c-Jun的破坏通过抑制c-Src和ROCK II激酶的过度激活减少细胞迁移和侵袭

细胞培养、病毒生产和报告基因检测

逆转录病毒载体从MSCV载体的内部核糖体进入位点（IRES）引导绿色荧光蛋白（GFP）的表达，并从MSCV启动子引导Cre重组酶或GFP的表达。如前所述，产生了重组逆转录病毒(锂等。2006年b). MSCV逆转录病毒通过与辅助病毒瞬时共转染293T细胞，使用磷酸钙沉淀制备。转染48小时后收集逆转录病毒上清液，并通过0.45μm过滤器过滤。c-jun公司^{飞行/飞行}将3T3细胞与新鲜逆转录病毒上清液在8μg/ml聚brene存在下培养24 h，再培养4 d，并进行荧光激活细胞分选（FACS；FACStar Plus；BD Biosciences，San Jose，CA），以选择表达GFP的细胞。c-jun公司^{飞行/飞行}随后亚克隆表达MSCV-IREF-GFP或MSCV-Cre-IRES-GFP的3T3细胞。每个品系至少有三个单独的菌落进行分析。细胞保存在补充有5%FBS、100μg/ml青霉素和链霉素的DMEM中，并在5%CO中培养₂37°C时。对于c-Jun救援实验，c-jun公司^−/−如上所述，用乙醚MSCV-c-Jun-DsRed或其对照载体感染3T3细胞。具有红色荧光的细胞通过FACS进行分类，然后用于分析。使用Olympus IX显微镜（纽约州梅尔维尔）的10倍物镜进行荧光相控成像。

使用1.9-kb小鼠c-Src野生型（wt）和AP-1点突变荧光素酶报告基因进行荧光素瘤报告基因分析(熊谷等。, 2004). 荧光素酶活性是使用共转染的β-半乳糖苷酶报告基因在转染效率正常化后测定的(卡蒂亚尔等。, 2007).

原代乳腺上皮细胞（MEC）培养基于参考(沃尔夫等。, 2004)经过修改。8至12周龄处女小鼠的乳腺通过切割分离，然后在MEC培养基中用0.4 mg/ml胶原酶消化（含10%FBS的火腿F12，1×MEM非必需氨基酸，100μg/ml青霉素和链霉素，50μg/ml庆大霉素，4μg/ml胰岛素，1μg/ml氢化可的松，10 ng/ml EGF，10 ng/ml霍乱毒素）5%CO中₂在37°C下放置18 h。通过上下移液管将消化后的材料均匀化，然后用50μg/ml庆大霉素的PBS清洗三次。将颗粒重新悬浮在MEC培养基中的10 cm平板中，然后培养4 h以去除成纤维细胞。根据实验要求，将悬浮液分为几个板。培养3-5天后，用乙醚控制腺病毒或腺核心蛋白1（2×10⁸PFU/ml）培养24小时，用新鲜MEC培养基洗涤，然后继续培养4天。

磷脂染色、定量和细胞直径评估

如前所述进行了磷脂酶染色(纽梅斯特等。, 2003). 利用乙醚共聚焦显微镜或FACS分析进行了指骨样蛋白染色和定量的图像。收集初级转导3T3细胞的克隆并在PBS中洗涤。细胞颗粒用4%多聚甲醛固定，并用0.05%NP-40渗透。在PBS洗涤之后，用罗丹明鬼笔肽和DAPI对细胞进行染色。使用Multisizer 3仪器（佛罗里达州迈阿密Beckman Coulter）评估细胞直径。

Western印迹和RT-PCR

通过10%SDS（SDS-PAGE）分离全细胞裂解物（60μg），并将蛋白质转移到硝化纤维膜上进行蛋白质印迹，如前所述(锂等。2006年b). 如前所述，蛋白质印迹用于评估在环己酰亚胺存在下的蛋白质稳定性(锂等。，2006年a). mRNA丰度通过RT-PCR使用直接引物测定，引物指向从Qiagen订购的小鼠c-Src mRNA（Chatsworth，CA；QT00103691，Mm_Src_1_SG QuantiTect Primer Assay）。使用从Qiagen（QT01036875，Mm_Rn18s_2_SG QuantiTect primer Assay）定向至18S mRNA的引物作为对照。

