《美国病理学杂志》。2002年6月；160(6): 2081–2093.
乳腺潜在转化生长因子-β激活
卵巢激素调节对导管和肺泡增殖的影响
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肯尼思·伊万
来自生命科学部，*加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室；锡安山癌症研究所，†加利福尼亚大学旧金山分校；和国家癌症研究所，‡马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院
戈帕兰·希亚马拉
来自生命科学部，*加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室；锡安山癌症研究所，†加利福尼亚大学旧金山分校；和国家癌症研究所，‡美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达
什拉德哈·A·拉瓦尼
来自生命科学部门，*加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室；锡安山癌症研究所，†加利福尼亚大学旧金山分校；和国家癌症研究所，‡马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院
杨唐
来自生命科学部，*加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室；锡安山癌症研究所，†加利福尼亚大学旧金山分校；和国家癌症研究所，‡马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院
罗斯玛丽·阿赫斯特
来自生命科学部，*加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室；锡安山癌症研究所，†加利福尼亚大学旧金山分校；和国家癌症研究所，‡马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院
拉拉克·韦克菲尔德
来自生命科学部，*加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室；锡安山癌症研究所，†加利福尼亚大学旧金山分校；和国家癌症研究所，‡马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院
玛丽·海伦·巴赛洛斯·霍夫
来自生命科学部，*加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室；锡安山癌症研究所，†加利福尼亚大学旧金山分校；和国家癌症研究所，‡马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院
来自生命科学部，*加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室；锡安山癌症研究所，†加利福尼亚大学旧金山分校；和国家癌症研究所，‡马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院
摘要
转化生长因子-β1（TGF-β1）是一种多功能细胞因子，可以抑制上皮细胞增殖并诱导凋亡，但也广泛参与乳腺癌的进展。了解其在乳腺发育中的生物作用对于了解其在癌症中的作用至关重要。TGF-β1是一种潜在的复合物，在受体结合之前需要细胞外活化。为了更好地理解其在乳腺发育过程中作用的时空调控，我们检测了激活模式就地使用选择的抗体来区分潜在和活性TGF-β。激活受到高度限制。TGF-β1的激活主要局限于上皮细胞，在上皮细胞内仅限于管腔上皮细胞，但在帽细胞或肌上皮细胞中均不存在。在管腔上皮内，我们注意到进一步的限制。在卵巢激素刺激的增殖期（即青春期、发情期和妊娠期），一些细胞中TGF-β1的激活降低，这与增殖的准备工作一致。矛盾的是，其他细胞同时增加TGF-β1免疫反应性，这表明TGF-。这些数据表明，内源性TGF-β1的激活及其活性受卵巢激素的调节。为了确定TGF-β1活性的具体后果，我们对TGF-体内使用Tgfβ1敲除小鼠并用杂合组织进行组织重组实验。在Tgfβ1TGF-β1野生型水平<10%的杂合小鼠，青春期导管发育和妊娠期肺泡发育加快，这与其生长抑制剂的作用一致。细胞增殖指数Tgfβ1+/−上皮细胞在静止组织中大约增加了两倍，在增殖组织中增加了四倍，但导管和肺泡在大体和组织学上均正常。为了测试上皮TGF-β1是否对增殖表型至关重要，Tgfβ1+/+将+/-上皮移植到+/+乳腺基质中。The outgrowth ofTgfβ1+/野生型宿主的−上皮细胞加速，表明该表型是上皮细胞固有的。此外，在生长因子β1+/卵巢切除和雌激素和孕酮治疗后，TGF-β1以自分泌或旁分泌的方式调节上皮细胞增殖。总之，这些数据表明卵巢激素调节TGF-β1的激活，从而限制激素信号的增殖反应。
