腊肠犬精疲力竭扰乱乳腺发育并改变乳腺祖细胞库的组成

DACH1在多能胎儿哺乳动物干细胞以及成体基底细胞和ERα中表达⁺发光细胞

为了检查第1天根据乳腺细胞类型，我们对最近发表的两项确定乳腺细胞亚型的单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究进行了审问(巴赫等人。，2017，Giraddi等人。，2018). 发育阶段注释的scRNA-seq转录体由Epcam生成⁺乳腺上皮细胞（MEC），来源于发育期（胚胎第16天[E16]和E18天）、出生后第4天（P4）和成年小鼠乳腺组织(Giraddi等人。，2018) (图2A） ●●●●。这些数据的登录号为GEO：{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE106273”，“term_id”：“106273”}}GSE106273和GEO：{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE111113”，“term_id”：“111113”}}GSE111113标准使用网络工具根据扩散组分（DC）绘制单个细胞转录组的相关性(http://uofuhealth.utah.edu/huntsman/labs/spike/d3.php)如前所述(Giraddi等人。，2018). 扩散图提供了一种容错的非线性降维方法，基于单个Epcam之间的局部相似性揭示了数据的全局拓扑⁺MEC公司。在这张图中，DC1反映了相对基底到管腔特征的连续性。DC2反映了从一端的原始（E16和E18）到另一端的P4到成年乳腺细胞的发育时间。然后在扩散图中评估Dach1转录物的丰度，以显示与发育阶段的相关性以及管腔亚型与基础亚型的相对丰度(图2B） ●●●●。第1天在早期发育阶段检测到表达，包括在胚胎中的多潜能胎儿乳腺干细胞（fMaSCs）和青春期前的混合血统前体细胞（MMPr）(图2B） ●●●●。第1天成人基底细胞和ERα也有表达⁺管腔祖细胞。

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图2

Dach1型乳腺上皮细胞发育过程中的RNA转录

（A） 按发育阶段注释的单细胞RNA测序（scRNA-seq）转录体扩散图。Epcam公司⁺乳腺上皮细胞（MEC）来源于发育期（胚胎第16天[E16]和E18天）、出生后第4天（P4天）和成年MEC(Giraddi等人。，2018)，并使用软件根据扩散成分（DC）绘制scRNA-seq(http://uofuhealth.utah.edu/huntsman/labs/spike/d3.php），如前所述(Giraddi等人。，2018). DC1代表从基底亚型到管腔亚型的相对富集的连续性。DC2代表从原始（E16和E18）到P4成年乳腺细胞占据DC2轴末端的发育时间。

（B） 丰富的第1天转录物绘制在扩散图scRNA-seq转录组学上，以显示与发育阶段和管腔与基础亚型相对丰度的相关性。第1天在胚胎中的多能干细胞和青春期前的混合血统前体细胞中表达第1天在成人基底细胞（右下角的深蓝色圆点）和（ERα⁺)管腔祖细胞（右上角的淡蓝色圆点）。

（C–F）第1天RNA转录物在出生后发育期间表达。（C） 来自未产妇、妊娠中期、哺乳期和退化后乳腺的MECs的scRNA-seq鉴定出15组MECs(巴赫等人。，2017). （D） 每个簇类型中Dach1的相对表达以比色显示，相对表达显示在右侧的栏中。（E） 基于15个簇的对数转换平均表达值的簇树状图。红色方框显示了其中的集群子类型第1天根据（F）中显示的转录物相对丰度表示。第1天基因表达主要在推测的基底细胞和肌上皮细胞（簇C12、C13和C14）中检测到，在管腔ERα中也检测到少量表达⁺（C3簇）和管腔祖细胞簇（C6/7）。

我们接下来评估第1天第二个不同的转录组分析中的转录丰度。第二项研究确定了MEC在四个成年发育阶段的基因表达谱；未产妇、妊娠中期、哺乳期和退化后(巴赫等人。，2017). 对23184个成体细胞的分析确定了15个代表不同转录细胞状态的簇(图2C） ●●●●。Dach1型基因表达主要在推测的基底细胞和肌上皮细胞（簇C12、C13和C14）中检测到，在管腔ERα中也检测到少量表达⁺（C3簇）和管腔祖细胞簇（C6/7）(图2D–2F）。

