集半乳糖转移酶、EEA-1和Na/K ATP酶。免疫反应性Rap1存在于内胚体和PM组分中(图2). 重要的是，高尔基复合体和PM组分均未受到EEA1阳性膜的污染。高尔基组分中检测到的微量免疫反应性Rap1与这些组分中免疫反应性Na/K ATP酶的水平相似，支持高尔基组份中检测到少量Rap1可能是由于高尔基膜不可避免地受到PM-衍生小泡的污染。为了进一步确定内源性Rap1在PM上表达，我们使用了一种特性良好的方法来亲和纯化PM衍生囊泡。COS-1细胞在4°C下被生物素化，以仅允许表面膜的修饰；Dounce均质后，使用固定化链霉亲和素亲和纯化生物素化囊泡(Mammen等人，1997年). 在生物素化组分中发现了Rap1，该组分也含有Na/K ATP酶，但不含EEA-1(图2，生物素PM泳道）。因此，亚细胞分离的结果与通过在活细胞中定位GFP-Rap1获得的结果一致。从这些数据中，我们得出结论，PM和内体上过度表达的GFP-Rap1的定位反映了内源性GTPase的定位。

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图2。

内源性Rap1的定位。使用蔗糖进行MDCK细胞亚细胞分离，然后进行Optiprep梯度或生物素化细胞表面表达分析。EEA1、Na/K ATP酶和Rap1的免疫印迹分析是在总膜部分（TM）和对Optiprep获得的高尔基复合体（Golgi）、质膜（PM）或内体（Endo）高度富集的膜部分上进行的，或在生物素亲和纯化（biotin PM）获得的PM上进行的。结果代表了两个独立的实验。

有丝分裂原诱导PM上Rap1的快速、胞吐依赖性上调

Rap1在包括内体在内的细胞内小泡以及PM上的定位，增加了PM相关Rap1可能由胞吐调节的可能性。事实上，Rap1与中性粒细胞的胞内颗粒有关(玛丽多内亚·帕里尼和德冈茨堡，1992年)和血小板(长田和野泽，1995年)作为一个池，可在脱颗粒后迅速进入PM。因此，我们使用GFP-Rap1来确定PM表达是否被快速调节。在血清饥饿的COS-1细胞中，EGF刺激PM-相关GFP-Rap1的上调(图3A） ●●●●。这种反应的快速性（在5分钟内明显可见）与GFP-Rap1的新合成不一致，并提示从另一个隔室（在本例中为细胞内小泡）移位。为了证实EGF刺激的PM-associated GFP-Rap1上调是通过胞吐介导的，我们使用N个-乙基马来酰亚胺（NEM）是一种已知的阻止多种囊泡融合事件（包括与内吞再循环相关的事件）的试剂(加利等人，1994年). NEM阻断EGF刺激的Rap1在PM上上调的细胞预处理(图3A） ●●●●。

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图3。

生长因子刺激PM上依赖于胞吐的Rap1上调。（A） 将GFP-Rap1野生型转染COS-1细胞，不转染（顶部和中部）或转染显性阴性Rab11BP（底部）。转染后24小时，细胞被血清饥饿，在无NEM（顶部和底部）或有NEM（中部）的情况下用EGF刺激，并在刺激前和刺激后5分钟进行成像。箭头表示PM褶皱上GFP-Rap1上调的区域。在所有对照细胞中观察到颗粒物Rap1上调，并通过测量材料和方法中所述的相对荧光强度进行验证。相比之下，NEM处理和显性阴性Rab11BP（DN Rab11BP）转染细胞的PM分别只有16±9%和8±8%（平均值±SEM）表达上调(n个= 4; 与对照组相比，每种情况下P<0.0001）。（B） 表达GFP-H-Ras的COS-1细胞在血清饥饿和刺激后（如A中所示），高尔基体（箭头）或PM（箭头）的表达没有变化。所示图像是为补偿最小焦点漂移而采集的七个Z切片的代表。棒材，10μM。