转化生长因子-β1（TGF-β）是参与调节增殖、细胞凋亡、细胞外基质和蛋白酶产生的蛋白质超家族的创始成员。1,2在上皮细胞中，TGF-β信号传导介导G1通过间接诱导或激活细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂来阻断。3,4TGF-β1对正常乳腺上皮细胞的生长有明显抑制作用，但乳腺癌细胞对生长抑制有广泛抵抗力，5尽管其他目标仍在响应。6过度表达TGF-β1抑制乳腺肿瘤的发生，7但TGF-β1也可以在皮肤、乳腺和结肠的晚期致癌过程中转化为促肿瘤作用。8-10TGF-β1亚型通常在较晚期的肿瘤中高表达，并可通过多种方式促进肿瘤发生。11高水平的TGF-β1活性可能促进血管生成12金属蛋白酶的表达13,14这将有利于扩张和入侵。因为TGF-β1也抑制免疫细胞功能，15有人建议肿瘤产生这种物质可以减少免疫监视。在自分泌水平，对TGF-β介导的G1停搏是乳腺细胞系向不稳定表型发展的重要步骤之一。16此外，TGF-β1与肿瘤细胞的上皮-间充质转化密切相关。8-10,17TGF-β1信号传导和作用的复杂性，18强调理解其功能的必要性就地在正常组织发育和癌变过程中。
定义TGF-β1活性的具体后果更加复杂，因为TGF-，19区别，20和微环境21并且由于各种受体和细胞内信号成分的表达差异。Daniel和同事的优雅研究22,23是最早证明TGF-β1在小鼠乳腺中作为上皮生长抑制剂的人之一。虽然在乳腺发育和分化的所有阶段，三种哺乳动物TGF-β1亚型的mRNA都在上皮和基质中表达，24在乳腺发育过程中，对TGF-β1的反应似乎是精心安排的。用缓释颗粒给药的TGF-β1可使终芽在青春期退化，但不会抑制成人的侧向分支或妊娠期间分泌分化所需的肺泡外生长。25,26确定这种对外源性TGF-β的差异敏感性的基础是很有意义的，因为TGF-α1反应性的丧失通常与乳腺癌细胞有关。5
了解TGF-β1生物学作用的另一个因素是其作为潜在复合物的产生，该复合物由24-kd细胞因子及其前前区80-kd二聚体（称为潜伏相关肽（LAP））组成。27因为LAP含有分泌的信号序列，28细胞分泌潜伏性转化生长因子-β1（LTGF-β1）。因此，从LAP中释放TGF-β1的细胞外过程基本上控制了其生物可用性，从而控制其作用。29野生型TGF-β的过度表达导致LTGF-β1生成增加，通常不会导致表型改变，而组成型活性突变型TGF--β1的表达会导致显著的表型。25，30这些研究支持这样的观点，即了解TGF-β1生物利用度的关键是确定其激活的位置和环境。
定位TGF-β1对生理刺激的激活的研究体内没有得到充分的解决，主要是因为缺乏适当的试剂来评估活化就地我们已经确定，某些针对TGF-β1的抗体可以区分潜在和活性TGF-就地通过定义其在组织中的免疫反应性，以生成成分活性形式或潜在复合物形式的TGF-β1。31,32我们已经在几个模型中证明，用这种方式选择的抗体增加染色强度，伴随着LAP免疫反应性的丧失，是提示性的就地LTGF-β1激活。33-35有了这些信息，可以更容易地研究TGF-β1的组织特异性作用。
为了更好地了解TGF-β1在乳腺中的作用，我们使用免疫荧光技术定位乳腺发育和分化过程中的LAP和TGF-。为了确定TGF-β的具体后果，我们比较了特定发育事件中的免疫反应模式与乳腺发育相应阶段靶向基因敲除导致TGF-α1耗竭的效果。36 Tgfβ1−/−小鼠在3周龄时死于严重炎症，因此无法进行乳腺成熟分析。然而，Tgfβ1+/−尽管TGF-β1蛋白水平显著降低，但小鼠仍能存活。37这些小鼠提供了乳腺发育期间TGF-β1耗竭的实验模型。我们的研究表明，TGF-β1的激活在乳腺发育和分泌分化过程中以细胞限制的方式受到高度调节。The phenotype of theTgfβ1+/−小鼠支持TGF-β1作为乳腺上皮增殖抑制剂的作用。总之，这些研究表明TGF-β1的激活受激素环境控制，TGF-。
