癌症研究。作者手稿；PMC 2014年7月15日发布。
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EYA1磷酸酶功能通过细胞周期蛋白D1促进乳腺癌细胞增殖
,1,2,* ,1,三 ,1,2 ,1 ,1,2 ,1 ,三 ,4 ,4 ,1,2和1,2,*
吴孔明博士
1托马斯·杰斐逊大学癌症生物学系，Bluemle生命科学大厦，233 South 10第宾夕法尼亚州费城街，邮编：19107
2托马斯·杰斐逊大学Kimmel癌症中心，Bluemle生命科学大楼，233 South 10第宾夕法尼亚州费城街，邮编19107
李兆明
1托马斯·杰斐逊大学癌症生物学系，Bluemle生命科学大厦，233 South 10第宾夕法尼亚州费城街，邮编：19107
三中国上海市四平路1239号华中科技大学同济医学院同济医院
蔡绍兴
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Lifeng Tian公司
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柯晨
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王晶
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胡俊波
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叶荪
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薛莉
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亚当·埃特尔
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理查德·佩塞尔
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三中国上海市四平路1239号华中科技大学同济医学院同济医院
4马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院波士顿儿童医院02115
*通讯作者：Richard G.Pestell，托马斯杰斐逊大学Kimmel癌症中心，233 South 10第宾夕法尼亚州费城街，邮编：19107，电话：215-503-5692，传真：215-50.3-9334。吴孔明，托马斯·杰斐逊大学Kimmel癌症中心，233 South 10第宾夕法尼亚州费城街，19107，电话：215-503-9278
- 补充资料
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2
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三。
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4
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摘要
这个果蝇眼睛无同源基因1（EYA1）是视网膜决定基因网络（RDGN）的组成部分，用作H2AX磷酸酶。这个细胞周期蛋白D1该基因编码一种全酶的调节亚单位，该酶磷酸化pRb蛋白并使其失活。其中，与正常乳腺相比，EYA1在管腔B型乳腺癌亚型中过度表达cyclin D1。EYA1促进小鼠乳腺癌生长体内需要磷酸酶结构域。EYA1促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，诱导接触依赖性生长和细胞周期蛋白D1丰度。细胞增殖和细胞周期蛋白D1丰度的诱导，而非凋亡，依赖于EYA1磷酸酶结构域。EYA1介导的细胞周期蛋白D1转录诱导通过AP-1结合位点发生在−953，需要EYA1磷酸酶功能。AP-1突变不影响细胞周期蛋白D1的SIX1依赖性激活。EYA1在局部染色质的背景下被招募到细胞周期蛋白D1 AP-1位点。EYA1磷酸酶功能决定了CBP、RNA聚合酶II和H3K9在细胞周期蛋白D1局部染色质背景下的基因AP-1位点调控区。EYA1磷酸酶通过细胞周期蛋白D1启动子处转录复合物的形成调节细胞周期控制。
介绍
这个果蝇眼睛缺失同源物1（EYA1）是参与生物体发育的视网膜决定基因网络（RDGN）的一个组成部分(1,2). 细胞命运决定基因网络包括腊肠（dac）、双眼睛（玩具）、无眼（eya）、茶衫（tsh）和无眼（So）。在果蝇属RDGN的突变导致眼球形成失败，而强迫表达则导致异位眼球形成。EYA在局部染色质的背景下作为转录共激活物发挥作用，但缺乏固有的DNA结合活性。EYA家族成员EYA 1–4由275个氨基酸的羧基末端基序定义，该基序在物种间保守，称为EYA结构域（ED）。人类同源物EYA 1–4在其EYA结构域和氨基末端高度保守，除了一个名为EYA域II的富含酪氨酸的小残基区域(三).
在多种恶性肿瘤中，RDGN的表达或功能活性发生改变。乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌和脑癌中DACH1表达降低(4–6). EYA2在卵巢癌中上调，促进肿瘤生长(7). EYA1和EYA2提高HEK293细胞对DNA损伤因子的存活率(8). Six1/TGF需要Eya2β控制前转移表型和上皮-间质转化（EMT）的信号(9). 虽然EYA蛋白在人类乳腺癌中表达，但其与分子遗传亚型、预后以及控制接触诱导依赖性生长的分子机制的关系尚不清楚。
以前的研究已经证明了RDGN和细胞周期控制蛋白之间的功能性相互作用(2,6). DACH1蛋白通过IL-8的转录抑制抑制乳腺癌细胞转移(10). 内源性DACH1表达通过与Nanog和SOX2基因的启动子调控区结合而抑制乳腺肿瘤起始细胞（BTIC）(11). DACH1还显示通过抑制细胞周期蛋白D1抑制乳腺癌细胞增殖(6). 这个细胞周期蛋白D1基因编码一种全酶的调节亚单位，该酶磷酸化pRb蛋白并使其失活，从而促进细胞周期的DNA合成阶段。HER2阳性细胞维持HER2阳性乳腺癌肿瘤生长需要cyclin D1(12).