总的来说，这些研究在不同的数据集之间是一致的，并说明Dach1在fMaSCs以及成人基底细胞和ERα中表达⁺管腔细胞。

DACH1促进乳腺干细胞和基底/肌上皮细胞扩张

确定第1天使用Ki-67免疫组织化学评估细胞增殖、基因缺失。Ki-67染色在切除Dach1型基因(图3A和3B）。根据TUNEL染色评估，对照小鼠的细胞凋亡很低，并且不受第1天删除。(图S2A和S2C）。组织治疗第1天缺失小鼠(第1天^{飞行/飞行}；俄罗斯26^{mTmGfl/Cre-ERT2型}+三苯氧胺）和DNase1作为阳性对照，在所有上皮细胞中诱导TUNEL染色(图S2B和S2C）。准备了乳南瓜(图S3A和S3B）。仔细计算分支数后发现第1天^−/−乳腺(图3C） ●●●●。

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图3

第1天基因缺失减少乳腺细胞增殖、导管分支和肌上皮/干细胞

（A） 细胞增殖通过Ki-67免疫染色评估，细胞核通过DAPI染色标记（A）。

（B） 如上所述，但量化为每组3只单独小鼠的平均值±SEM。显示的数据第1天^{重量/重量}俄罗斯26^{CreERT2/mTmGfl}与第1天^{飞行/飞行}俄罗斯26^{CreERT2/mTmGfl}三苯氧胺治疗后，如图所示图1答：。

（C） 导管分支分析（显示为n=3只小鼠的平均值±SEM）。典型示例以高倍显示图S3.

（D） 乳腺上皮的典型荧光激活细胞分选（FACS）分析显示mT和mG细胞分离，随后的Lin分离⁻细胞和CD24/CD29状态的分配。

（E） 林的比例⁻细胞（乳腺细胞，不包括血管和造血细胞）通过FACS分析进行测定，并对n=4个分离小鼠进行定量。林的比例⁻基因型之间的细胞没有显著变化。

（F） 林的百分比⁻CD24型^医学CD29型^你好对每组中n＝4只单独的小鼠进行FACS分析，测定细胞。

（G） 内腔上皮细胞显示为Lin⁻CD24型^你好CD29型^低n=4只分离小鼠的数据为平均值±SEM。

为了确定内源性DACH1对乳腺细胞亚型比例的作用，对转基因小鼠的乳腺进行荧光激活细胞分选（FACS）分析(图3D） ●●●●。为了丰富基底细胞，林⁻已选择个单元格(图3D和3E），随后对CD29进行选通^高的和CD24^中等的三苯氧胺处理对照组的（基础）细胞(第1天^{重量/重量}-罗莎26^{mTmGfl/Cre-ERT2型})和第1天^{飞行/飞行}转基因(第1天^{飞行/飞行}-罗莎26^{mTmGfl/Cre-ERT2型})老鼠(图3F） ●●●●。几项研究显示了该亚群中细胞的多系潜能(Shackleton等人。，2006，维斯瓦德和斯廷格尔，2014年). 这个群体，在本文中称为基底细胞，先前已被证明富含双潜能乳腺干细胞（MaSC），并为基底/肌上皮和管腔谱系产生单能干细胞或长寿祖细胞(维斯瓦德和克利夫斯，2016年). 林的相对比例⁻CD24型^医学CD29型^高的减少了>40%Dach1型^−/−乳腺(图3D） ●●●●。根据表位标记和FACS分析对额外的细胞亚型进行定量，发现管腔上皮池（CD24）增加^高的CD29型^低的)在中第1天^−/−乳腺(图3G） ●●●●。

为了进一步研究内源性DACH1对基底细胞和腔上皮细胞发育的影响，我们使用传统的细胞角蛋白谱系标记物对乳腺进行了免疫荧光分析。细胞角蛋白5（CK5）用于识别基底上皮细胞，CK8用于识别管腔上皮细胞。在第1天^−/−乳腺上皮细胞，CK5的相对丰度降低，CK8的相对丰度增加(图4A和S4系列).