在内涵体的各种亚类中，循环内涵体在NEM敏感过程中运输到细胞表面并与PM融合(加利等人，1994年). 内切体循环已被证明由Rab11控制，并由显性负Rab11结合蛋白（Rab11BP；Zeng等人，1999年). 我们用GFP-Rap1过表达显性阴性Rab11BP，并观察到在基线时PM处的GFP-Rap1显著降低，EGF的抑制刺激了PM处GFP-Rap1的上调，证实了通过内体再循环调节PM相关Rap1的表达(图3A） ●●●●。与GFP-Rap1相反，GFP-H-Ras在PM和高尔基体上的缺血清细胞中表达，并且分布不受EGF刺激的影响(图3B） ●●●●。因此，与造血细胞一样，Rap1在成纤维细胞的PM上表达，PM表达的程度可以通过Rab11BP-敏感小室的胞吐快速上调。

GFP-RBD招聘_RalGDS公司从细胞溶质到细胞膜报告GTP-结合的Rap1的定位

我们已经证明，带有GFP标记的Raf-1的RBD是一种荧光探针，可以报告Ras在活细胞中激活的位置和时间，而不会与GTP-结合的Rap1发生显著的相互作用(Chiu等人，2002年). 为了开发针对Rap1的类似探针，我们使用了RalGDS的RBD，Ras和Rap1是一种效应器，与Raf-1相比，Rap1对Rap1具有更高的亲和力(Herrmann等人，1996年). 当在缺乏血清的细胞中单独表达时，GFP-RBD_RalGDS公司在胞浆和核质中分布均匀，显示出负向细胞器，并在无膜室上积聚(图4A、 i）。此模式与GFP-RBD的模式无法区分_拉夫-1(图4B、 vi）或GFP在同一细胞中单独表达。然而，当与野生型Rap1、GFP-RBD共存时_RalGDS公司周边褶边累积在PM上(图4A、 ii）。当与Rap1V12共表达时，报告者积聚在突出的PM皱褶和核旁小泡上(图4A、 iii）。GFP-RBD未观察到再分布_RalGDS公司与无核苷酸的显性阴性Rap1N17共表达(图4A、 iv）。因此，GFP-RBD的膜募集_RalGDS公司取决于Rap1的GTP结合状态。

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图4。

活性COS-1细胞中的Rap1激活。（A） 用GFP-RBD转染COS-1细胞_RalGDS公司和载体（i）、未标记的Rap1野生型（ii）、Rap1V12（iii）或Rap1N17（iv），在转染后24小时，在血清中生长的条件下对细胞进行活体成像。（B） Cos-1细胞与GFP-RBD共转染_RalGDS公司（i–v），GFP–RBD_拉夫-1（vi–x），以及矢量（i和vi）、未标记的Rap1V12（ii和vii）、未标识的H-Ras61L（iii和viii）、未标注的M-Ras71L（iv和ix）或未标注的R-Ras87L（v和x）；血清饥饿；箭头表示高尔基体。（C） COS-1细胞与GFP–RBD共转染_RalGDS公司未标记Rap1野生型，以及载体（i）或未标记Rab1N17（ii）；血清中生长；并像在A中一样成像。（D）COS-1细胞与GFP–RBD共转染_RalGDS公司，未标记的Rap1野生型，以及矢量（i）或M-Ras71L（ii）；血清饥饿；如A所示。箭头表示PM.棒材，10μM。结果代表了三个独立的实验（每个实验每个条件检查30个以上的细胞）。

因为除了Rap1之外，H-Ras、M-Ras和R-Ras可能会与RalGDS的RBD相互作用(Ehrhardt等人，2002年)，我们测定了GFP-RBD膜募集的特异性_RalGDS公司用于报告GTP-bound Rap1。我们将探针与GTP-结合的H-Ras61L、M-Ras71L或R-Ras87L共表达，未观察到膜募集(图4B、 iii–v）在缺乏血清的COS-1细胞中。相反，GFP–RBD_拉夫–1是GTP-bound H-Ras61L、M-Ras71L或R-Ras87L的敏感探针(图4B，viii–x）但不受GTP约束的Rap1(图4B、 vii）。此外，显性负性Rap1N17阻断了野生型Rap1介导的GFP-RBD招募_RalGDS公司到膜褶边(图4C、 i和ii）。因此，GFP-RBD_RalGDS公司是一种对激活的Rap1具有特异性的体内探针。