细胞迁移分析

将细胞接种在12孔板中24小时后，再放置在显微镜上的培养箱中，以保持37°C和CO的温度₂5%。使用尼康Eclipse TE-300倒置显微镜系统每隔5分钟拍摄细胞运动视频（纽约州梅尔维尔）。细胞移动速度是通过使用MetaMorph软件（宾夕法尼亚州唐宁镇的Molecular Devices）在不同时间点追踪单个细胞来确定的。为了观察ROCK或c-Src抑制的效果，在延时记录之前和期间用10μM Y27632或2μM SU6656（钙生物化学）处理细胞30分钟。使用Transwell室进行Transwell迁移分析，并在细胞迁移处理3小时后对细胞进行计数(锂等。2006年b).

通过伤口愈合试验评估MEC的迁移。细胞在六孔板上生长汇合，单层细胞用P10微移液管尖端损伤。受伤后立即更换MEC培养基。使用尼康Eclipse TE-300倒置显微镜系统（纽约州梅尔维尔）每隔20分钟拍摄一次伤口愈合视频，持续24小时。细胞的运动速度也通过MetaMorph来确定。

免疫荧光

c-jun公司^{飞行/飞行}和c-jun公司^−/−3T3细胞在四孔培养箱中生长，玻片在室温下用4%多聚甲醛在PBS中固定20分钟。用PBS冲洗载玻片，并用0.05%NP-40在PBS中渗透。使用的主要抗体是小鼠单克隆抗帕西林（克隆5H11；Upstate Biotechnology；1/100）和兔多克隆抗磷酸帕西林。使用的二级抗体是Alexa Fluor 633–共轭F（ab'）₂山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG；分子探针，尤金，OR；1/250）和罗丹明红X结合山羊抗兔IgG片段（Jackson ImmunoResearch Laboratories；1/50）。荧光共焦成像是通过奥林巴斯IX70激光共焦显微镜（乔治敦大学）的60倍物镜或蔡司LSM510/META激光共焦显微（托马斯杰斐逊大学）的63倍物镜获得的。使用MetaMorph（分子器件）处理图像。

干涉反射显微镜

使用配备60×/1.4 NA浸油透镜的Olympus Fluoview FV300激光扫描显微镜采集干涉反射显微镜（IRM）图像。将细胞培养在底部贴有1.5号盖玻片的培养皿上，然后转移到完全培养基中的加热阶段（37°C），加入10 mM HEPES，pH 7.4，以保持恒定pH(锂等。2006年b). 样品用488-nm氩激光照射，在没有发射滤光片的情况下从通道2收集反射光图像。在实时成像过程中，干扰模式或“闪烁”会发生快速和局部变化。为了更好地可视化长寿命的病灶粘连形成及其数量和形状随时间（分钟）发生的变化，图像随时间（秒）平均，以消除短期波动。病灶粘连表现为黑色条纹，而紧密接触或膜距离越大则越轻。在更远的距离上，细胞接触的证据并不明显。使用MetaMorph跟踪每个局灶性粘连，并基于局灶性粘连存在的框架计算局灶性粘连的寿命。

荧光明胶降解试验

AlexaFluor-568–在三份盖玻片上进行共轭明胶基质降解实验，每个盖玻片至少分析25个区域（至少100个细胞，每个实验至少重复三次）。对明亮的荧光明胶基质上的黑点进行阈值处理。对于每个字段（0.01 mm²)，退化区的面积（μm²)细胞面积（μm²; 计算每个视野下每个细胞面积降解区的总面积。基质降解被报告为每个细胞区域的降解面积。