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图4

第1天基因缺失降低乳腺干细胞和导管细胞系基因靶点的丰度

（A） 细胞角蛋白5（CK5）和CK8的免疫荧光双重染色显示，Dach1基因缺失降低了CK5阳性细胞与CK8阳性细胞的相对数量。

（B） 分化因子的免疫组织化学染色(加塔3，百万分之一、和Pygo2号)在乳腺中第1天^+/+与第1天^−/−（Cre缺失小鼠）(第1天^{重量/重量}俄罗斯26^{CreERT2/mTmGfl}与第1天^{飞行/飞行}俄罗斯26^{CreERT2/mTmGfl}). 红色箭头表示基底上皮细胞。

（C） 免疫组织化学染色定量显示n=3只单独小鼠的平均值±SEM。

DACH1提高导管分支调控基因的丰度

由于DACH1缺失减少了乳腺导管分支，我们接下来确定内源性DACH1对已知控制该过程的基因表达的影响。分支与PYGO2增加相关(Gu等人。，2013)，ELF5(Chakrabarti等人。，2012)、PML、槽口1(Bouras等人。，2008)和GATA3(Asselin-Labat等人。，2007). 对野生型乳腺进行免疫组织化学分析，发现管腔细胞中存在PYGO2，偶尔有基底细胞染色，管腔和上皮细胞中均存在PML，管腔细胞内GATA3表达（用图4B） ●●●●。在第1天^−/−乳腺PYGO2、PML和GATA3的丰度降低(图4B和4C）。

qPCR验证了第1天信使核糖核酸(图5A） 以及加塔3，精灵5，百万英里，槽口1、和Pygo2号(图5B–5F）第1天^−/−乳腺。槽口1mRNA水平适度降低(图5E） ●●●●。在DACH1稳定转染的MDA-MB-231乳腺癌细胞系上进行染色质免疫沉淀测序，以评估DACH1与这些靶基因的结合情况(Wu等人。，2008，Wu等人。，2011). 在目标启动子处发现DACH1结合显著富集加塔3，精灵5，百万分之一，槽口1、和Pygo2号(图5G–5L）。DACH1富集位于每个基因的转录起始位点，与已知的DACH1与转录延伸调节器（TCERG）的结合一致（TCERG1，也称为CA150或TAF2S）(Zhou等人。，2010年a)以及CTCF现场(图5H–5L）。

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图5

DACH1占据乳腺干细胞和导管细胞谱系基因靶点的启动子区

乳腺干细胞和导管发育相关基因mRNA的（A–F）qRT-PCR分析，（A）第1天，（B）加塔3，（C）精灵5，（D）百万分之一，（E）槽口1、和（F）Pygo2号，在Cre缺失小鼠的乳腺中(第1天^{重量/重量}俄罗斯26^{CreERT2/mTmGfl}与第1天^{飞行/飞行}俄罗斯26^{CreERT2/mTmGfl})n=3只分离小鼠的定量显示为平均值±SEM。槽口1mRNA水平在第1天^−/−乳腺。

通过对DACH1稳定的MDA-MB-231细胞（G）进行染色质免疫沉淀测序分析，评估DACH1与这些靶基因的结合情况。（H）Gata3型，（一）精灵5，（J）百万分之一，（K）槽口1、和（L）Pygo2号.

DACH1增强上皮细胞培养中的导管分支

LA-7细胞具有自我更新和多系分化的正常乳腺干细胞特性在体外和体内(Zucchi等人。，2007). LA-7细胞保持着分化为所有上皮细胞类型的潜能体内并且，当在3D胶原基质中培养时，发育出具有3D小管-肺泡状结构的类器官，其在形态和功能上再现了乳腺树的3D结构(Zucchi等人。，2007). 通过相差显微镜评估表达DACH1的LA-7细胞或接种在3D胶原生成的导管/腺泡结构上的对照细胞(图6A） ●●●●。分支发生在第7天，并在第14天增加，随后(图6A） ●●●●。DACH1转导的LA-7细胞发芽率增加2.3倍(图6B、 n=3个实验，p<0.01，第20天）。第14天，与对照组相比，LA-7-DACH1细胞的小管结构转变为小叶结构(图6A） ●●●●。当标准化为β-肌动蛋白负荷控制时，DACH1在第4天增加了β-酪蛋白丰度并降低了CD44(图6C） ●●●●。用DACH1表达载体转染LA-7细胞可使DACH1的表达增加3倍，如qPCR所示(图6D） ●●●●。RT-PCR分析显示，当归一化为次黄嘌呤磷酸核糖（HPR）时，管腔标记物E-cadherin（CDH1）和CK18增加了2-3倍；表面糖蛋白CD44的丰度降低了40%(图6D、 p<0.05）。导管形态发生靶基因Gata3被诱导3倍，Notch1被诱导4.8倍(图6D） ●●●●。