目前的研究是为了确定EYA1促进乳腺癌细胞生长的分子机制。其中，2154例乳腺癌样本中EYA1的表达在管腔B型乳腺癌的表达中显示出cyclin D1的富集。EYA1诱导需要其磷酸酶功能的乳腺癌细胞株的接触依赖性生长。EYA1通过其磷酸酶功能诱导细胞周期蛋白D1表达，并被招募到细胞周期蛋白D_1启动子AP-1位点。EYA1磷酸酶功能决定了细胞周期蛋白D1转录的诱导、局部组蛋白乙酰化和细胞周期蛋白D_1启动子调控区的共激活物募集。
材料和方法
细胞培养
人类胚胎肾293T（HEK 293T）和乳腺癌细胞系保存在SKBR3（McCoy’s 5A）、BT-474和T47D（RPMI1640）以及含有1%青霉素/链霉素并补充10%FBS的MDA-MB-231、MDA-MB-453、HBL100、HS578T和MCF-7（DMEM）中。
质粒和shRNA
将EYA1 WT和EYA1 D327A磷酸酶突变体的小鼠cDNA克隆到p3×FLAG-CMV-10（Sigma-Aldrich）载体中进行瞬时转染检测，并克隆到pCDF慢病毒表达载体中建立稳定的细胞系。人类细胞周期蛋白D1启动子萤光素酶报告基因先前曾被描述(13). EYA1的shRNAs从Open biosystem购买，使用靶序列CCCACAAAAGAAATAGATGAT和CGACGGGTTTAAACAATTT。
转染、基因报告检测和EYA1稳定细胞系
如前所述进行DNA转染和荧光素酶分析。简单地说，在转染前一天，细胞以25%的汇合点接种在24孔板中。通过HEK293T的磷酸钙沉淀或剩余细胞系的Lipofectamine 2000（Invitrogen），将报告者（0.5μg/孔）、表达载体（计算为摩尔浓度等于300 ng控制载体）和控制载体（300 ng/孔）的适当组合瞬时转染细胞，根据制造商的说明。转染24小时后，如前所述，使用Autolumat LB 953（EG&G Berthold）在室温下进行荧光素酶分析。通过瞬时共转染表达EYA1或EYA1 D327A的质粒DNA，或通过磷酸钙沉淀法将载体和包装质粒制备慢病毒。转染48小时后收集慢病毒上清液，并通过0.45μm过滤器过滤。将人乳腺癌细胞系细胞与慢病毒上清液在8mg/ml聚布伦存在下孵育24小时，再培养48小时，并进行荧光激活细胞分选（FACS）（FACStarPlus；BD Biosciences）以选择表达GFP的细胞。GFP阳性细胞用于随后的分析。之前描述了细胞周期蛋白D1启动子突变荧光素酶报告基因(14). 位于−953 TGACTCAT TTT的细胞周期蛋白D1 AP-1位点突变为TGgCgCAT TTT。
西部印记
对于Western blot分析，细胞在添加了蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液（50 mM Hepes，pH 7.2，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM-EGTA，1 mmM DTT，0.1%Triton X100）中造粒并溶解。用于免疫沉淀和Western blot的抗体如下：抗FLAG（M2克隆，Sigma）、抗EYA1（ab85009，Abcam），来自Santa Cruz Biotechnology的抗体为cyclin D1（sc-20044）、cyclin E1（sc-481）、CDC25B（sc-5619）、，β-catenin（sc-7963），p27（sc-7767），β-肌动蛋白（sc-47778）和β-微管蛋白（sc-9104）。对于cyclin D1降解试验，用50 ug/ml环己酰亚胺（CHX）处理EYA1 wt或突变稳定细胞系（SKBR3或MDA-MB-453），并在顺序时间点（15、30、60、90、120分钟）收集总蛋白，以进行Western blot分析。
ChIP分析
按照之前描述的方案进行ChIP分析(15). 根据制造商指南，使用ChIP检测试剂盒（Upstate Chemicon）制备稳定表达3xFLAG-EYA1或EYA1 D327A的MDA-MB-453细胞或对照载体。使用30μL带有特定抗体的琼脂在4°C搅拌下沉淀染色质溶液过夜。对于阴性对照，通过将上清液部分在4°C下旋转培养1 h，免疫沉淀小鼠IgG。用PCR分析沉淀的DNA。所用的人细胞周期蛋白D1启动子特异性引物如下：AP-1位点：5′-GGCAGGGGACTAATATTCCAGCA-3′和5′-GAATGAGAACAGTGACTCC-3′。作为阴性对照位点的引物为5′-TTCGGAAGCGTTTTCCC-3′和5′-AGCGCGTCATTCAGGAA-3′。用于IP的抗体有：抗FLAG（M2克隆，Sigma）、抗CBP（sc-369，Santa Cruz）、抗乙酰组蛋白H3K9（07-352，Millipore）和抗Pol II（sc-9001，Santa Cruz）。
RT-PCR和定量PCR
按照制造商的说明，使用TriZol试剂（Invitrogen）制备总RNA。使用SuperScript II逆转录酶试剂盒（Invitrogen）对5微克总RNA进行逆转录以合成cDNA。25μL体积反应由1μL逆转录产物和每个引物的10 pM组成。EYA1亚型特异性RT-PCR引物对应外显子9-11(16)细胞周期蛋白D1的引物为：5′-GTGCTGGGACTTGGA-3′和5′-GCTTAGGTCCTGTCCGTT-3′，GAPDH的引物是：5′-GTGCTGCGAAGTGGAAAACC-3′和5’-ATCCAGTGGCGACGAT-3′，5′-ATCTTCCAGGAGCGACCC-3′及5′-TCCACAAATGTCATGG-3′。
哺乳动物层的形成和动物研究
如前所述进行哺乳动物层形成分析(17). 5-6周龄的雌性NOD-SCID小鼠从NCI-Frederick购买并保存在转基因小鼠设施中。每组10只小鼠皮下注射3×106MDA-MB-453细胞置于0.1 ml PBS中，含10%基质凝胶。连续8周每周监测两次肿瘤大小，并在实验结束时测量肿瘤重量。
细胞增殖和凋亡检测
对于3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑（MTT）检测，将感染PCDF、PCDF-Flag-EYA1或PCDF-Flag-EYA1D327A的细胞接种到正常生长培养基中的96个平板中，每天通过MTT检测细胞生长。为了测量生长曲线，将细胞接种到12孔板中，连续计数6至7天。Tritiated胸腺嘧啶掺入试验如前所述用于细胞增殖试验(6). 对于BrdU染色，细胞在常规培养基中用100 uM BrdU标记1小时，然后用PBS洗涤3次，在3.7%甲醛/PBS中固定10分钟，用4N HCL/1%Triton-X100处理10分钟，再用0.1%NP-40/PBS洗涤3次；在室温下与小鼠抗BrdU抗体（B8434，Sigma）以1:1000的比例孵育2小时，并在洗涤后以1:1000用山羊抗鼠AlexaFluor 568染色。通过BD FACScan分析10000个细胞。按照标准方案，使用BD Pharmingen PE Annexin V凋亡试剂盒检测凋亡细胞。
菌落形成分析
对于接触依赖性生长（软琼脂），细胞（4.0×10三)在完全生长培养基（覆盖在0.5%琼脂糖基上）中的2ml 0.3%琼脂糖（海菌斑）中一式三份。培养两周后，使用Omnicom 3600图像分析系统对直径>50μm的菌落进行计数。对于接触依赖增长，2.0×10三细胞在6孔板中，一式三份，置于2ml完全生长培养基中，放置2周。每4天更换一次培养基。在甲醇中用0.04%结晶紫染色1-2小时后，菌落可见。
公共乳腺癌微阵列数据集分析
乳腺癌微阵列数据集之前由公共存储库Gene Expression Omnibus和ArrayExpress编译而成，用于评估cyclin D1和EYA1的联合表达。该微阵列数据集包括102个健康乳腺和2152个乳腺肿瘤样本，肿瘤样本分为五个分子亚型，如前所述(15,18).