验证GFP-RBD_RalGDS公司作为Rap1激活的读数并确认激活的Rap1的PM定位，我们通过一种替代的、生长因子无关的途径刺激Rap1。活化的M-Ras71L已被证明通过Rap特异性GEF，RA GEF 2激活Rap1(Gao等人，2001年). 而M-Ras71L在表达GFP-RBD的COS-1细胞中的表达_RalGDS公司未能诱使记者重新分配(图4B、 iv），野生型Rap1的共表达诱导探针显著重新分布到PM，但不到胞内小泡(图4D） 表明，在激活的M-Ras存在下，Rap1在PM上特异性激活。除M-Ras外，cAMP还通过Epac1（一种Rap1特异性全球环境基金）独立于生长因子调节某些细胞中的Rap1(川崎等人，1998年). 最近，一种不激活PKA的新型cAMP类似物8CPT-2Me-cAMP被证明能特异性激活Rap1(Enserink等人，2002年). 与生长因子刺激相比，我们无法检测COS-1、NIH 3T3或经8CPT-2Me-cAMP处理的293细胞中内源性或外源性表达的Rap1的激活，这两种细胞均使用GFP-RBD的膜募集_RalGDS公司在活细胞中或在细胞裂解物中GST-RalGDS RBD下拉（未公布的数据），表明Epac1在这些细胞中不表达。

Rap1的有丝分裂原刺激激活仅发生在PM，并且依赖于胞吐

GFP-Rap1（PM和内体）与GFP-RBD的差异膜定位_RalGDS公司在细胞内共存的Rap1（仅PM）引人注目，这表明在血清中生长的条件下，Rap1的GTP结合池仅限于PM。因此，我们寻求使用GFP-RBD_RalGDS公司研究细胞激活后Rap1激活的动态变化。

我们已经证明GFP-RBD_拉夫-1可以在活细胞中报告Ras对有丝分裂刺激的动态时空激活(Chiu等人，2002年). 确定GFP-RBD_RalGDS公司我们在COS-1细胞中表达此探针，血清饥饿细胞，然后用EGF刺激细胞。GFP-RBD公司_RalGDS公司均匀分布在90%以上的转染的、缺乏血清的细胞的胞浆和核质中，而没有在任何膜上积聚(图5A） ●●●●。暴露于EGF后5分钟内，GFP-RBD_RalGDS公司记者被内源性Rap1招募到膜皱褶(图5A） ●●●●。这次招募是暂时的，20分钟后就逆转了(图5A） ●●●●。当野生型Rap1与GFP-RBD一起过度表达时_{RalGDS公司，}观察到一种类似但更强健的对膜皱褶的补充，其动力学与之相反(图5B） 如内源性Rap1所观察到的(图5A） ●●●●。NIH 3T3成纤维细胞也有类似的观察结果(图5C） ●●●●。

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图5。

生长因子-刺激活细胞中Rap1的激活。（A） 用GFP-RBD转染COS-1细胞_RalGDS公司转染24小时后血清饥饿，37°C下EGF刺激后在指定时间存活。在任何COS-1细胞中均未观察到探针的内膜募集。在转染细胞的60±5%（平均值±SEM）中观察到探针的PM募集(n个= 4). （B） COS-1或（C）NIH 3T3细胞与GFP-RBD共转染_RalGDS公司和未标记的Rap1野生型，转染后24小时血清饥饿，如A所示成像。箭头指示GFP-RBD_RalGDS公司招募到PM酒吧，10μM。在没有COS-1或NIH-3T3细胞中观察到探针的内膜募集。分别在COS-1和NIH-3T3细胞的75±8%和71±10%（平均值±SEM）中观察到探针的PM募集(n个= 4). （D） 对COS-1细胞进行血清饥饿处理，然后用载体或100 ng/ml EGF刺激5分钟。用Sepharose-conjugated GST-RBD免疫沉淀澄清的细胞裂解物_拉夫-1和GST-RBD_RalGDS公司（顶部）或抗Ras和抗Rap1多克隆抗血清（底部）。免疫沉淀物用抗Ras（左）或抗Rap1（右）单克隆抗体进行免疫印迹。显示的结果代表了两个独立的实验。

为了验证用生长因子刺激后，RalGDS的RBD可以区分激活的Rap1和Ras，我们用EGF刺激COS-1细胞，用免疫沉淀的全细胞裂解物刺激GST-RBD_RalGDS公司或GST-RBD_拉夫-1使用Ras或Rap1特异性抗体通过免疫印迹检测每个激活的GTPase的水平。鉴于，GST-RBD_RalGDS公司检测到激活的Rap1而不是Ras，GST-RBD则相反_拉夫-1(图5D） ●●●●。因此，RalGDS的RBD对生长因子介导的Rap1激活具有特异性。我们的结论是，尽管Rap1在PM和内膜上都表达，但只有与PM相关的池在EGF刺激下成为GTP结合。因此，Rap1的细胞内池不同于H-Ras的细胞内库，H-Ras可以在原位激活以响应有丝分裂原(Chiu等人，2002年).