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图6

DACH1诱导LA-7细胞的导管分支和肥大细胞

（A） 显示了胶原板上培养的LA-7细胞的典型相差显微镜图像（上面板）、用控制载体转导的LA-7-细胞（中面板）或表达载体的DACH1（下面板）。

（B和C）在第20天（B）对细胞进行导管形成分析。每个视图的LA-7小管芽数显示为平均值±SEM（C）。免疫印迹法检测用对照载体或DACH1表达载体转导的LA-7细胞的抗体。β-肌动蛋白用作蛋白质负荷控制。

（D） 对乳腺干细胞调节基因进行RT-PCR分析。结果显示为n=3个单独实验的平均值±SEM。^∗p<0.05。

（E） 用DACH1或空载体转染的LA-7细胞的免疫荧光，生长在3D类器官结构中。DACH1降低了肌上皮标记物（CK14，绿色），而管腔标记物（CDH1）上调。

（F） 分析LA-7细胞，或用对照载体或表达DACH1的载体转导的LA-7细胞的乳球形成。在第8天，用500个细胞/1.4 mL培养基的限制稀释液培养细胞，并对乳腺（150–200个细胞）进行计数。显示了代表性场的相位对比图像和乳房球的数量（n=3个单独实验的平均值±SEM），^∗p<0.01）。

（G） 用DACH1或载体控制转导的LA-7细胞的一个单独克隆在24孔板中作为乳腺球生长，典型图像显示为2×。

接下来，我们使用免疫荧光技术研究了DACH1对LA-7细胞器官形成过程中管腔和肌上皮细胞谱系标记丰度的影响。将转染DACH1或空载体的LA-7细胞作为对照，在胶原蛋白中培养10天，然后用胶原酶消化。然后将3D结构嵌入OCT并用冷冻刀切片。转染DACH1的LA-7产生的有机物表达上皮管腔标记物（CDH1），但肌上皮标记物（CK14）较少(图6E和第5章).

因为内源性DACH1提高了Lin的比例⁻CD24型^医学CD29型^高的我们在本文中将其称为基底细胞，我们考虑了DACH1可能驱动MaSC的扩张的可能性，因此部署了使用LA-7细胞的乳房球形成替代试验。LA-7细胞的DACH1转导使乳腺数目增加30%(图6F和6G，n=3个单独实验，p<0.01）。LA-7细胞的转导效率为70%-80%。因此，DACH1促进LA-7细胞中乳腺导管和乳房球的形成。

DACH1抑制青春期乳腺中TGF-β的作用在体内

TGF-β信号通路抑制乳腺祖细胞自我更新(Martinez-Ruiz等人。，2016)和谱系承诺决定，减少肌上皮细胞祖细胞(Lindley和Briegel，2010年，Martinez-Ruiz等人。，2016). 此外，已知TGF-β可抑制乳腺导管分支(Bottinger等人。，1997，丹尼尔和罗宾逊，1992年，Moses和Barcellos-Hoff，2011年，Nelson等人。，2006，Pierce等人。，1993) (图7A） ●●●●。因此，我们确定了内源性第1天通过首先评估SMAD的磷酸化来抑制乳腺TGF-β活性。免疫组织化学染色显示基底和管腔MEC中SMAD 2/3和SMAD 1/5/8的磷酸化增加(图7B–7E）。

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图7

第1天基因缺失激活乳腺中TGF-β信号传导

（A） 本文确定的乳腺表型总结Dach1型基因缺失，与转化生长因子-β基因缺失的文献综述(丹尼尔和罗宾逊，1992年，Moses和Barcellos-Hoff，2011年，Bottinger等人。，1997，Nelson等人。，2006，皮尔斯等人。，1993).