通过使用四象限2D-scatters图比较EYA1表达和CCND1 RNA表达，探讨了CCND1和EYA1在五种亚型中的关系。EYA1在健康乳腺中的表达集中在其中位数上，而CCND1的表达集中于其在所有乳腺样本中的中位数表达。在每种亚型中，样本在x=0和y=0左右的四个象限中的分布被量化，并使用齐方检验评估显著性。使用Kaplan-Meier曲线和Log-rank检验p值来评估四个象限之间联合表达谱的生存差异。
结果
内源性EYA维持乳腺癌细胞周期蛋白D1水平
人类乳腺癌细胞系的分子遗传亚型还包括Luminal A、Luminal B、Basal、ErbB2和claudin-low(19,20). 为了确定EYA1在乳腺癌细胞系中的相对丰度，检测了一系列乳腺癌细胞系，包括这些亚型的代表性实例。qRT-PCR引物对EYA1亚型具有特异性。与负荷对照组相比，claudin-low（MDA-MB-231和HS578T）、luminal B（BT-474）和ErbB2阳性（MDA-MB-453和SKBR3）细胞中EYA1的相对丰度较高(). MDA-MB-231细胞的基因表达谱被视为claudin-low亚型，MDA-MB-453和SKBR3被视为Her2亚型，BT-474被视为表达谱中的管腔B亚型(20,21). Western blot分析显示，蛋白质相对丰度的趋势与每个细胞系（插入，)(补充图1).
内源性EYA维持乳腺癌细胞生长和cyclin D1丰度A） 一系列乳腺癌细胞系中与GAPDH标准化的EYA1 mRNA水平的qRT-PCR分析。Inset是乳腺癌细胞系的相应Western blot，带有蛋白质负载控制β-肌动蛋白。B） EYA1 shRNA转导的MDA-MB-231细胞的氚化胸苷掺入，数据显示为3个单独实验的平均值±SEM。C） 用两种不同的shRNAs转导到EYA1的MDA-MB-231细胞的细胞增殖试验表明，无论是细胞数量还是D）MTT活性，数据显示为N等于5个单独实验的平均值±SEM。E） 使用EYA1 shRNA转导的MDA-MB-231和BT-474细胞，使用所示抗体进行Western blot分析，以了解细胞周期控制蛋白的相对丰度。F） 102例健康乳腺组织中EYA1和cyclin D1的正常表达。G） EYA1和cyclin D1在所有五种类型乳腺癌或（H）Luminal B亚型中的相对表达。一） Kaplan-Meier生存曲线分析，比较高cyclin D1/高EYA1（右上角）与所有其他乳腺癌。高EYA1/高cyclin D1乳腺癌的无复发生存率结果更差。
MDA-MB-231细胞中EYA1丰度的增加为使用shRNA确定EYA1的功能提供了机会。使用两个单独的shRNA，通过氚化胸腺嘧啶掺入评估的DNA合成减少了40%(). 通过细胞计数或MTT活性评估，细胞增殖减少~80%(). 我们研究了内源性EYA1在维持内源性细胞周期相关蛋白表达丰度中的作用。EYA1 shRNA降低了EYA1丰度约90%，但未改变MDA-MB-231和BT-474中的细胞周期蛋白E水平(). CDC25B丰度降低~25%。然而，cyclin D1丰度降低了约70%(). EYA1 shRNA降低EYA1和细胞周期蛋白D1 mRNA水平约90%(补充图2). 细胞周期蛋白D1丰度的减少和随后细胞增殖的减少与之前的报告一致，即G1/人乳腺癌细胞的S细胞周期转换和增殖依赖于细胞周期蛋白D1的丰度(22). 为了分析cyclin D1和EYA1在人类乳腺癌中的共同表达，我们收集了2152例乳腺肿瘤样本(15). 我们将样本分为五个分子亚型，包括Luminal A、Luminal B、Basal、Normal-like和Her2-过表达。与正常乳腺组织相比()和所有乳腺癌()在管腔B亚型中，cyclin D1和EYA1的共同表达显著增加(P（P）< 1 × 10−15;). Kaplan-Meier生存分析显示，cyclin D1和EYA1的联合表达对无复发生存时间有负面影响（p=0.035；). 在腔内B型乳腺癌患者中，单独使用Cyclin D1或EYA1均无显著的独立无复发生存意义。
EYA1磷酸酶结构域是诱导乳腺癌细胞接触依赖性生长所必需的
为了进一步研究EYA1在乳腺癌细胞增殖中的功能意义，用编码EYA1或磷酸酶缺陷突变体（EYA1 D327A）的慢病毒载体转导人BT-474、MDA-MB-453和SKBR3乳腺癌细胞系。用表达载体慢病毒转导BT-474细胞导致转导细胞的绿色荧光(). 通过细胞计数评估细胞增殖，EYA1显示细胞增殖增加40%(). 在磷酸酶缺陷型EYA1 D327A转导的细胞中未观察到增殖优势，与载体对照相比，转导细胞数量减少(). 接触依赖性生长中的菌落形成分析表明，依赖EYA1磷酸酶活性的菌落数量增加了3倍(). 软琼脂中的接触非依赖性生长显示EYA1对菌落数的诱导作用类似于3倍，这取决于磷酸酶结构域(). 通过MTT试验评估，人类MDA-MB-453乳腺癌细胞系的增殖也表现出类似的增加，而EYA1存在时，集落形成增加，EYA1磷酸酶结构域的突变降低了集落形成的增加(). 此外，在SKBR3乳腺癌细胞系中也观察到磷酸酶依赖性刺激细胞生长和集落形成(补充图3).