材料和方法
动物
所有实验都经过了机构审查和批准。动物被一氧化碳安乐死2根据AAALAC指南，在指定时间进行吸入和颈椎脱位。乳腺收集自劳伦斯伯克利国家实验室培育的FVB小鼠，商业化获得的BALB/c小鼠，129SV/C57BL/6Tgfβ1+/+或+/-在美国国立卫生研究院或劳伦斯伯克利国家实验室内部培育的小鼠，以及同源的129S2/SV HsdcTgfβ1+/+129S2/SV Hsd和C57BL/6 Tac的+/-小鼠和F1露头Tgfβ1+/+或在旧金山加利福尼亚大学培育的+/-小鼠。除非另有规定，免疫染色数据来自FVB小鼠，转基因表型数据来自129SV/C57BL/6Tgfβ1+/+或+/-小鼠。利用阴道涂片的细胞学特征分期发情期，并通过子宫湿重在死后确认。妊娠由阴道塞确定，并由胚胎确认。10周龄小鼠去卵巢14至17天，每天腹膜内注射雌二醇（1μg）和孕酮（1 mg），持续3天。对照组动物在同一时间段内注射溶媒。
将腹股沟（第四对）乳腺从皮肤上剥离，并将其置于Carnoy固定剂中进行全支架染色，或嵌入OCT化合物（Miles Inc.，Elkhart，in）中。冰冻组织块在−70°C下保存，直至切片。如前所述，用1%胭脂红明矾对腺体进行整体染色38但腺体整夜都固定在卡诺伊的固定剂中；染色后的腺体脱水后保存在水杨酸甲酯中。摄影后，将整个乳腺支架嵌入石蜡中，在5μm处切片，并用苏木精和伊红染色，以对致密细胞核进行评分。
将乳腺上皮移植到清洁的脂肪垫上
三周F1 129S2/SV Hsd×C57BL/6 TacTgfβ1+/+或+/-小鼠用0.01ml/10g体重的40mg/ml木聚嗪和25mg/ml氯胺酮麻醉。皮肤在前中线和每个飞节处无菌打开；一个皮瓣被钉回，露出第四个（腹股沟）腺体。39乳头、淋巴结上方（包括淋巴结）的组织以及与第五个腺体的连接被烧灼并切除。单个组织碎片（1 mm三)来自F1 129S2/SV Hsd×C57BL/6 Tac的腹股沟腺Tgfβ1+/+或+/-成年供体动物被移植到清除脂肪垫腹前缘的狭缝中。对对侧腹股沟腺重复此程序。然后用伤口夹封闭宿主动物的皮肤；1周后取出。术后6周对宿主动物实施安乐死，以检查腹股沟腺导管的生长情况。
抗体
命名为chNTGF-β1的抗体是多克隆亲和纯化鸡抗TGF-β1抗体（AF-101-NA，批号FS03和FS08；明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems）的亲和纯化免疫球蛋白部分，优先与TGF-？活性形式反应。34如前所述，重组人TGF-β1 LAP（R&D系统）的山羊多克隆抗体对潜在的TGF-α1具有特异性。33,34使用荧光素标记的抗羊IgG（皮尔斯、罗克福德、伊利诺伊州或美国阿拉巴马州伯明翰的南方生物技术联合公司）检测LAP抗体。德克萨斯州红标抗鸡抗体（西格玛，密苏里州圣路易斯）用于检测TGF-β。根据制造商的方案（DAKO，Carpintia，CA），以1至10倍的稀释度使用荧光素结合的增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆小鼠抗体。Intergen试剂盒（购买，纽约）用于末端dUTP镍标记染色；使用制造商的说明书进行染色。
免疫组织化学
如前所述，进行免疫染色以区分活性和潜在活性TGF-β1免疫染色。34简单地说，将冰冻嵌入的乳腺切片到涂有明胶的盖玻片上，然后在室温下使用2%的缓冲多聚甲醛固定20分钟，然后使用0.1 mol/L甘氨酸/磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗。使用0.5%酪蛋白/PBS溶液（pH 7.4）的上清液封闭非特定部位60分钟。将切片与LAP和TGF-β1抗体的初级抗体同时孵育过夜，并将其稀释在封闭缓冲液中。清洗后，通过与物种特异性二级抗体的连续孵育检测每个初级抗体。对于PCNA染色，切片在PBS中的2%多聚甲醛中固定5分钟，清洗，并在4°C的甲醇中固定10分钟。如上所述封闭切片，然后在异硫氰酸荧光素缀合的抗体中孵育1小时。细胞核用4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染。节段安装在Vectashield（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories），并在评估前储存在−20°C。在每个实验中一级抗体对照的缺失和二级抗体交叉反应性的测定通常为阴性。