岩石活性测定

Rho-相关蛋白激酶（ROCK）活性由Cclex Co.（日本长野）的Rho-激酶检测试剂盒根据制造商的方案进行评估。本试剂盒中使用的磷酸特异性单克隆抗体识别MBS/MYPT1中的磷酸-三氢嘌呤697残基，该残基被ROCK磷酸化。对于每个样品，使用10μl 1 mg/ml细胞裂解液。从总吸光度中减去从ROCK抑制剂（Y27632）处理的裂解液中获得的吸光度值，以排除其他激酶的影响。

c-Src激酶活性测定

通过结合免疫沉淀（IP）活性Src试剂盒（Calbiochem）和HTScan Src激酶检测试剂盒（Cell Signaling，Beverly，MA）评估c-Src蛋白激酶活性。根据制造商手册，使用IP活性Src试剂盒对细胞裂解液（400μg蛋白质）中的c-Src进行免疫沉淀。根据制造商手册，使用HTScan Src激酶试剂盒测量免疫沉淀c-Src的激酶活性。

c-Jun控制帕西林酪氨酸31、118和丝氨酸178在焦点接触中的磷酸化

为了确定F-actin的增加是否与局部接触的增加有关，对局部接触进行了免疫组化。日冕视图c-jun公司重量和c-jun公司^−/−3T3细胞表现为扁平和扩散的形态c-jun公司^−/−单元格(图4A） ●●●●。帕西林的分布标志着焦点接触，证明了焦点接触在边缘的向心分布c-jun公司^−/−细胞。在高倍图像中，在F-actin电缆的远端发现了焦点接触(图4B） ●●●●。使用FAK和磷酸化帕西林作为焦点接触的标记物，对焦点接触进行分析(图5). 与先前的研究一致，3T3细胞显示出胞浆paxillin的弥散分布，FAK测定细胞极性端的焦点接触相对较少(图5A） 以及通过酪氨酸磷酸化帕西林与帕西林的共修饰(图5B） ●●●●。相比之下c-jun公司^−/−细胞与FAK的局部接触增加(图5A） 和酪氨酸磷酸化的paxillin，形成多个外围组织的小焦点接触，分布在细胞周围(图5B） ●●●●。c-Src和FAK之间的关联导致c-Src活化以及与帕罗西汀的顺序关联(Brown和Turner，2004年;施莱普费尔等。, 2004). 除了允许向焦点接触物募集多种结合蛋白外，帕西林在特定酪氨酸和丝氨酸残基处被磷酸化，以响应生长因子和细胞因子以及c-Src的结合。使用针对特定帕西林磷酸化位点的磷酸特异性抗体进行共聚焦显微镜检查，以研究细胞外信号通路的改变c-jun公司^−/−单元格(Brown和Turner，2004年). 活化的c-Src和FAK诱导酪氨酸残基118和残基31处的酪氨酸磷酸化。观察到多个向心分布的酪氨酸118磷酸化灶c-jun公司^−/−单元格(图5B） ●●●●。FAK的粘附诱导磷酸化在氨基酸残基31处诱导帕西林酪氨酸磷酸化。野生型3T3细胞在Y31时几乎没有帕西林活化。然而，在局部接触中观察到磷酸化增加c-jun公司^−/−单元格(图5C） ●●●●。帕西林的丝氨酸178是JNK磷酸化的底物。丝氨酸178处的paxillin磷酸化增加见于c-jun公司^−/−单元格(图5D） ●●●●。因此，c-jun公司^−/−细胞显示paxillin磷酸化过度激活，磷酸化的paxillin位于与F-actin应激纤维形成增加相关的周向。

在单独的窗口中打开

图4。

c-jun切除诱导F-actin尖端的paxillin形成。（A） F-actin和paxillin染色的细胞冠状切片显示c-jun公司^−/−含有帕西林的细胞标记着整个细胞基底的焦点接触，（B）可见围绕细胞周长向心分布。

在单独的窗口中打开

图5。

c-jun切除导致大的病灶接触呈向心分布。（A）c-jun公司^{飞行/飞行}用对照载体GFP或Cre表达载体（pMSCV-Cre-IRES-GFP）转导3T3细胞。对FAK（A）、（B–D）帕西林和磷酸帕西林Y118（B）、Y31（C）和S178（D）进行免疫染色。在每个序列的第四张图像中放大帕罗西林和磷酸帕罗西琳的合并图像。注意细胞外围形成大的焦点接触，在D中注意磷酸化帕西林（丝氨酸118）的核周分布。