EYA1的磷酸酶功能是诱导接触依赖性乳腺肿瘤生长所必需的用编码EYA1或带有IRES-GFP的磷酸酶死亡突变体（EYA1 D327A）的表达载体转导的BT-474细胞通过计数、相差显微镜或B细胞增殖来评估，C）软琼脂中的生长或D）组织培养中接触依赖性生长的集落形成测定，其中显示的数据是每孔的集落数，作为五个单独实验的平均值±SEM。表达EYA1或EYA1 D327A的MDA-MB-453细胞通过E）相差显微镜进行评估，F）细胞增殖通过MTT分析进行评估，G）接触依赖培养中的菌落数或H）软琼脂中菌落数。数据显示为五个单独实验的平均值±SEM。
EYA1诱导的乳腺肿瘤集落形成、细胞增殖和乳腺增生需要细胞周期蛋白D1
为了确定EYA1诱导的细胞增殖是否需要细胞周期蛋白D1，用EYA1表达载体和shRNA将细胞转导到细胞周期蛋白D1或对照shRNA()与EYA1依赖性细胞增殖从10倍减少到4倍有关(). 此外，EYA1介导的克隆形成诱导被cyclin D1 shRNA阻断().
EYA1对乳腺癌细胞增殖和乳腺增生形成的诱导依赖于细胞周期蛋白D1A） 用EYA1表达载体和/或shRNA转导SKBR3细胞至细胞周期蛋白D1的Western blot。抗体直接作用于EYA1的FLAG表位或内源性细胞周期蛋白D1。B） 通过对表达EYA1的SKBR3细胞进行细胞计数来确定细胞增殖，无论是否有shRNA到细胞周期蛋白D1。分析还通过C）MTT试验进行，作为细胞增殖或D）集落形成试验的替代措施。E） 用EYA1或EYA1 D327A转导的细胞进行哺乳动物试验。显示了猛犸象球的数量。F） 将shRNA转导到细胞周期蛋白D1的细胞显示EYA1过度表达细胞中的乳腺球数量减少。
由于EYA1增加了SKBR3的菌落数量和大小，我们认为EYA1可能有助于提高BTIC。作为BTIC的替代品，我们进行了如上所述的乳腺检测(10,23)评估乳房球的数量和大小。EYA1的表达增强了乳腺数目，EYA1磷酸酶结构域的突变使其消失(). 细胞周期蛋白D1 shRNA减少了基础状态下形成的乳房球数量()，并完全废除EYA1介导的诱导乳房球形成().
在MDA-MB-453细胞中，cyclin D1 shRNA降低了EYA1诱导的cyclin D1丰度()并通过生长曲线、MTT试验或集落形成试验评估细胞增殖减少().
EYA诱导的MDA-MB-453细胞生长是细胞周期蛋白D1依赖性的使用对照或cyclin D1 shRNA.B）通过细胞计数或C）MTT分析确定的细胞生长分析，对过度表达EYA1的MDA-MB-453细胞进行Western blot。D） 使用对照或shCyclin D1在稳定表达EYA1的细胞中形成MDA-MB-453集落的典型示例。
EYA1诱导的DNA合成而非细胞凋亡依赖于EYA1磷酸酶结构域决定的生长能力
通过每日计数细胞数评估细胞生长，显示EYA1增强了增殖。EYA1磷酸酶缺陷突变体未能诱导细胞增殖，并显示细胞增殖降低(). 为了进一步区分EYA1对细胞凋亡和增殖的影响，进行了Annexin V染色和BrdU掺入。EYA1-wt和磷酸酶突变体均显著抑制细胞凋亡(); 然而，EYA1对DNA合成的刺激依赖于其磷酸酶活性(). 要测量体内将EYA1的生长促进功能、稳定表达EYA1的MDA-MB-453细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠中。根据肿瘤体积，EYA1显著增加MDA-MB-453肿瘤生长()和肿瘤重量(). EYA1磷酸酶缺陷突变体的稳定表达显示细胞生长减少体内按体积和肿瘤重量().
