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.2011年7月26日；108(30):12384-9.
doi:10.1073/pnas.0906930108。 Epub 2011年7月12日。

纯合缺失基因DACH1调节胶质瘤细胞的致瘤活性

渡边明 1, 小原秀树, Shogo Ehata公司, 阿基塔克·穆卡萨, 石川慎培, Daichi Maeda公司, Keisuke Ueki先生, 井井康史, Tomoki Todo先生, 山田康弘, 藤山正史, 斋藤信仁, Kohei Miyazono先生, Hiroyuki Aburatani（阿布拉塔尼）
附属公司

纯合缺失基因DACH1调节胶质瘤细胞的致瘤活性

渡边明等。 美国国家科学院程序. .

摘要

抑癌基因功能的丧失或减少有助于肿瘤的发生。在这里，通过使用单核苷酸多态性基因分型阵列和质谱的等位基因DNA拷贝数分析，我们报告了多形性胶质母细胞瘤13q21染色体上的纯合子缺失，DACH1基因位于该染色体上。我们发现DACH1的强制表达降低了一系列神经胶质瘤细胞系的细胞增殖。然后我们生成了U87TR-Da胶质瘤细胞，其中DACH1的表达可以通过细胞暴露于强力霉素而激活。与DACH1-不表达U87TR-Da细胞（U87-DACH1-低）相比，DACH1表达的U87TR-Da细胞中小鼠皮下移植瘤的体外细胞增殖和体内生长均降低。U87-DACH1-低细胞在无血清培养基中形成球状体，CD133和Nestin表达，而U87-DACH1-高细胞则不表达。与球形形成的U87-DACH1-low细胞相比，粘附的U87-DACH1-high细胞的致瘤性较低，表明DACH1减少了致瘤细胞的数量。基因表达分析和染色质免疫沉淀分析表明，成纤维细胞生长因子2（FGF2/bFGF）被DACH1转录抑制，尤其是在无血清培养基中培养的细胞中。外源性bFGF可挽救U87-DACH1-high细胞的球体形成活性和致瘤性，这表明DACH1的缺失通过bFGF的转录激活增加了致瘤细胞的数量。这些结果表明，DACH1是一种独特的肿瘤抑制因子，它不仅抑制肿瘤细胞的生长，而且调节bFGF介导的胶质瘤细胞的肿瘤启动活性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
DACH1在GBM中纯合缺失(A类)GBM病例4 DNA拷贝数和等位基因交替的综合观点。用GIM算法估计推断的等位基因拷贝数（红色和蓝色）的散点图。箭头表示纯合子缺失位点。(赖特)GBM病例4从染色体13q21到13q34的DNA拷贝数放大图。一个等位基因在整个区域（蓝色）显示DNA拷贝数减少，而另一个等位点（红色）仅在染色体13q21处显示拷贝数减少。(B类)13q21区域SNP基因分型综述。S1-24和M1-11分别是SNP基因分型阵列和MassARRAY中可用的SNP ID。黑线，纯合缺失区域；虚线，纯合缺失的可能延伸区域；*，还通过SNP阵列进行了检查，如图S1A类.
图2。
图2。
DACH1表达抑制胶质瘤细胞的生长。(A类)用抗DACH1抗体对U87TR-Da克隆-16和克隆-18细胞进行免疫印迹。（B） 诱导后4或6天通过WST-8分析计数U87TR-Da细胞的细胞增殖DACH1号机组强力霉素。(C类)DACH1表达影响肿瘤进展的实验模型。将连续稀释的U87TR-Da细胞皮下注射到BALB/c裸鼠背部，在皮下注射细胞后28天观察肿瘤形成。(D类)DACH1在U87TR-Da肿瘤中的表达。用抗DACH1抗体对异种移植的U87TR-Da克隆-16肿瘤进行免疫印迹检测DACH1(上部). 从饮用补充强力霉素（左车道）或对照水（右车道）的小鼠中切除肿瘤组织。β-actin被检测为负荷对照(下部). (E类)接种后20天异种移植DACH1非表达或表达U87TR-Da克隆-16细胞的肿瘤形成。(F类)异种移植的U87TR-Da克隆-16或U87TR肿瘤的生长。DOX，强力霉素（1μg/mL）；点，平均值(n个= 6); 棒，每组6只动物的扫描电镜；无统计学意义*P（P）<0.05（双向方差分析），与强力霉素阴性对照组相比具有统计学意义。(G公司)原位异种移植模型评估DACH1表达对肿瘤进展的影响。U87TR-Da克隆-16细胞在无强力霉素中预培养(左侧)或含强力霉素(赖特)中等。(H（H）)植入后5周立体定向植入DACH1-非表达（DOX-）或表达（DOX+）细胞的脑肿瘤大小。棒材，每组4只动物的扫描电镜；无统计学意义*P（P）<0.05（双向方差分析），与强力霉素阴性对照组相比具有统计学意义。
图3。
图3。
DACH1的表达抑制了球体的形成。(A类)U87TR Da克隆-16细胞中DACH1和bFGF的蛋白表达水平。(B类)培养细胞的图像。U87TR-Da克隆-16细胞首先在不含FBS的DMEM中培养(左上)或存在(左下方)然后将培养基替换为无血清NBE或含血清DMEMF培养基。在DACH1非表达细胞中观察到粘附细胞的分支投射（红色箭头）。（比例尺：500μm）(C类)球形巢蛋白染色（绿色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。(D类)在含血清（DMEMF）或无血清（NBE）培养条件下DACH1-非表达（DOX-）或表达（DOX+）细胞的CD133表达。列，平均值(n个= 3); 棒材，S.D.；***P（P）< 0.05. (E类)在NBE培养基中培养的DACH1表达或DACH1不表达U87TR-Da细胞的肿瘤形成。用5×10在4只小鼠中的3只中形成肿瘤三DACH1-非表达U87TR-Da克隆-16细胞和所有2×10小鼠4和1×105观察到DACH1不表达U87TR-Da克隆-16细胞，而皮下注射DACH1表达的U87TR克隆-16没有形成任何肿瘤。DOX-，在无强力霉素NBE培养基中培养U87TR-Da克隆-16细胞的小鼠；DOX+，在补充强力霉素的培养基中培养U87TR-Da细胞的小鼠。
图4。
图4。
异位DACH1表达降低FGF2表达、球体形成和肿瘤生长。(A类)压制FGF2组DACH1表达。DMEMF，含血清的DMEM；NBE，无血清神经基础培养基。(B类)在无和存在bFGF的情况下，U87TR-Da中形成球体。列，平均值(n个= 3); 棒材、扫描电镜三个实验*P（P）<0.05（未配对t吨-试验），与强力霉素阴性对照组相比具有统计学意义。(C类)绿色荧光蛋白（GFP）、DACH1和bFGF的蛋白表达。(D类)原位异种移植模型评估FGF2组肿瘤进展DACH1号机组-表达细胞。用DACH1慢病毒转导U87MG细胞，并在含有zeocin的培养基中培养。然后，用携带FGF2的慢病毒感染DACH1表达细胞(左侧)或控制(赖特)向量。(E类)植入的脑肿瘤大小FGF2组-表达或控制U87MG细胞。每组5只动物的棒状扫描电镜；无统计学意义*P（P）<0.05（双向方差分析），与强力霉素阴性对照组相比具有统计学意义。
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