病灶粘连c-jun公司^−/−细胞较大。大的局灶性粘连通常不会发生快速转换，倾向于被动参与锚定，而快速移动的细胞通常不会形成局灶性黏连(贝宁戈等。, 2001). 鉴于c-jun公司^−/−细胞，我们通过使用IRM和延时视频显微镜检查细胞与其基质的相对接触来评估局灶粘附稳定性。IRM测量细胞与其基质的位置接近性。细胞与其基质之间的接触区域，如局灶性粘连，显示为深色结构。细胞中相对不太近的区域呈现出从灰色到白色的渐变(纽梅斯特等。, 2003). 细胞与其基质之间接触点的数量和表面积在c-jun公司^−/−0分钟时的电池(图6A） ●●●●。通过IRM获得细胞的连续图像，以确定病灶粘附的稳定性(锂等。2006年b). 通过视频显微镜分析焦点粘附动力学，以确定焦点粘附的稳定性。3T3 wt控制单元中的焦点触点快速翻转。相反，局部粘连在c-jun公司^−/−细胞，在c-jun公司^−/−单元格(图6B） ●●●●。局部粘连的周转率与细胞运动有关。快速重塑的病灶接触与细胞迁移率的提高有关。为了确定c-Jun是否调节焦接触转换率，如前所述进行了定量视频显微镜研究(斯迈列诺夫等。, 1999;任等。, 2000). 焦点触点的平均寿命c-jun公司^{飞行/飞行}细胞为～10分钟，而c-jun公司^−/−细胞为～45分钟(图6、C和D）。因此，局部粘连的周转率与细胞运动相关(图2). 快速重塑的局灶性粘连与细胞迁移率增加有关，而c-Jun的丢失增加了其寿命并减缓了迁移。

在单独的窗口中打开

图6。

c-Jun调节细胞粘附稳定性。（A） 使用时间推移显微镜进行的干涉折射显微镜来监测焦点接触的稳定性。在B中，c-Jun的缺失导致在高倍镜下观察到大范围稳定的焦点接触材料和方法.

c-Jun抑制ROCK II

F-actin形成增加，如c-jun公司^−/−细胞，观察到ROCK II和Rho活性增加(天野之弥等。, 1997). 众所周知，ROCK可以激活JNK。当JNK在丝氨酸178磷酸化帕罗西汀时c-jun公司^−/−细胞还增加了ROCK活性增加的可能性c-jun公司^−/−细胞。我们对跨阱细胞迁移的研究表明c-jun公司^−/−c-Jun再导入诱导细胞迁移。细胞迁移包括迁移速度和迁移方向的持续性等几个组成部分。为了进一步研究c-Jun调控迁移的机制，我们使用延时视频显微镜来表征细胞迁移中的缺陷c-jun公司^−/−细胞。c-jun公司^−/−细胞迁移速度下降40%（p<0.05）；图7、A和B）。添加ROCK II激酶抑制剂Y27632消除了c-Jun表达和c-jun公司^−/−细胞，表明ROCK II激酶过度活性导致了细胞迁移速度的缺陷。抑制3T3细胞的ROCK II激酶增加了迁移速度，这与ROCKⅡ在3T3电池基础迁移速度中的已知作用一致(图7B） ●●●●。确认ROCK II激酶活性在失去c-jun公司在重新引入c-jun公司中评估了c-Jun对ROCK II激酶活性的影响c-jun公司^−/−以肌球蛋白磷酸酶的肌球蛋白结合亚单位为底物的细胞。ROCK II激酶活性在c-jun公司^−/−单元格(图7C） ●●●●。c-Jun再导入到生理水平恢复了ROCK II活性(图7C） ●●●●。作为对ROCK II活性的额外分析，测定了ROCKⅡ底物辅酶filin的磷酸化。肌动蛋白解聚蛋白cofilin被ROCK和LIM激酶磷酸化，抑制其肌动蛋白的解聚活性，从而稳定肌动蛋白应激纤维。与ROCK II激酶活性的增加一致，cofilin的磷酸化在c-jun公司^−/−单元格(图7D） ●●●●。确定增加的应力纤维形成是否c-jun公司^−/−细胞部分依赖于ROCK过度激活，进行了阴茎倍体染色(图7E） ●●●●。c-6月^−/−细胞显示应力纤维形成增加。在五倍放大的情况下可以更清楚地看到，与蛋白共染色在F-肌动蛋白索的向心端发现了局灶性粘连（下图，图7E） 。添加ROCK抑制剂Y27632对wt细胞中的鬼臼蛋白分布几乎没有影响，但减少了wt细胞内应力纤维和含paxillin的局灶性粘连的出现c-jun公司^−/−(图7E） 。这些发现与过度活化的ROCK在c-jun公司^−/−细胞。