增强的DNA合成和肿瘤生长依赖于磷酸酶结构域A） 表达EYA1或磷酸酶突变体D327A的MDA-MB-453细胞的生长曲线显示为用B）膜联蛋白V阳性细胞的百分比或C）BrdU染色显示为平均值±SEM的电镀后的天数。D） 显示S期细胞比例的FACS示例。比较显示了表达EYA1 D327A突变的EYA1的细胞。E） 裸鼠乳腺肿瘤的大小与F）灭活肿瘤比较载体的比较与。EYA1或EYA1 D327A表达载体。G） 每个基因型（载体EYA1、EYA1 D237A）的N=10个单独肿瘤的肿瘤重量显示为平均值±SEM。
Eya诱导细胞周期蛋白D1需要Eya磷酸酶活性
鉴于EYA1介导的生长对细胞周期蛋白D1的需求，我们确定了EYA1诱导细胞周期蛋白D_1丰度的机制。进行Western blot分析。EYA1蛋白的氨基末端表位()被FLAG抗体识别，EYA1和EYA1 D327A的表达水平相似(). EYA1诱导细胞周期蛋白D1的相对丰度增加5倍，通过Western blot对EYA1蛋白相对丰度进行归一化后，磷酸酶结构域的突变使其减少（60%）。诱导细胞周期蛋白D1的相对丰度时，细胞周期蛋白A、p27的相对丰量没有变化基普1或β-连环蛋白(). 为了确定EYA1诱导细胞周期蛋白D1丰度的机制，分析了在蛋白合成抑制剂环己酰亚胺存在下细胞周期蛋白D_1的蛋白水平(). 通过多次实验的定量分析证实，当EYA1和对照空载体进行比较时，cyclin D1 mRNA稳定性的相对丰度没有发生显著变化(). EYA1将定量RT-PCR测定的细胞周期蛋白D1 mRNA丰度增加5倍(). EYA1对细胞周期蛋白D1 mRNA的诱导依赖于EYA1磷酸酶功能(). 在MDA-MB-453细胞中观察到类似的结果().
EYA1诱导细胞周期蛋白D1蛋白和mRNA丰度A） 用编码EYA1或EYA1 D327A的载体转导SKBR3细胞的Western blot。B） 经环己酰亚胺处理的EYA或载体对照SKBR3细胞的Western blot显示，EYA1增加了细胞周期蛋白D1的丰度。C） 环己酰亚胺处理后细胞周期蛋白D1蛋白水平的变化。数据为N=3的平均值±SEM。D） QT-PCR测定SKBR3稳定系中EYA1或cyclin D1的mRNA水平。E） mRNA定量显示为N=3个单独实验的平均值±SEM）。F） 表达EYA1或EYA1 D327A的MDA-MB-453细胞的Western blot表明，细胞周期蛋白D1丰度的诱导依赖于EYA磷酸酶结构域。G） 环己酰亚胺处理后的细胞周期蛋白D1蛋白水平，量化如H）所示，为N>3个单独实验的平均值±SEM。
EYA1通过位于−953的AP-1位点诱导细胞周期蛋白D1启动子，以磷脂酶依赖的方式招募协整因子
为了确定EYA1是否直接激活细胞周期蛋白D1启动子，进行了荧光素酶报告分析(). EYA1以磷酸酶依赖的方式诱导细胞周期蛋白D1启动子4倍。−953处AP-1位点的点突变降低了EYA1依赖性诱导(). 在果蝇属,艾娅和所以形成共同信号通路的一部分。已知Six1可诱导细胞周期蛋白D1启动子(28). 为了确定SIX1是否通过EYA1顺反应元件调节细胞周期蛋白D1启动子，在几种细胞类型中进行了联合转染实验(). 在HEK293细胞中，SIX1诱导细胞周期蛋白D1启动子；然而，在−953处EYA1应答AP-1位点的突变并不影响SIX1依赖性激活(). 在SKBR3和MDA-MB-453细胞系中还观察到EYA1在AP-1位点对细胞周期蛋白D1启动子的磷酸酯酶依赖性激活(). 这一发现表明，EYA1和SIX1通过不同的元件调节细胞周期蛋白D1启动子。然而，这些发现并不排除Six1在EYA1依赖性细胞增殖诱导中的潜在作用。染色质免疫沉淀分析（ChIP）证明EYA1在细胞周期蛋白D1启动子的CRE/AP-1位点的−953处被招募。EYA1的招募以磷酸酯酶依赖的方式发生(). 相反，位于−1500的阴性对照序列中没有EYA1的招募（数据未显示）。接下来，我们研究了EYA1在调节局部染色质背景下转录共调控因子招募中的潜在作用。EYA1的表达增强了CBP和RNA聚合酶II的招募()增加组蛋白3的乙酰化[H3K9]()与转录活性染色质一致().