（B和C）小鼠乳腺中pSMAD2/3免疫组化染色的代表性示例（B）和定量分析（C），如下所示第1天^+/+(第1天^{重量/重量}俄罗斯26^{CreERT2/mTmGfl})和DACH1号机组^–/–(第1天^{飞行/飞行}俄罗斯26^{CreERT2/mTmGfl}).

（D和E）pSMAD 1/5/8（D）免疫染色的代表性示例，量化（E）显示为n=3只单独动物的平均值±SEM。

用DACH1表达载体转导的Met-1乳腺癌细胞的（F和G）Western blots，使用针对所示蛋白的抗体（F）针对p-SMAD2/3和（G）针对DACH1、p-SMAD1/5/8和Cyclin D1。

（H） 蛋白质印迹第1天^重量与第1天^−/−免疫沉淀后3T3细胞与SARA的相关性为Smad 2/3。S.E.，短期接触；L.E.，暴露时间更长。β-肌动蛋白被用作蛋白质负载对照。

DACH1促进乳腺导管分支

目前的研究表明Dach1型缺失减少乳腺导管分支，LA-7细胞中DACH1表达增强导管分支。先前的研究表明，DACH1在促进包括成纤维细胞在内的几种不同细胞类型的迁移中发挥作用(Wu等人。，2008)、MEC(Wu等人。，2008)，前列腺上皮细胞(Chen等人。，2015)和血管内皮细胞(Chang等人。，2017). TGF-β1是乳腺导管分支的主要负调控因子，限制终芽分叉和分支形成(Ewan等人。，2002，英格曼和罗伯逊，2008年，Silberstein和Daniel，1987年). 显性阴性TGF-β等位基因（dnIIR）的上皮细胞或基质表达增加乳腺导管分支(Bottinger等人。，1997).第1天缺失现象复制TGF-β过度活性。这个发现Dach1型基因缺失现象TGF-β活性过高第1天缺失导致TGF-β过度活跃，乳腺中SMAD磷酸化增加，表明Dach1介导的TGF-α抑制可能控制乳腺导管分支表型。SMAD磷酸化在基底细胞和管腔细胞中均增加。DACH1在发育过程中在基底细胞和管腔细胞中表达；然而，在成人乳腺中，免疫组织化学显示DACH1主要位于基底细胞，这增加了DACH1对TGF-β信号传导同时发挥细胞自主和非自主作用的可能性。

其他几个基因对正常乳腺导管发育至关重要，包括高级服务1，斯里布、和卵子2，并且在缺乏的小鼠中青春期分支发育被破坏高，胰岛素样生长因子1(免疫球蛋白1)，或雌激素受体α(高级服务1). DACH1可抑制IGF1和ERα信号传导抑制EMT(DeAngelis等人。，2011，波波夫等人。，2009，Wu等人。，2011)可能导致乳腺发育变化第1天^−/−老鼠。

免疫组织化学、免疫荧光和TUNEL染色

使用多克隆DACH1抗体（Proteintech，目录号10914-1-AP）对石蜡包埋的小鼠乳腺组织进行免疫组织化学分析(Wu等人。，2006)、抗PYGO2（Thermo Fisher Scientific，分类号PA5-34878）、抗PML1（Abcam，分类号ab67761）、抗GATA3（Santa Cruz Biotechnology，分类号sc-9009）、抗vWF（A0082，Dako）、抗磷酸化SMAD2/3使用抗Ki-67克隆SP6兔单克隆抗体（Abcam，目录号ab16667）、抗CK5抗体（PRB-160P，Covance）、兔多克隆和/或抗CK8小鼠单克隆抗体（MMS-1622P，Covance）进行冷冻小鼠乳腺的免疫荧光分析。DAPI用作反染色。使用Alexa Fluor 633或Alexa Fluor 565缀合的山羊抗兔抗体和Alexa Fluor 488缀合的山羊抗小鼠抗体作为二级抗体(Jiao等人。，2008，Ju等人。，2013). 小鼠乳腺组织冰冻切片用于免疫荧光TUNEL染色。LA-7细胞免疫荧光中使用了小鼠E-cadherin-FITC偶联物（BD Bioscience，猫号612131）、兔细胞角蛋白14（Sigma猫号HAPA023040）和山羊抗兔IGG Alexa Fluor 488二级抗体（Life Technologies，猫号A11034）。