在单独的窗口中打开

图7。

c-Jun对细胞速度的诱导涉及ROCK激酶。（A） 用视频显微镜测定细胞速度。（B）c-jun公司^−/−与c-jun公司^{飞行/飞行}细胞，用ROCK激酶抑制剂（Y27632，10μM）处理后可恢复～25%。（C） 删除C-Jun后，ROCK活性增加（p<0.05）。c-Jun的再导入抑制ROCK活性c-jun公司^{飞行/飞行}单元格（D）。磷酸化cofilin的Western blot分析，这是一种用FAK作为负荷控制的ROCK激活标记。（E） 载体或10μM Y27632处理的（600×）和（3000×）细胞的磷脂酶染色。

c-Jun诱导细胞侵袭和c-Src表达

侵袭性细胞延伸足爪突并侵袭细胞外基质。与这种突起活动相关的基质降解的丰富程度与侵袭潜能相关。可以通过细胞外基质降解来评估入侵病(波登等。, 2001). 使用与ECM底物（明胶；AlexFluor 568）偶联的AlexFlu 568评估3T3细胞蛋白水解明胶基质的能力。基质降解证明了入侵虫的存在，导致暗区和荧光(图8A） ●●●●。删除c-jun公司80%的ECM底物被入侵昆虫降解(图8B） ●●●●。

在单独的窗口中打开

图8。

c-Jun诱导侵袭涉及ROCK激酶。（A） 对c-jun公司^{飞行/飞行}存在GFP或Cre+GFP的3T3细胞。指示活动入侵昆虫的孔洞以黑色显示。用对照组或ROCK激酶抑制剂Y27632处理细胞12小时。白色框内区域左下方各面板插图中放大了顶部系列面板。（B） c-jun公司^{飞行/飞行}或c-jun公司^−/−对细胞的孔洞数量进行评估。数据是n>20个独立框架的平均值±SEM。c-Jun缺失可减少隐窝（p<0.05）。使用Y27632治疗会增加c-jun公司^−/−细胞数量增加了三倍（p<0.05）。（C） 在Boyden室中进行的Transwell侵入试验显示出与B中相似的结果。

下一步评估了ROCK II在隐孢子虫形成中的作用(图8A） ●●●●。经v-Src转化的乳腺癌细胞株MDA-MB-231增加了侵袭性抗体的活性（数据未显示）。用ROCK抑制剂处理的3T3细胞减少了侵袭性，但这种减少在统计学上并不显著。与c-Jun对ROCK激酶的抑制促进了入侵足的模型一致，c-jun公司^−/−用ROCK抑制剂处理的细胞使侵入体形成增加了三倍(图8B） ●●●●。要确定c-jun公司和c-jun公司–介导ROCK II激酶在跨膜迁移中的阻遏，在Boyden室中进行跨阱迁移分析(图8C） ●●●●。ROCK II抑制剂并没有完全恢复细胞侵袭性，这表明ROCKⅡ也参与了非依赖性途径。总之，这些研究表明c-Jun的丰度调节ROCK II的活性。ROCK II活性增加c-jun公司^−/−细胞有助于减少细胞迁移和减少细胞侵袭。

我们感谢M.Karin博士提供的质粒和有用的建议，以及Almeta Mathis在准备手稿时提供的帮助。这项工作得到了拨款R01CA70896、R01CA75503和R01CA86072（R.G.P.）的部分支持。Kimmel癌症中心由美国国立卫生研究院（NIH）癌症中心核心拨款P30CA56036（R.G.P.）支持，此前Lombardi综合癌症中心由NIH综合癌症中心核心赠款CA51008-13（R.G.P）支持。该项目的部分资金来自Ralph博士和Marian C.Falk医学研究信托基金以及宾夕法尼亚州卫生部（R.G.P.）的拨款。本部门明确否认对任何分析、解释或结论负责。