图像采集与处理
使用配备有落射荧光的蔡司Axiovert物镜上的×40.75数值孔径蔡司Neofluar物镜获得免疫荧光图像。使用多带通二向色镜、阻挡层滤光片和差分波长滤光片轮组合按顺序选择性激发荧光色素。使用科学粒度的12位电荷耦合器件（KAF-1400，1317×1035 6.8μm平方像素）数码相机（加拿大温哥华希利克斯）拍摄图像。在使用Scilimage（荷兰代尔夫特TNO应用物理研究所）构建图形时，使用数据集最小值和最大值将12位数据缩放到普通的8位尺度，从而保持图像的相对强度。内部标准化是通过比较在同一实验中用相同抗体染色的图像来实现的，这些图像是用相同的参数捕获的，并以相同的比例缩放和显示。通过定义代表细胞的感兴趣区域来分析荧光强度的相对定量，该区域位于上皮细胞核或基质细胞核之间，使用DAPI图像，而不参考荧光标记图像，以避免选择偏差。在计算每个感兴趣区域内的总荧光强度之前，从图像中减去背景荧光，并以图形方式显示选定治疗组的荧光强度，或显示人群的平均免疫反应强度（任意单位）。一些图像是用假彩色合成物显示的。
统计
双尾未成对学生的t吨-使用Prism Version 2.01（GraphPad Inc.）测试或Fisher精确测试评估对照组和治疗组之间是否存在显著差异。Kolmogorov-Smirnov双样本拟合优度检验用于使用S-Plus（Mathsoft，Inc.）比较分布。
TGF-β1生物测定
酸性乙醇提取物Tgfβ1+/+和+/-乳腺组织的制作如所述。40使用转染了纤溶酶原激活物抑制剂（PAI）启动子-荧光素酶载体构建物的水貂肺上皮细胞对这些提取物进行三次生物检测。41将荧光素酶读数与用三倍稀释的重组活性TGF-β1构建的标准曲线进行比较（明尼阿波利斯研发系统公司）。
结果
TGF-β1在青春期乳腺上皮内的激活受到限制
为了了解TGF-β1在乳腺发育过程中的生物利用度，我们在幼年FVB小鼠乳腺冰冻切片中使用双重免疫荧光检测了免疫活性LAP（作为潜在TGF-乳腺在出生后发育分为两个阶段：青春期形成导管树和妊娠期完全功能分化。这些阶段由卵巢激素、雌激素和孕酮调节。42乳腺导管的形态发生在青春期通过终芽的生长而发生，终芽是一种多细胞上皮结构，侵入脂肪基质形成乳腺导管树。端芽是上皮细胞活跃增殖的部位，被单层帽细胞包围，帽细胞是一种特殊的上皮细胞，在端芽和脂肪基质之间形成界面。43通向顶芽的对向导管相对静止。
乳腺上皮LAP和TGF-β1免疫染色在导管形态发生过程中受到调节。答：核DAPI染色(顶部)和活性TGF-β1的双重免疫定位(中间的)和LAP(底部)顶芽的数量(左边)和远端导管(正确的). 在导管形态发生过程中，终芽中的大多数体细胞显示LAP和强烈的TGF-β1免疫染色，但有些细胞缺乏活性TGF-(箭头). 帽状单元格(箭头)在终芽和脂肪基质之间的界面处，TGF-β1呈阴性，尽管它们被LAP抗体染色。近端芽区的导管上皮显示较少TGF-β1免疫染色。组织来自FVB小鼠。比例尺，20μm。B类：TGF-β1和LAP的平均（±SD）强度在导管（SD）和顶芽（Se）的上皮周围基质以及帽细胞层的上皮细胞中进行定量(C类)，端芽体细胞(B类)和远端导管(D类). 芽端体细胞的TGF-β1免疫反应性明显高于其他人群。抄送：为了评估不同上皮细胞群中TGF-β1阳性细胞的频率，免疫反应性大于基质细胞TGF-α1强度平均+2 SD的细胞被定义为TGF-？阳性。大多数端芽体和导管上皮细胞TGF-β1阳性，而帽细胞很少阳性。
LAP免疫反应遍布上皮、纤维间质和脂肪。使用数字图像分析确定不同细胞室之间强度的相对差异（图1B）LAP免疫反应的平均强度在通向终芽的导管中最低；端芽基质的强度约为远端导管的两倍，上皮细胞的免疫反应性为远端导管免疫反应性的2-4倍。表明TGF-β1激活的免疫染色在端芽上皮细胞亚群中显著（图1A）相反，尽管LAP免疫反应性相对较高，但端芽帽细胞的TGF-β1免疫反应性比端芽体细胞低四倍。与端芽体上皮细胞相比，对侧导管上皮细胞静止，显示出相对均匀的TGF-β1活性免疫染色模式。导管上皮细胞中TGF-β1免疫反应强度为端芽体细胞的三分之二。
基质中几乎检测不到TGF-β1免疫反应性，测量的强度比端芽体细胞低6倍。这并不是因为免疫染色技术的不同敏感性，因为TGF-β1的激活很容易在受照乳腺的脂肪基质和纤维基质中检测到。34使用远端基质平均TGF-β1强度的两倍阈值，75%或更多的端芽体和导管上皮细胞为TGF-α1阳性，而只有10%的帽细胞为阳性（图1C）这些数据表明，尽管LAP和TGF-β1广泛分布于乳腺，但它们的相对丰度取决于细胞类型。