细胞培养、试剂、哺乳动物试验、表达载体、DNA转染和统计分析

3T3和小鼠胚胎成纤维细胞的产生与培养第1天^−/−小鼠，Met-1乳腺癌细胞系(Wu等人。，2008，Wu等人。，2011)和LA-7大鼠乳腺干细胞(Zucchi等人。，2007)如前所述(Wu等人。，2008，Wu等人。，2011). TGF-β从Calbiochem中获得。Met-1细胞感染MSCV-IRES-GFP（小鼠干细胞病毒）或MSCV-DACH1-IRES-GFF(Wu等人。，2006). 根据制造商的方案，用Amaxa系统（Amaxa Nucleofector Kit，Lonza）瞬时转染LA7细胞。1 × 10⁶用2μg的每个质粒（GFP-empty、pKW-empty和pKW-DACH1）转化LA7细胞。GFP质粒作为转染的内源性控制。数据表示为平均值±SEM。使用Student t检验进行统计分析，p值<0.05。

三维培养中的小管和器官形成

对于小管/类器官的形成，将细胞悬浮在按上述方法制备的大鼠尾源性胶原蛋白中的冰上(Zucchi等人。，2007). 每天用光学显微镜检查类器官培养物，以评估小管和类器官的形成，并在第7、14和20天拍照。通过在3个独立的实验中检查每种情况下的10个小管，在播种后3天评估分枝。

IP和Western Blot

如图所示，在细胞中进行IP和western blot分析。对于每个IP，将1 mL裂解液（1 mg蛋白质）和2μg抗SMAD2/3（BD，目录号610843）或抗SARA（Proteintech，目录号14821-1-AP）在4°C下培养过夜。免疫沉淀物在IP缓冲液中洗涤5次，并将30μL 2×样品缓冲液添加到珠粒中。层粘连蛋白B1抗体（Abcam，cat.no.ab16048）被用作核蛋白丰度的内部控制，而vinculin（Sigma，cat.no.V9131）被用作细胞质部分富集的控制。LA-7细胞Western-blot中使用了多克隆抗β-酪蛋白（Santa Cruz，猫号SC-30042）、单克隆抗CD44（Santa Cruz猫号SC-53068）和多克隆抗贝塔肌动蛋白（Santa-Cruz，猫编号SC-1615）。

干细胞的FACS分析

乳腺上皮干细胞的FACS分析如先前出版物中所述进行(dos Santos等人。，2013，Jiao等人。，2016，Shackleton等人。，2006). 简言之，12周龄的婴儿乳腺被切除第1天^{飞行/飞行}俄罗斯26^{克里特2/mTmG}和第1天^{重量/重量}俄罗斯26^{克里特2/mTmG}老鼠。当小鼠达到6周龄时，对这两种小鼠进行为期5天的三苯氧胺脉冲治疗，并在随后的2.5个月后进行分析。使用FlowJo单细胞分析软件（Tree Star、Ashland、OR）对数据进行分析。

这项工作得到了R01CA132115（R.G.P.）的部分支持，这是拉尔夫和玛丽安·福尔克医学研究信托基金会（R.G.P.）的慷慨资助，也是乳腺癌研究基金会的资助。本部门不承担任何分析、解释或结论的责任。R.G.P.持有生物制药公司ProstaGene和LightSeed的所有者权益，担任CSO/创始人，是CytoDyn的首席营销官。R.G.P.持有多份已发布和提交的专利申请的所有权权益（价值未知）。这项工作也得到了CNR-Flag项目Epigen和Interomics（到I.Z）的支持。M.F.由Sigrid Jusélius基金会、猎户座研究基金会和芬兰皮肤病学会支持。KW.由国家自然科学基金资助，编号81572608和81874120。