为了确定PM上Rap1的激活是否需要胞吐作用，我们分析了EGF刺激的GFP-RBD的募集_RalGDS公司在NEM或显性阴性Rab11BP存在的情况下，发现其被任一条件完全阻断(图6A） ●●●●。相反，用显性阴性的epsin抑制氯氰菊酯介导的内吞作用没有效果(图6B） ●●●●。因此，PM上Rap1的上调和GTP/GDP交换都需要胞吐作用，这表明这两个过程是有联系的。

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图6。

PM处Rap1的激活依赖于胞吐而非胞吞。（A） 用GFP-RBD转染COS-1细胞_RalGDS公司单独（顶部和中部）或显性阴性Rab11BP（DN Rab11BP；底部），转染后24小时血清饥饿，在没有NEM（顶部和底部）或存在NEM（中部）的情况下，37°C下用EGF刺激。在无细胞中观察到探针的内膜募集。在对照组、NEM处理组和DN Rab11BP转染细胞（平均值±SEM）中分别观察到63±14%、25±8%和29±10%的PM募集(n个= 4; 与对照组相比，每种情况的P＜0.02）。（B） COS-1细胞与GFP-RBD共转染_RalGDS公司未标记Rap1野生型和显性阴性epsin；血清饥饿；在德克萨斯红共轭转铁蛋白存在下用EGF刺激；在去除多余的转铁蛋白后刺激30分钟后，获得最右侧面板中显示的双色图像。只有未转染到右侧的细胞在内切体（箭头）中积累了转铁蛋白。在71±17%（平均值±SEM）的epsin转染、EGF刺激的细胞中观察到探针的PM募集(n个= 4). 箭头表示GFP-RBD_RalGDS公司招募到PM酒吧，10μM。

细胞培养和转染

COS-1、MDCK和NIH 3T3细胞维持在5%CO中₂37°C，在含有10%FBS（COS-1和MDCK）或FCS（NIH 3T3；科罗拉多血清公司）的DME中。Jurkat细胞维持在5%的CO中₂在37°C条件下，在含有10%FBS的RPMI中培养。将待荧光显微镜检查的细胞在2×10的温度下培养⁵将每个培养皿放入35毫米的培养皿中，培养皿中含有一个玻璃盖滑动覆盖的15毫米切口（MatTek），并在第二天转染。用SuperFect转染COS-1、MDCK和NIH 3T3细胞^®（QIAGEN），并在第二天检查细胞。用DMRIE-C（QIAGEN）转染Jurkat细胞，48小时后检测细胞。通过在37°C下用5μg/ml德克萨斯红结合转铁蛋白（分子探针）培养细胞30分钟，然后去除未结合探针，实现内体的荧光负载。用5μg/ml小鼠抗人CD3和抗人CD28（Ancell）刺激Jurkat细胞。

亚细胞分离

MDCK细胞生长到90-95%的汇合处，并在收获前在冷藏PBS中清洗。细胞悬浮在均质缓冲液中（0.3 M蔗糖、10 mM Tris-HCl、pH 7.5、10 mM-KCl、1 mM DTT和蛋白酶抑制剂），并通过滚珠均质器进行破坏（12-μM间隙）。为了去除未破碎的细胞和细胞核，匀浆在600℃下离心克5分钟。600的膜和可溶性部分-克上清液通过160000离心分离克120分钟。将总膜颗粒重新悬浮在1.35 M蔗糖中，并通过不连续的蔗糖密度梯度（0.25、0.90和1.35 M）通过离心分离（350000克120分钟）。在0.25-M和0.9-M蔗糖层之间的界面分离纯化高尔基体膜。从1.35-M蔗糖层中采集内切体。从0.9-和1.35-M蔗糖层之间的界面分离出PM和平滑ER的混合部分。通过将该组分加载到5–20%Optiprep（Nycomed）的线性梯度上并在95000下离心18小时，进一步纯化PM克离心后，从梯度顶部附近的组分中提取PM。用免疫印迹法分析50μg每种组分（由BCA分析法测定[皮尔斯化学公司]）的Na⁺/K（K）⁺ATP酶（兔子多克隆1:500；森本氏T。）、EEA-1（小鼠单克隆1:2500；转导实验室）和Rap-1（小鼠单克隆1:1000；转导实验）。使用兔抗鼠Ig抗血清和¹²⁵I蛋白A，并通过磷光成像仪进行可视化（分子动力学）。