EYA1通过AP-1位点诱导细胞周期蛋白D1启动子活性需要EYA1磷酸酶功能A） 转染EYA1或EYA1 D327A突变体的细胞中的细胞周期蛋白D1启动子报告活性（B）突变体报告子的相对诱导显示为N>5个单独实验的平均值±SEM。（C-E）荧光素酶报告子分析cyclin D1启动子片段，在HEK293中SIX1共转染表达载体存在下进行评估，在SKBR3（D）和MDA-MB-453（E）中EYA1或EYA1 D327A共转染载体存在下评估。数据为N=5分离转染的平均值±SEM。（F–H）用EYA1或EYA1 D327A转导的MDA-MB-453细胞的染色质免疫沉淀分析（ChIP）。EYA1（FLAG）、CBP、RNA聚合酶II或乙酰-H3K9的招募显示为3个单独实验的平均值±SEM。显示了向细胞周期蛋白D1 AP-1位点募集蛋白质的-倍变化。
讨论
目前的研究表明，EYA1在组织培养和体内.EYA1通过增加细胞增殖和DNA合成促进生长。EYA1对BT-474、SKBR3和MDA-MB-453细胞增殖的诱导依赖于磷酸酶功能和乳腺肿瘤生长的诱导体内需要磷酸酶结构域。EYA1还减少了Annexin V阳性细胞的凋亡；然而，EYA1对细胞凋亡的抑制不依赖于磷酸酶结构域。这些发现表明，EYA1通过磷酸酶依赖性和磷酸酶非依赖性机制促进乳腺肿瘤生长。这些研究与发育中肾脏的发现形成对比埃亚−/−凋亡增加与H2AX Ser139磷酸化增加相关的小鼠胚胎(8). H2AX的酪氨酸去磷酸化被认为在缺氧条件下或DNA损伤的情况下，通过H2AX羧基末端酪氨酸磷酸（Y142）的去磷酸化来调节细胞凋亡。EYA1效应依赖于ATM/ATR活性的增加。EYA1磷酸酶功能调节凋亡的能力可能取决于ATM/ATR活性和相对肿瘤缺氧。
为了确定EYA1促进乳腺癌细胞增殖的机制，我们认为cyclin基因是EYA1诱导乳腺癌细胞增生的潜在靶点。我们考虑了细胞周期的靶点，其中基因表达的诱导依赖于EYA1磷酸酶结构域。EYA1诱导了细胞周期蛋白D1的丰度，但没有诱导细胞周期蛋白E或CBC25A的丰满，这表明细胞周期蛋白D1是EYA1诱发细胞增殖的靶点。细胞周期蛋白D1 shRNA证明了EYA1依赖性乳腺癌细胞增殖中对细胞周期蛋白D1的需求。这些发现与cyclin D1反义降低ErbB2诱导的小鼠乳腺肿瘤发生的证据一致(24)发现MMTV-Ras或MMTV-ErbB2转基因的乳腺癌进展在细胞周期蛋白D1−/−老鼠(25). 然而，激活的β-连环蛋白或c-Myc致癌途径诱导乳腺肿瘤并不需要细胞周期蛋白D1体内(25,26)，显示了cyclin D1在乳腺肿瘤发生中的肿瘤基因特异性作用。目前的研究通过证明细胞周期蛋白D1是EYA1诱导的乳腺肿瘤生长所必需的，扩展了我们对乳腺肿瘤增殖中细胞周期蛋白D_1需求的理解。这些研究并不排除EYA1可能诱导其他基因的可能性，这也可能有助于EYA1诱导的乳腺肿瘤生长。此外，EYA1诱导乳腺癌细胞增殖的能力可能取决于致癌驱动因素或乳腺细胞系或肿瘤。在这方面，使用WST分析在MCF-7细胞中评估的细胞增殖诱导不需要EYA1磷酸酶功能，MCF-7是一种细胞类型细胞周期蛋白D1基因产物通过扩增过度表达(27).
细胞周期蛋白D1的丰度通过不同的机制进行调节，包括磷酸化的翻译后修饰和mRNA和/或基因转录的诱导。在当前的研究中，EYA1诱导细胞周期蛋白D1 mRNA转录，如放线菌酮mRNA稳定性研究所示。EYA1对细胞周期蛋白D1 mRNA和启动子活性的诱导依赖于EYA1磷酸酶功能。突变分析表明AP-1/CRE转录因子结合位点的需求和AP-1位点的点突变消除了EYA1诱导的细胞周期蛋白D1启动子的转录诱导。细胞周期蛋白D1启动子−953的AP-1位点的突变不影响位于小鼠细胞周期蛋白D2启动子的−919和−614的SIX1结合位点(28)在报告基因分析中，SIX1的表达不影响反式激活(). 这些发现表明，RDGN的SIX1和EYA1成分通过不同的顺式元件诱导共同的基因靶点。使用c-fos公司−/−/福斯B−/−AP-1位点被证明是血清刺激和细胞周期进展之间的会聚位点(29)AP-1位点先前被确定为癌性Ras诱导细胞周期蛋白D1表达的关键位点(14).
染色质免疫沉淀分析显示EYA1被招募到细胞周期蛋白D1 AP-1位点，而EYA1没有被招募到与AP-1位点无关的不同细胞周期蛋白D2序列。活性基因组蛋白修饰的组合模式是复杂的(30)然而，我们选择了H3K9乙酰化（H3K8），因为富含H3乙酰化的区域通常被发现是增强子(31). 转录活性染色质的测量，特别是乙酰化的H3K9，表明在EYA1存在下H3K9乙酰化增加。磷酸酶缺陷型EYA1突变体的募集显著减少与H3K9向细胞周期蛋白D1 AP-1位点的募集减少相关。EYA1磷酸酶突变体向局部染色质募集的缺陷表明EYA1去磷酸化对染色质相互作用起积极作用。已知其他磷酸酶与局部染色质结构相互作用并调节局部染色质结构，包括PP4、PP2A、PP6、Wip1、GLC7（酿酒酵母)和代表-PP1。Repo-Man-PP1是一种磷酸酶复合体，调节组蛋白H3 Thr3、Ser10、Ser28去磷酸化，这对有丝分裂后细胞异染色质的重建至关重要(32).