因为LAP和TGF-β1是在一个复杂的、不同的免疫定位中共同分泌的，LAP和转化生长因子-β1与去除和/或在激活或与受体结合期间LAP变形后显示的隐秘TGF-α1表位一致。31相对于LAP免疫染色的广泛分布，TGF-β1的局限性定位表明，青春期乳腺内源性TGF-。有人会预测，TGF-β1缺失的任何影响都将主要影响端芽，而不是导管上皮细胞，因为它们表现出更高水平的TGF-α1激活。
雌激素周期对TGF-β1激活模式的调节
在未生育的成年雌性小鼠中，乳腺上皮相对静止，但随着发情周期中产生的卵巢激素的作用，乳腺上皮会经历适度的增殖和缩短的侧芽。LAP免疫反应广泛存在于成人乳腺上皮、上皮周间质和脂肪间质，而TGF-β1免疫反应仅限于上皮细胞。对发情功能的分析显示出与发情周期不同阶段相关的TGF-β1免疫染色的不同模式（图2）在间期，上皮细胞对LAP和TGF-β1抗体均呈一致的免疫反应，类似于未成熟乳腺远端导管中的免疫反应。在发情前期，TGF-β1选择性降低，以至于一些细胞TGF-α1阳性，但相邻细胞几乎为阴性。发情期间，上皮中TGF-β1免疫染色的异质性增加，导致棋盘格图案，由紧邻阴性细胞的强阳性细胞组成。这种异质性在导管的横截面上尤为明显，在具有最小上皮间质的小导管中最常见（图2E）较大的导管具有明显的上皮周围成纤维细胞袖口，倾向于显示相对均匀的TGF-β1免疫反应性（未显示）。发情期显著的TGF-β1阳性细胞的这种引人注目的模式与在端芽体细胞中观察到的限制性免疫反应相似。为了确保这一表型是发情周期的特征，而不是小鼠品系，对三个品系的小鼠进行了检测：BALB/c、129SV/C57BL/6和FVB，所有这些都显示了上述特征；显示的数据来自FVB小鼠。
LAP和TGF-β1免疫染色在发情周期中高度异质。A–C：未产FVB动物的哺乳动物上皮免疫反应性作为发情周期的函数；DAPI染色细胞核(A类)，圈(B类)和活性转化生长因子-β1（TGF-β）(C类)免疫反应。在间期，大多数上皮细胞都被这两种抗体染色。发情前期，上皮导管出现异质性TGF-β1染色的转变。在发情期，TGF-β1免疫反应的异质性增加，以至于上皮细胞中含有TGF-α1阴性细胞，与阳性细胞相邻。LAP更均匀。偶尔观察到发情期的一些上皮管呈现出与间期相似的低均匀染色（未显示）。医生：每个细胞LAP和TGF-β1免疫反应强度的定量图像分析。在间期，大多数细胞中每细胞LAP的相对强度与TGF-β1呈线性相关。在发情前期，TGF-β1含量很低的细胞群很明显。在发情期，额外的群体由TGF-β1高表达和LAP低表达的细胞组成。这些细胞与上述和E类.电子邮箱：抗原纯化的TGF-β1抗体（红色）和LAP抗体（绿色）双重免疫定位的假彩色数字显微照片与DAPI染色的细胞核（蓝色）同时显示。乳腺组织取自发情时处死的动物。LAP免疫反应（绿色）在近上皮间质和脂肪间质中相对均匀，而TGF-β1免疫反应在间质中不明显。TGF-β1和LAP染色呈黄色。请注意，所有细胞都用LAP染色。LAP和TGF-β1免疫反应的不一致表明，TGF-α1表位在大多数基质细胞和一些上皮细胞中被掩盖。这种高度定位的TGF-β1表明其激活受到限制。比例尺，10μm。
对相关免疫反应的逐个细胞分析表明，LAP和TGF-β1的强度在发情前和发情间期呈线性相关（图2D）在发情期，有两个群体很明显：一个与间期和发情前期相似，另一个表现出低LAP（<250）和相对较高TGF-β1（>200）。这种模式与激活一致，在激活过程中，LAP以一种显示先前掩盖的TGF-β1表位的方式发生改变。33因此，我们得出结论，TGF-β1的激活是成年动物荷尔蒙状态的一种功能，而且，这种激活似乎在青春期对乳腺上皮内的某些细胞有高度限制。
妊娠早期TGF-β1的激活仅限于上皮细胞亚群
妊娠期小叶肺泡发育，如青春期导管伸长，以高度增殖为特征。未产和怀孕小鼠组织切片的双重免疫荧光染色表明，在怀孕早期（第6天），LAP免疫反应与发情期相似（图3，B与C）而TGF-β1活性免疫染色不太明显，仅限于导管上皮和肺泡上皮的一部分细胞。妊娠晚期（第14天），TGF-β1阳性细胞几乎无法识别，LAP免疫染色与其他阶段相比显著降低（图3，D与A、 B和C）这与先前报道的妊娠后期TGF-β1信息水平下降一致。24然而，分泌分化伴随着活性TGF-β1免疫反应的顶端定位，这与其抑制乳汁分泌的假定作用一致。44泌乳组织表现出很少的LAP或TGF-β1免疫反应性（未显示）。
