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。2007年7月；134(14):2615-25.
doi:10.1242/dev.000877。 Epub 2007年6月13日。

ICAP-1缺陷小鼠成骨细胞功能缺陷

丹尼尔·布瓦德 1, 阿提拉·阿斯佐迪, Günter Kostka公司, Marc R区块, 科琳娜·阿尔比盖斯·里佐, 莱因哈德·菲斯勒
附属公司

ICAP-1缺陷小鼠成骨细胞功能缺陷

丹尼尔·布瓦尔德等。 开发。 2007年7月。

摘要

整合素受体家族通过补充辅助分子在细胞间和细胞外基质相互作用中发挥重要作用。其中之一，整合素胞质域相关蛋白-1（ICAP-1；也称为ITGB1BP1）与β1整合素亚基的胞质域特异性相互作用，并在体外负调控其功能。为了探讨ICAP-1在体内的作用，我们在小鼠体内消融了ICAP-1基因。我们报道了ICAP-1在骨发育过程中对成骨细胞功能的意外作用。Icap-1缺乏小鼠的成骨细胞增殖减少，骨矿化延迟，导致骨缝形成延迟。体外研究表明，原代和永生化Icap-1缺失成骨细胞在细胞外基质基质上的粘附和铺展增强，这可能是由于β1整合素活化增加所致。最后，我们提供证据表明，ICAP-1通过调节整合素的高亲和力状态支持骨祖细胞的凝集，从而促进骨祖细胞分化。