RNA聚合酶II（RNA PII）是蛋白质编码基因转录所必需的(33)RNA聚合酶II向位点募集的减少与EYA1-D327A突变的转录活性降低一致。已知细胞周期蛋白D1 AP-1位点招募AP-1转录因子c-Jun、c-Fos、FRA1、FRA2(29)RNA聚合酶II向AP-1位点募集的减少与EYA1决定细胞周期蛋白D1基因表达诱导的机制一致。
哺乳动物反映了对称和不对称分裂的结合(34). 乳腺细胞的数量可以作为乳腺肿瘤干细胞扩增（BTSC）的替代物。目前的研究表明，EYA1增加了乳房球的形成数量。一些证据支持BTSC或肿瘤起始细胞在乳腺癌发病和进展中的重要性(34,35). 在此，EYA1诱导乳房形成依赖于磷酸酶结构域。EYA1促进BTSC扩增的机制可能包括EYA1被招募到AP-1位点的能力，因为众所周知AP-1转录因子c-Jun可以促进BTSC的扩增(17). 另外，先前的研究已经确定了DACH1和EYA1之间的物理相互作用。已知DACH1占据几个干细胞调节基因的启动子，包括Sox、Oct和Nanog(10). 目前的研究提出了一种可能性，即EYA1可能被DACH/EYA1复合物征募到与诱导肿瘤起始细胞相关的基因中，而这些细胞又可能促进肿瘤发生的进展。
鸣谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院RO1CA132115、R01CA70896、R01CA 75503和R01CA 86072（R.G.P.）的部分支持，并获得了P30CA56036（Kimmel Cancer Center Core grant to R.G.P..）的资助。这项工作还得到了Ralph博士和Marian C.Falk医学研究信托基金（R.G.P.）、Margaret Q.Landenberger研究基金会（K.W.）、国防部概念奖W81XWH-11-1-0303（K.W）的资助，以及中国国家自然科学基金会的部分支持；81072169和81261120395（KW.）。
工具书类
1Voas MG，Rebay I.发育过程中的信号整合：来自果蝇眼睛的见解。开发动态。2004;229:162–175.[公共医学][谷歌学者] 2Popov VM、Wu K、Zhou J、Powell MJ、Mardon G、Wang C、Pestell RG。腊肠基因在发育和激素反应性肿瘤发生中的作用。内分泌代谢趋势。2010;21:41–49. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。Silver SJ，Davies EL，Doyon L，Rebay I。对缺失眼睛的功能性解剖揭示了视网膜决定基因网络中的新调控模式。分子细胞生物学。2003;23:5989–5999. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Popov VM、Zhou J、Shirley LA、Quong J、Yeow WS、Wright JA、Wu K、Rui H、Vadlamudi RK、Jiang J、Kumar R、Wang C、Pestell RG。细胞命运决定因子DACH1在雌激素受体α阳性乳腺癌中表达，并抑制雌激素受体α信号传导。癌症研究。2009;69:5752–5760. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Wu K、Katiyar S、Witkiewicz A、Li A、McCue P、Song LN、Tian L、Jin M、Pestell RG。细胞命运决定因子腊肠抑制雄激素受体信号和前列腺癌细胞生长。癌症研究。2009;69：3347–3355。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Wu K、Li A、Rao M、Liu M、Dailey V、Yang Y、Di Vizio D、Wang C、Lisanti议员、Sauter G、Russell RG、Cvekl A、Pestell RG。DACH1是一种抑制细胞周期蛋白D1和乳腺癌生长的细胞命运决定因子。分子和细胞生物学。2006;26:7116–7129. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Zhang L，Yang N，Huang J，Buckanovich RJ，Liang S，Barchetti A，Vezzani C，O'Brien-Jenkins A，Wang J，Ward MR，Courreges MC，Fracchioli S，Medina A，Katsaros D，Weber BL，Coukos G.转录辅激活子果蝇眼缺失同源物2在上皮性卵巢癌中上调并促进肿瘤生长。癌症研究。2005;65:925–932.[公共医学][谷歌学者] 8Cook PJ，Ju BG，Telese F，Wang X，Glass CK，Rosenfeld MG。H2AX的酪氨酸去磷酸化调节细胞凋亡和存活决定。自然。2009;458:591–596. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Farabaugh SM、Micalizi DS、Jedlicka P、Zhao R、Ford HL。Eya2需要通过TGF-β信号传导、上皮-间充质转化和肿瘤干细胞特性的诱导来介导Six1的前介导功能。致癌物。2011 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Wu K、Jiao X、Li Z、Katiyar S、Casimiro MC、Yang W、Zhang Q、Willmarth NE、Chepelev I、Crosariol M、Wei Z、Hu J、Zhao K、Pestell RG。细胞命运决定因子腊肠对乳腺癌干细胞功能进行了重新编程。生物化学杂志。2011;286:2132–2142. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Wu K、Katiyar S、Li A、Liu M、Ju X、Popov VM、Jiao X、Lisanti MP、Casola A、Pestell RG。腊肠通过抑制白介素-8抑制致癌诱导的乳腺癌细胞迁移和侵袭。美国国家科学院院刊。2008;105:6924–6929. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Lee RJ、Albanese C、Fu M、D'Amico M、Lin B、Watanabe G、Haines GK、3rd、Siegel PM、Hung MC、Yarden Y、Horowitz JM、Muller WJ、Pestell RG。细胞周期蛋白D1是被激活的Neu转化所必需的，并通过E2F依赖的信号通路诱导。分子细胞生物学。2000;20:672–683. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Albanese C、D'Amico M、Reutens AT、Fu M、Watanabe G、Lee RJ、Kitsis RN、Henglein B、Avantaggiati M、Somasundaram K、Thimmapaya B、Pestell RG。E1A相关蛋白p300通过AP-1激活细胞周期蛋白D1基因抑制细胞凋亡。生物化学杂志。1999;274:34186–34195.[公共医学][谷歌学者] 14Albanese C、Johnson J、Watanabe G、Eklund N、Vu D、Arnold A、Pestell RG。转化p21ras突变体和c-Ets-2通过可区分的区域激活cyclin D1启动子。生物化学杂志。1995;270:23589–23597.