妊娠期成人乳腺从发情周期向小叶-肺泡分化的转变伴随着活性和潜在TGF-β的逐渐丧失。答：在间挤过程中，chNTGF-β1的免疫反应在未产妇乳腺中相对均匀。B类：相反，发情期上皮细胞明显异质。抄送：妊娠早期（6天）小鼠的哺乳动物组织表现出较低强度的LAP免疫反应性和较少的chNTGF-β，这表明TGF-β1的产生和激活的逐渐丧失减少。医生：妊娠晚期（18天）接受功能分化的上皮几乎未检测到TGF-β1和LAP免疫染色。对组织切片进行染色并采集图像。抗原纯化的TGF-β1抗体（红色）和LAP抗体（绿色）双重免疫定位的假彩色数字显微照片与DAPI染色的细胞核（蓝色）同时显示。图像按相同比例缩放，以便在TGF-β1和LAP免疫反应模式图中进行比较。比例尺，20μm。
Tgfβ1+/-小鼠在青春期表现出乳腺导管生长加快和增殖增加
TGF-β1被广泛描述为一种上皮细胞生长抑制剂。如果是这样，乳腺终芽（增殖的部位）的显著激活似乎有些自相矛盾。因此，我们使用Tgfβ1击倒老鼠。成人组织来自Tgfβ1+/−只有野生型TGF-β1蛋白水平的10-30%。37为了证实青春期乳腺内源性TGF-β1蛋白水平降低，并确定上皮和/或活化是否受到特异性影响，我们比较了LAP和活性TGF-Tgfβ1+/−野生型室友。青春期杂合子中这两种蛋白的免疫反应性显著降低（图4，A和B）杂合子远端导管上皮中TGF-β1和LAP免疫反应的平均强度分别降低了64%和76%，证实活性和潜在TGF-。然而，激活模式没有改变，这表明Tgfβ1+/−小鼠将了解其活动的后果。
LAP和TGF-β1免疫反应性在Tgfβ1+/−小鼠与+/+小鼠相比。相对LAP的比较(A类和C类)和TGF-β1(B类和D类)上皮的免疫反应强度Tgfβ1+/+ (阴影条)和+/-(开放式酒吧)室友。A类和B类：青春期远端导管中LAP和TGF-β1的染色强度显著降低(P（P）<0.01，Kolmogorov-Smirnov检验）Tgfβ1杂合子。C类和医生：同样，LAP和TGF-β1在Tgfβ1+/−发情期成年小鼠乳腺上皮中的小鼠。
为了确定TGF-β1在青春期的功能后果，129SV/C57BL/6的乳腺Tgfβ1+/+在6周龄时对同窝或+/-窝鼠进行检查。杂合子全乳坐骑的比较与野生型小鼠的导管生长加快（图5）定量分析证实导管外生长是Tgfβ1+/−与同年龄的野生型同卵双胞胎相比（表1）值得注意的是，尽管发育加快，但大体形态和组织学均正常。为了确定这种表型是否与应变相关，我们检测了Tgfβ1+/+和+/-小鼠回交至129S2/Sv Hsd遗传背景下的纯度。129S2/Sv HsdTgfβ1+/−与野生型同窝小鼠（32%脂肪垫填充）相比，小鼠表现出类似的加速生长（66%脂肪垫填满），尽管在这种遗传背景下，导管生长发生在更早的年龄（5周）。因此，青春期表型似乎并不依赖于紧张。
加速乳腺导管生长Tgfβ1+/−小鼠。乳腺整体安装和组织学Tgfβ1+/+ (A类,C类，以及E类)和+/-(B类,D类，以及F类)室友。A类和B类：从6周龄的小鼠身上可以看到整个乳腺的低放大率图像。在野生型小鼠中，上皮外生长已到达淋巴结（LN），而在杂合子中，脂肪垫已满三分之二。在这两种情况下，乳头都在左侧。C类和医生：两种基因型的顶芽上皮相似且组织良好（H&E染色）。星号表示核固缩。E类和传真：在野生型和杂合子小鼠中，乳腺全坐骑的高放大率显微照片显示出相似的分支模式。
表1。
| 基因型 | %脂肪垫填充* | %PCNA标记† | %球状终芽核‡ |
|---|
| 顶芽 | 管道 |
|---|
| 野生型 | 27 ± 3.9 | 2.7 | 1.7 | 2.2 |
| n个= 11 | (34/1265) | (19/1091) | (227/9603) |
| 杂合子 | 61 ± 7.8§ | 8¶ | 4.3¶ | 2.8 |
| n个= 18 | (117/1460) | (44/1015) | (248/9420) |
为了评估DNA合成，用免疫荧光法定位PCNA。PCNA阳性上皮细胞的频率在Tgfβ1+/−端芽上皮细胞和导管上皮细胞的两倍以上（表1）端芽和导管上皮之间1.5倍的差异与这些上皮细胞间TGF-β1平均强度的差异相关。