生物素化表面表达测定

PM的亲和纯化基本上如前所述(Mammen等人，1997年). 简言之，将COS-1细胞在10厘米的培养皿中培养至融合，冲洗，并在冰上与10μg/ml的生物素缓冲液（10 mM硼酸钠，pH 8.8和150 mM NaCl）中的Sulfo-NHS生物素孵育20分钟。10毫米NH₄添加Cl终止反应，将细胞刮入1 ml细胞溶质溶解缓冲液（10 mM Hepes、10 mM NaCl、1 mM KCl、5 mM NaHCO_三，1 mM氯化钙₂，0.5 mM氯化镁₂1 mM PMSF、100 U/ml抑肽酶和5 mM EDTA），并在冰上培养5分钟。使用Dounce均质机在冰上破碎膜，并在1000℃下将细胞核和未破碎细胞制成颗粒克在RT条件下，将粗膜与固定化链霉亲和素孵育1h，并制备亲和纯化膜。将纯化的膜和未结合部分中的膜溶解在Laemmli缓冲液中，煮沸，然后进行SDS-PAGE，然后进行免疫印迹分析。用免疫印迹法分析50μg每种组分（通过BCA测定）的Na⁺/K（K）⁺ATP酶（兔子多克隆1:500；森本氏T。Morimoto的礼物）、EEA-1（小鼠单克隆1:1000；转导实验室）和Rap-1（兔多克隆1:1000，居里研究所J.de Gunzburg的礼物，法国巴黎）。使用兔抗鼠Ig抗血清和¹²⁵I蛋白A并通过磷光成像仪进行可视化。

Ras/Rap体外活化试验

如前所述，检测激活的Ras或Rap1(de Rooij和Bos，1997年). 使用抗panRas单抗（Ras10；Upstate Biotechnology）或抗Rap1单抗（Transduction Laboratories）进行免疫印迹分析。蛋白质检测使用¹²⁵I蛋白A通过磷成像仪分析。

成像和刺激

用倒置激光扫描共聚焦显微镜（蔡司510型LSM；卡尔蔡司显微成像公司）对活细胞进行检查。TIFF图像是用Adobe Photoshop 6.0处理的。对于有丝分裂原刺激，使用微型培养箱（PDMI-2型；哈佛仪器）将35-mm MatTek板中的细胞保持在37°C。通过向培养基中添加100 ng/ml EGF（COS-1细胞）或5μg/ml（Jurkat细胞）小鼠抗人CD3抗体（Ancell）进行刺激，同时持续观察所选细胞。在加入EGF之前，在37°C下用1 mM NEM预孵育细胞30分钟，以刺激NEM的存在。表达GFP-Rap1的Jurkat T细胞很容易分为两个群体：一个表现出清晰的PM荧光，另一个仅表现出内膜荧光。Rap1在Jurkat细胞PM上的上调是以CD3交联前后表现出先前表型的细胞百分比来衡量的。对至少三个独立实验中每一个实验中监测的至少六个细胞的结果进行统计分析，并使用单尾模型计算p值t吨测试。

我们感谢Jean de Gunzburg提供的Rap1 cDNA和抗血清，以及Adrienne Cox提供的M-Ras和R-Ras cDNA。我们感谢彼得罗·德卡米利（Pietro DeCamilli）的显性负性epsin，以及大卫·萨巴蒂尼（David Sabatini）、米尔顿·阿德斯尼克（Milton Adesnik）和民东·任（Mindong Ren）的拉布11BP。我们感谢Michael Dustin提供可溶性ICAM-1。我们感谢已故的、鼓舞人心的森本隆先生的帮助、建议和坚定不移的鼓励。

这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）AI36224和GM55279拨款、Burroughs Wellcome基金（给M.R.Philips）以及美国国立卫生院国家研究资源中心（M01RR00096）授予纽约大学医学院的普通临床研究中心拨款的支持。