[公共医学][谷歌学者] 15Casimiro MC、Crosariol M、Loro E、Ertel A、Yu Z、Dampier W、Saria EA、Papanikolaou A、Stanek TJ、Li Z、Wang C、Fortina P、Addya S、Tozeren A、Knudsen ES、Arnold A、Pestell RG。细胞周期蛋白D1的ChIP测序揭示了转录在小鼠染色体不稳定中的作用。临床投资杂志。2012;122:833–843. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16日本鳃耳综合征（BOR）患者及相关疾病中的冈田M、藤丸R、森本N、佐村K、Kaku Y、津崎K、野津K、Okuyama T、Iijima K、EYA1和SIX1基因突变。小儿肾病。2006;21:475–481.[公共医学][谷歌学者] 17Jiao X、Katiyar S、Willmarth NE、Liu M、Ma X、Flomenberg N、Lisanti MP、Pestell RG。c-Jun诱导乳腺上皮细胞浸润和乳腺癌干细胞扩张。生物化学杂志。2010;285:8218–8226. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Velasco-Velazquez M、Jiao X、De La Fuente M、Pestell TG、Ertel A、Lisanti MP、Pestel RG。CCR5拮抗剂阻断基底部乳腺癌细胞的转移。癌症研究。2012;72:3839–3850.[公共医学][谷歌学者] 19Perou CM、Sorlie T、Eisen MB、van de Rijn M、Jeffrey SS、Rees CA、Pollack JR、Ross DT、Johnsen H、Akslen LA、Fluge O、Pergamenschikov A、Williams C、Zhu SX、Lonning PE、Borresen Dale AL、Brown PO、Botstein D。人类乳腺肿瘤的分子画像。自然。2000;406:747–752.[公共医学][谷歌学者] 20Holliday DL，Speirs V.为乳腺癌研究选择合适的细胞系。乳腺癌研究。2011;13:215. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Hollestelle A、Nagel JH、Smid M、Lam S、Elstrodt F、Wasielewski M、Ng SS、French PJ、Peeters JK、Rozendaal MJ、Riaz M、Koopman DG、Ten Hagen TL、de Leeuw BH、Zwarthoff EC、Teunisse A、van der Spek PJ，Klijn JG、Dinjens WN、Ethier SP、Clevers H、Jochemsen AG、den Bakker MA、Foekens JA、Martens JW、Schutte M。管腔型和基底型乳腺癌细胞系的不同基因突变谱。乳腺癌研究治疗。2010;121:53–64.[公共医学][谷歌学者] 22Prall OW、Rogan EM、Musgrove EA、Watts CK、Sutherland RL。c-Myc或细胞周期蛋白D1模拟雌激素对细胞周期蛋白E-Cdk2激活和细胞周期重新进入的影响。分子细胞生物学。1998;18:4499–4508. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Dontu G、Abdallah WM、Foley JM、Jackson KW、Clarke MF、Kawamura MJ、Wicha MS。人类乳腺干/祖细胞的体外增殖和转录图谱。基因发育。2003;17:1253–1270. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Lee RJ、Albanese C、Fu M、D'Amico M、Lin B、Watanabe G、Haines GK、3rd、Siegel PM、Hung MC、Yarden Y、Horowitz JM、Muller WJ、Pestell RG。细胞周期蛋白D1是被激活的Neu转化所必需的，并通过E2F依赖的信号通路诱导。分子细胞生物学。2000;20:672–683. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Yu Q，Geng Y，Sicinski P.细胞周期蛋白D1消融对乳腺癌的特异性保护。自然。2001;411:1017–1021.[公共医学][谷歌学者] 26Rowlands TM、Pechenkina IV、Hatsell SJ、Pestell RG、Cowin P.剖析β-catenin和cyclin D1在乳腺发育和肿瘤形成中的作用。美国国家科学院院刊。2003;100:11400–11405. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Pandey RN、Rani R、Yeo EJ、Spencer M、Hu S、Lang RA、Hegde RS。The Eyes Absent磷酸酶反式激活蛋白促进肿瘤细胞的增殖、转化、迁移和侵袭。致癌物。2010;29:3715–3722. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Yu Y，Davicioni E，Triche TJ，Merlino G。同源蛋白six1转录激活多个原癌基因，但需要ezrin促进转移。癌症研究。2006;66:1982–1989.[公共医学][谷歌学者] 29Brown JR、Nigh E、Lee RJ、Ye H、Thompson MA、Saudou F、Pestell RG、Greenberg ME。Fos家族成员通过激活细胞周期蛋白D1诱导细胞周期进入。分子细胞生物学。1998;18:5609–5619. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Wang Z，Zang C，Rosenfeld JA，Schones DE，Barski A，Cuddapah S，Cui K，Roh TY，Peng W，Zhang MQ，Zhao K。人类基因组中组蛋白乙酰化和甲基化的组合模式。自然遗传学。2008;40:897–903. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Roh TY，Wei G，Farrell CM，Zhao K。组蛋白乙酰化模式对保守和非保守增强子的全基因组预测。基因组研究。2007;17:74–81. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Vagnarelli P，恩萧WC。Repo-Man-PP1：染色质重塑和核膜重组之间的联系。核心。2012;三:138–142. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33卡多纳加JT。序列特异性DNA结合因子对RNA聚合酶II转录的调节。单元格。2004;116:247–257.[公共医学][谷歌学者] 34Yu Z、Pestell TG、Lisanti MP、Pestel RG。癌症干细胞。国际生物化学与细胞生物学杂志。2012;44:2144–2151. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Jamieson CH、Ailles LE、Dylla SJ、Muijtjens M、Jones C、Zehnder JL、Gotlib J、Li K、Manz MG、Keating A、Sawyers CL、Weissman IL。粒细胞-巨噬细胞祖细胞作为急症CML的候选白血病干细胞。N英格兰医学杂志。2004;351:657–667.[公共医学][谷歌学者] 