端芽不仅代表活跃增殖的部位，还代表凋亡的部位，凋亡被认为在管腔形成中起作用。45β1的表达导致妊娠期乳腺上皮细胞凋亡，38因此，可以预测TGF-β1的缺失可能导致细胞凋亡减少。我们发现，杂合子的端芽形态没有受到影响，并且凋亡细胞核的频率没有差异与野生型乳腺顶芽（表1）野生型青春期小鼠乳腺的固缩指数与其他人的报告一致。46因此，乳腺形态发生在Tgfβ1+/−主要是因为乳腺上皮增生增加。该表型与TGF-β1激活抑制上皮增殖的模型一致，但不需要决定凋亡。
Tgf-β1杂合子乳腺的表型是由于上皮性而非系统性/基质性Tgf-β1耗竭
利用乳腺上皮中显性阴性TGF-β1受体转基因表达进行TGF-？功能丧失研究与基质表明，在乳腺形态发生过程中，上皮或基质中TGF-β1信号的作用是不同的。47、48也有人认为基质TGF-β1介导上皮细胞增殖。49虽然在正常发育的任何阶段，我们都没有在乳腺基质中检测到明显的TGF-β1免疫反应活性，但潜伏的TGF--β1是普遍存在的。因此，TGF-β1的某些激活可能发生在抗体检测极限以下。此外，照射后乳腺基质中确实存在TGF-β1的激活。33,34为了研究基质TGF-β1的缺失是否调节上皮细胞的增殖，我们移植了乳腺碎片（～1 mm三)从成年野生型到3周龄F1 129S2/SV Hsd×C57BL/6 Tac的透明（即无乳腺上皮）脂肪垫Tgfβ1+/+或+/-宿主小鼠。移植后6周，我们检查了所产生的导管外生长，并将外生长所占的面积量化为脂肪垫总面积的百分比。野生型腺体中导管外生长的程度与Tgfβ1杂合子宿主（未显示）。然而导管外生长Tgfβ1+/−乳腺移植到+/+或+/-宿主的清除脂肪垫中占三倍（28.3±2.4%，n个=5）相似移植野生型上皮的平均面积（9.1±2.2%SEM；n个= 8;t吨-测试P（P）< 0.001). 因此，基质中TGF-β1的缺失对导管的生长速度几乎没有影响，而上皮TGF-α1的缺失会加速导管的生长。
Tgfβ1+/-小鼠成年乳腺上皮细胞周转增加
证实TGF-β1在成人乳腺中降低Tgfβ1杂合子，我们将LAP和TGF-β1的强度与野生型同卵双胞胎的强度进行了比较（图4，C和D）杂合子乳腺上皮发情期TGF-β1和LAP的平均强度分别降低了66%和69%，但总体异质激活模式未受影响。
由于动情周期影响TGF-β1的激活模式，我们接下来问Tgfβ1作为发情期的函数，杂合乳腺与对照不同。乳腺上皮细胞增殖受内源性激素环境的控制，因此上皮细胞增殖在发情期达到高峰。50这两种基因型在发情期均表现出PCNA阳性细胞的最大数量。然而，发情期的增殖指数是对照组的四倍Tgfβ1+/−与野生型同窝出生的配偶相比（表2）PCNA指数在月经间歇期也有少量但显著的增加Tgfβ1杂合子。因此Tgfβ1杂合子取决于成年动物的激素状态。
表2。
| 发情周期状态 | 基因型 |
|---|
| 野生型 | 杂合子 |
|---|
| %PCNA标记* | | |
| 发情期 | 0.14 (3/2211) | 0.05 (1/2091) |
| 发情期 | 0.57 (18/3142) | 2.3§(48/2114) |
| 迪斯特鲁斯 | 0 (0/1958) | 0.34‡(7/2085) |
| %致密核† | | |
| 发情期 | 0.23 (14/6177) | 0.93§(59/6311) |
| 发情期 | 0.47 (30/6370) | 0.23‡（第14页，共6177页） |
| 迪斯特鲁斯 | 0.45（第27页，共6064页） | 0.60 (36/6034) |
令人惊讶的是，与青春期小鼠的腺体相比，杂合子乳腺的形态与野生型同卵鼠难以区分（图5，E和F）通过量化导管所占乳腺组织切片的百分比（未显示）证实了这一点。增殖增加时缺乏增生形态学，这表明杂合子成年乳腺上皮的平衡是通过改变细胞丢失来维持的。
因此，我们检测了作为发情周期功能的乳腺上皮细胞核固缩形态学的频率，这是细胞凋亡的最后阶段。细胞凋亡的频率和模式在Tgfβ1杂合子。尽管野生型小鼠发情前核固缩的频率最低Tgfβ1杂合子，发情期细胞凋亡指数最低。凋亡细胞核的发生率是Tgfβ1+/−与发情期野生型小鼠相同（表2）这些数据与妊娠期表达组成活性TGF-β1时观察到的促凋亡表型一致，38提示TGF-β1确实有助于调节成人组织的凋亡。然而，这种减少会导致增生。相反，在发情前期，无杂合子乳腺的凋亡细胞数量是正常乳腺的四倍多。因此，在发情期增加细胞增殖和减少细胞凋亡Tgfβ1+/发情前期细胞凋亡增加抵消了−。这种补偿很可能解释了未产妇成年乳腺整体轮廓的最小差异。
Tgfβ1缺失杂合子促进肺泡发育
