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.2003年6月9日；161(5):853-9.
doi:10.1083/jcb.200301102。 Epub 2003年6月2日。

微管对局灶性粘连的纳米靶向作用

奥尔加·克里里什基纳 1, 库尔特·安德森, 伊琳娜·卡维琳娜, 艾琳·厄普曼, 迪特玛·J·曼斯坦, J Victor Small公司, 德里克·图姆
附属公司

微管与病灶粘连的纳米靶向性

奥尔加·克里里什基纳等。 J细胞生物学. .

摘要

虽然细胞运动是由肌动蛋白驱动的，但极化和定向运动需要完整的微管细胞骨架，微管骨架通过与粘附复合物的特定靶向相互作用调节底物粘附来影响极化。粘附位点靶向的保真度是精确的；使用全内反射荧光显微镜（TIRFM），我们现在显示微管末端（通过加入GFP微管蛋白可见）在向细胞外周聚合时位于底物的50 nm范围内，而不是在从底物收缩时。多个微管有时遵循类似的轨迹，建议沿着一个共同的细胞骨架元素进行指导。TIRFM与GFP-或DsRed-zyxin结合使用，与GFP-tubulin或GFP-CLIP-170结合使用，进一步揭示了靠近背表面的聚合微管加末端始终以底物粘附复合物为靶点。这支持了微管尖端复合体在引导微管进入粘附病灶中的中心作用，并为微管尖端和基质粘附之间在分子尺寸范围内的密切交互作用提供了证据。

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数字

图1。
图1。
TIRFM揭示了在背侧细胞表面150nm范围内的微管尖端和局灶性粘附。用GFP-tubulin（A和C）或GFP-zyxin（B和D）转染CAR成纤维细胞。采用标准宽场外照射（A和B）或TIRFM（C和D）拍摄活细胞图像。为了清晰起见，TIRFM图像以相反的对比度显示。棒材，10μm。对于C，请参见视频1和视频2。
图2。
图2。
微管和末端尖端接近细胞表面。（A） 转染GFP-tubulin并通过TIRFM成像的CAR成纤维细胞（如图1C所示）呈假彩色，以突出沿微管的荧光强度变化。没有像素饱和。棒材，10μm。（B） 沿着微管测量四个微管的强度（A中标记为1–4），从靠近极值正端开始（接近数值）。根据荧光强度指数下降与表面成反指数关系（1/e=穿透深度），计算微管到细胞表面的相对距离，并绘制为线迹（0=正端）。在不含微管的区域也进行了追踪，以纠正局部背景（未描述）。注意微管加端与细胞表面的紧密接触超过几微米；随着微管深入细胞（右侧），强度逐渐下降。在这个短暂的“快照”中，微管既有聚合也有解聚，并且在微管解聚之前，最末端的加号端经常“升起”（参见视频1和视频2）。大多数微管以<5°的浅角度接近表面，尽管有时观察到迎角陡至～10°，例如在标有红色星号的区域。
图3。
图3。
TIRFM对微管加端的观察表明，微管在收缩过程中从基底上提起，并显示微管沿着共同路径进行追踪。（A–C）图1 C中单个延时帧的高倍视图。（A）TIRFM观察到的微管生长+末端。星号标记第一帧中微管末端的位置，箭头跟随随后帧中微管的生长。请注意，在微管伸长过程中，微管“向下倾斜”并与细胞皮层紧密接触，这可以从沿微管的荧光强度差异中看出。（B） 收缩微管的典型示例。注意微管收缩时与细胞基质失去紧密接触。（C） 观察到微管沿着共同的轨迹走，似乎相互背对，有时三个或更多的微管沿着一条共同的轨迹。箭头标记沿着公共轨迹的微管（另请参阅视频1和视频2）。
图4。
图4。
TIRFM显示微管对病灶粘连的纳米靶向性。双转染DsRed-zyxin和GFP-tubulin的CAR成纤维细胞TIRFM中的视频帧。假彩色被用于促进粘连（酶蛋白，绿色）和微管（微管蛋白，红色）的可视化。单通道GFP-微管蛋白图像以黑白显示。（A） 细胞边缘概述，显示微管粘附靶向性（顶部），以及底部，许多微管尖端接近基底的位置与粘附位点共定位（箭头）。（B和C）微管向下浸入粘附复合物的其他实例；以秒为单位显示的时间（另请参阅视频3–5）。
图5。
图5。
微管尖端聚合成粘附部位。（A） 转染DsRed-zyxin和GFP–CLIP-170的CAR成纤维细胞的共焦视频帧。不同的箭头对标记着三个微管的尖端，这些微管的末端通向黏附复合体。时间以秒为单位。（B） 转染细胞的视频图像如a中所示，但用TIRFM成像，显示聚合微管尖端与背侧细胞表面非常接近（请注意，高对比度TIRFM的背景少得多，微管加端（绿色）出现在渐逝场中）。（C） 从B中的盒子中合并五个时间点（超过20秒），显示微管向粘附标记（红色）聚合。（D） GFP-tubulin和DsRed-zyxin转染细胞的双色TIRFM成像。细胞区域类似于B中所示的区域（另请参阅视频6–8）。（E） 引导微管进入焦点粘连的工作模式。顶部显示了指导场景的侧视图，突出了聚合（Pol.）和解聚（de-Pol.）期间微管+末端的Z轴位置的显著差异。微管聚合通过微管尖端复合体对接到肌动蛋白轨道上，定向至粘附部位并进入消逝波（EW）。远离粘附部位的解聚与尖端复合物的损失以及微管从轨道和基底上的提升有关。解聚微管可以通过解救，重新进入聚合循环，通过动态不稳定性重新定位粘附部位。底部显示按近似分子尺寸缩放的方框区域。将焦点粘附力（FA）和微管轴（直径约24 nm）分别拉离基板15 nm和50 nm。许多已知的尖端复合蛋白（TCx）可能比描述的更广泛地修饰微管表面。微管和肌动蛋白（a）之间的耦合受耦合器复合物（Cr）的影响，后者是微管尖端复合物的一部分，如其他地方所建议的（Small和Kaverina，2003）。这种耦合器可能是一种非传统的肌球蛋白或微管-肌动蛋白交联剂（见正文）。微管可能在粘附部位被捕获（钩住）。ECM，细胞外基质。
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