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数字

图1
图1。老鼠的干扰Icap-1基因
（A） 同源重组后小鼠Icap-1基因和靶向等位基因的部分结构。黑框代表外显子（E2到E7）。起始密码子（ATG）位于外显子2。用BamH1消化并与指定的外部探针（ext-pb）杂交后，野生型和重组等位基因的预期片段大小分别为20 kb和10 kb。（B） 猪尾DNA的Southern blot分析Icap-1+/+,Icap-1+/−和Icap-1−/−老鼠。（C） 成年大鼠肾脏总RNA的Northern blot分析Icap-1+/+,Icap-1+/−和Icap-1−/−老鼠。过滤器与特定于Icap-1和Gapdh公司分别是。（D） Icap-1的Western blot分析+/+，Icap-1+/−和Icap-1−/−大脑提取物。（E-F）全山紫胶Z染色Icap-1+/−E8.5（E）和E14.5（F）的胚胎。
图2
图2。生长延迟、颅面畸形和骨矿化延迟Icap-1-缺陷小鼠
（A） 的外观Icap-1+/+和Icap-1−/−P0窝交配。请注意Icap-1−/−老鼠的体型比同窝的对照小。的子集Icap-1−/−后代的胃是空的（箭头所示）。（B） 对照生长曲线(Icap-1+/+或Icap-1+/−)与Icap-1−/−（男性和女性）两个共同代表的同卵双胞胎的后代。在34天内每隔一天对小鼠称重。每个点代表30天野生型的平均±S.D.（C）侧视图（上面板）或俯视图（下面板），以及Icap-1-缺陷小鼠。注意Icap-1-与野生型相比，颅骨缺损。（D） X射线分析Icap-1型+/+和Icap-1−/−550月龄小鼠。请注意，在Icap-1-null鼠标头骨形状受到严重影响，长骨较短，脊椎骨骨化不良（箭头和插入物用于放大）。（E） E16.5骨骼的茜素红/阿尔西安蓝染色。上颌（箭头）、前肢桡骨和尺骨（箭头）茜素红染色强度降低Icap-1-无组织。（F） 新生儿期茜素红/阿尔辛蓝骨骼染色。不同基因型之间的染色强度或图案没有明显差异。
图3
图3。颅骨骨化缺陷Icap-1突变小鼠
（A–B）头骨的整体茜素红染色Icap-1+/+和Icap-1−/−新生小鼠。（A） 野生型和突变型动物的颅底矿化程度相当。（B） 颅骨穹隆的矿化。顶骨间（ip）、顶骨（p）和额骨（f）的矿化区域较小，在Icap-1−/−老鼠。棒材，2 mm。（C-H）野生型和全贴装茜素红/阿尔西安蓝染色Icap1号机组-空的2个月大的头颅。外斜面缝合区用C-E框住，用F-H高倍镜显示Icap1号机组-null（D，E）矢状缝合线较短，冠状缝合线呈V形且不规则，与野生型配偶相比（C）。在这个年龄段，野生型（F）的上睑缝合线（箭头）是闭合的，而Icap-1型-缺陷小鼠-外斜面缝合线的后部没有骨化，并用阿尔西安蓝（G，H）染色。一些Icap-1−/−小鼠的额骨显示出非矿化的阿尔西安蓝阳性区域（H中的箭头）。钢筋分别为5 mm（C–E）和2 mm（F–H）。（I，J）21天龄野生型（wt）和Icap-1−/−（mt）小鼠。箭头指向在Icap-1型-在对照动物中完成融合时，出现缺陷的小鼠。
图4
图4。成骨前缘形成缺陷Icap-1−/−头盖骨
（A） 新生儿颅骨的整体LacZ染色Icap-1+/+和Icap-1−/−动物。强大的LacZ活动，可视化Icap-1骨缝区和骨板边缘的表达Icap-1-颅骨缺损。棒状物为2mm。（B–C）苏木精-伊红染色的顶叶区额叶。围产骨骨化端（箭头）之间的距离在Icap-1−/−（C） 与野生型小鼠相比（B）。（D–E）通过野生型（D，F）矢状缝合线冻结的额叶断面Icap-1−/−（E，G）用苏木精和伊红染色的动物（D，E）或用于LacZ活性的动物（F，G）。请注意，野生型缝合线呈现出典型的浓缩细胞群，对应于成骨前沿（箭头），在Icap-1−/−老鼠。LacZ染色显示ICAP-1在该区域广泛表达。B、 骨；缝间间质；SO，枕上骨；P、 顶骨；F、 额骨；S、 矢状缝；L、 羊羔状缝合线；C、 冠状缝；如果是额间缝合。棒材为50μm。
图5
图5。颅骨成骨细胞增殖减少Icap-1无鼠标
（A） 新生儿矢状缝区增殖标记物Ki67的免疫检测Icap-1+/+和Icap-1−/−颅骨Icap-1−/−小鼠Ki67阳性细胞数量减少。方框表示用于（B）中KI-67和BrdU量化的区域。棒材为25μm。（B） 对照和突变动物成骨前沿Ki67-和BrdU-阳性细胞的定量。误差条代表S.D.星号表示Icap-1+/+和Icap-1−/−（**，P<0.0001）。（C） 不朽颅骨成骨细胞。ICAP-1缺陷细胞（SV2.1-Icap-1−/−)与野生型细胞相比，BrdU标记指数显著降低（SV6.5-Icap-1+/+). 逆转录病毒转染Icap-1cDNA导入Icap-1−/−细胞拯救增殖缺陷（SV2.1-Icap-1重新扫描)（**，P<0.0001）。（D） SV2.1和SV2.1-Icap-1救援细胞在1%FCS中培养24小时，然后将其移植到10μg/ml FN上。铺展5小时后，用PBS清洗细胞，并用RIPA缓冲液直接裂解到培养皿上。凝胶分离每条通道中30μg的蛋白质，然后转移到PVDF膜上，然后用抗细胞周期蛋白D1抗体进行蛋白质印迹。用抗肌动蛋白多克隆抗体对同一凝胶进行印迹，以使蛋白质负荷正常化。
图6
图6。成骨分化异常Icap-1−/−头盖骨
通过顶骨和矢状缝的额断面Icap-1+/+和Icap-1型−/−对新生小鼠进行（A）AP、（B，C）骨连接蛋白、（D，E）Col1（F）FGFR1和（G）FGFR3染色。（C，E）分别是（B）和（D）成骨前部区域的（400倍）放大视图。虚线表示骨边界和成骨前区。B、 骨；缝间间质。注意成骨和分化标记在Icap-1−/−组织。对E17.5胚胎颅盖骨进行整体原位杂交以检测Cbfa1/运行x2（H） 或Bsp公司成绩单（I）Icap-1+/+和Icap-1−/−胚胎。顶部面板是整个颅骨的概览，底部面板是成骨前部的近距离视图（概览中的方框）。棒材为2 mm。
图7
图7。骨结节形成Icap-1−/−颅骨成骨细胞有缺陷
（A） 主要Icap-1+/+和Icap-1型-缺失的成骨细胞在诱导培养基中培养4周，并用茜素红染色以监测骨结节的形成。Icap-1−/−与野生型培养物相比，培养物显示出更少更小的矿化结节（箭头）(Icap-1+/+). 该结果代表了来自3种不同动物的至少3个独立实验。棒材，1 mm。（B）永生成骨细胞SV2.1Icap-1−/−，SV6.5Icap-1型+/+或SV2.1-Icap-1重新扫描在诱导培养基中培养3周，通过茜素红染色鉴定矿化结节。Icap-1−/−与野生型相比，成骨细胞显示出显著减少的结节形成Icap-1重新扫描成骨细胞。通过3个独立实验计算平均值和S.D.（*，P<0.05，**，P<0.0001）
图8
图8。β增加1整合素活性Icap-1−/−细胞
（A） 用识别配体结合β1整合素。β1整合素在野生型细胞上高度表达并被强烈激活(Icap-1+/+)在成骨前部（箭头所示）和骨板的表面（箭头所示）。在Icap-1−/−组织中，成骨前部的细胞显示出适度的活性β染色1整合素条为50μm。（B） FACS分析表明，β1整合素的表面表达（由MB1.2单克隆抗体测定）在Icap-1−/−原代成骨细胞（红色）与野生型成骨细胞相比（蓝色）。（C） 粘附性分析。粘附力Icap-1型−/−FN和Col1的原代成骨细胞与Icap-1+/+细胞。粘附力以最大粘附力的百分比表示，并在两个不同动物的两个独立实验中测量两次（p<0.05）。（D） FACS分析表明FITC-Fn 7-10片段与Icap-1−/−成骨细胞（绿色）。（E） β的活化指数（AI）1整合素增加Icap-1−/−成骨细胞。获得的最大AI用于标准化两个基因型组，并称为100。
图9
图9。骨结节形成缺陷和球状体压实Icap-1−/−成骨细胞
（A） 永久SV6.5（野生型）或SV2.1(Icap-1−/−)体外诱导前成骨细胞分化15天，用相差显微镜观察骨结节的形成和组织。Insert是方框区域的放大倍数较高的视图；请注意，SV2.1单元的内聚性不如控制单元。（B） 球体由SV2.1形成，SV2.1被救出Icap-1cDNA或SV6.5前成骨细胞，并在37°C下孵育16小时后使用标准的悬滴试验方案进行分析。在每个实验条件下，我们每滴使用25000个细胞。对于抗体处理，在浓缩过程中，在补充有FN贫化血清的培养基中以10μg/ml的最终浓度添加9EG7或对照抗体（ctl）。
图10
图10。颅骨骨形成示意图
骨形成是一个多步骤的过程，首先需要一个初始凝结阶段。这一步使细胞开始分化过程，在分化过程中表达一些早期标记物，如Cbfa1/Runx2、Osterix。在后期，会产生其他成骨标志物，如AP、BSP、骨钙素和骨连接素。ICAP-1表达的缺乏减缓了间充质细胞的增殖和致密化能力。由于致密化是成骨细胞分化途径中的一个非常早期的事件，因此更多远端标记物的表达在Icap-1−/−动物。
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