早期妊娠腺体的肺泡发育抵抗外源性TGF-β1通过植入颗粒的抑制，26这可能会导致人们预测，耗竭几乎不会产生什么影响。然而，尽管存在高水平的增殖，但妊娠期间活性成分TGF-β1的过度表达会导致肺泡发育迟缓。38因此，我们研究了妊娠期间TGF-β1耗竭对肺泡发育的影响。首先，我们确定了Tgfβ1通过对妊娠6天时乳腺组织的酸性乙醇提取物进行生物测定，获得杂合子和野生型乳腺。在这个阶段Tgfβ1杂合小鼠的TGF-β1蛋白含量不到野生型的十分之一（34.3 pg TGF-β/mg蛋白与440.1 pg TGF-β/mg蛋白），这与在其他组织中发现的减少相似Tgfβ1杂合子。37与乳清酸蛋白-TGF-β的小叶肺泡发育减少一致223–225怀孕期间的小鼠，51随着导管的加速生长，TGF-β1的缺失增加了妊娠期小叶-肺泡发育的速度。乳腺上皮所占面积Tgfβ1+/相对于野生型组织中乳腺上皮的面积，−在第6天是野生型组织的2倍，在第14天是野生类型组织的4倍。因此，妊娠期间上皮对TGF-β1仍然敏感。
妊娠第6天Tgfβ1杂合子小鼠几乎是野生型小鼠的三倍，导管细胞也显著高于野生型小鼠（表3）虽然导管和肺泡上皮的PCNA指数在两组中均较低Tgfβ1与妊娠第6天相比，妊娠第10天和第14天的杂合子和野生型乳腺增生Tgfβ1杂合子上皮仍然比野生型高2到3倍。
表3。
| 管道 | 肺泡 |
|---|
| 野生型 | 杂合子 | 野生型 | 杂合子 |
|---|
| %PCNA公司* | | | | |
| 第6天 | 3.7 (51/1363) | 6.7‡(75/1113) | 4.8 (53/1101) | 13.8§(131/952) |
| 第10天 | 3.2 (36/1966) | 5.3§（100/1950） | 1.3 (17/1877) | 4.6§(79/1830) |
| 第14天 | 2.0 (36/1903) | 6.3§（177/2507） | 2.8 (36/1835) | 5.1§(110/2517) |
| %隧道† | | | | |
| 第6天 | 0.6 (18/3178) | 1.9§(53/2750) | 0.7 (19/2899) | 2.5§(50/1979) |
| 第10天 | 1.2 (23/1842) | 1.3 (25/1926) | 1.1 (11/1033) | 0.9 (9/976) |
| 第14天 | 0.4 (8/1802) | 0.4 (16/2223) | 1.0 (10/997) | 1.7 (35/2026) |
| 肺泡面积 | 野生型 | | 杂合子 | |
| 第6天 | 5 | | 11 | |
| 第14天 | 11 | | 42 | |
令人惊讶的是，与青春期或动情期相比，在妊娠第6天，通过末端dUTP镍标记检测到的乳腺导管和肺泡上皮细胞的凋亡增加了三倍Tgfβ1杂合子与野生型乳腺相比。这种影响是短暂的，因为在妊娠后期，末端dUTP缺口末端标记阳性细胞的频率没有显著差异。早孕期细胞凋亡增加可能是由于未产妇成人组织中观察到的双重反应所提示的代偿机制，也可能表明TGF-β1在某些条件下可以作为生存因子。
卵巢激素诱导乳腺上皮Tgfβ1+/-表型
阶段特异性表型Tgfβ1null基因型使我们考虑TGF-β1的激活是否介导乳腺上皮对雌激素和孕激素的反应。如果是这样的话，人们会预测卵巢切除患者服用这些激素Tgfβ1与野生型小鼠相比，杂合子小鼠会导致增殖增加。52卵巢切除杂合子在增殖或凋亡频率上与野生型对照组无差异（未显示）。服用雌激素和孕酮3天后，细胞增殖增加了15倍以上TGFβ1为空杂合子小鼠与野生型乳腺的比较（7.7±4.2%SD与0.5±0.15%标准偏差）。雌二醇和孕酮治疗导致TGF-β1免疫反应，其中激活受到限制，但在上皮细胞亚群中显著（未显示）。因此，通过将去卵巢小鼠暴露于决定发情的卵巢类固醇激素，可以诱导增殖增加的表型和特定的免疫反应模式。
讨论
乳腺发育生物学涉及其各种细胞类型之间的复杂相互作用，因此，任何拟议机制的有效性都必须考虑到调节分子的生理状态和定位体内我们的免疫组化数据首次证明了TGF-β活化受到明显的细胞限制。定义TGF-β1介导的细胞事件就地，我们通过使用Tgfb1型并在其上进行组织重组实验。尽管有几项研究试图通过外源应用、组成活性蛋白或显性阴性受体的异位表达来解释TGF-β1的作用，但这是第一项确定乳腺内源性TGF-，因此具有重要的生理相关性。这些数据是新观察的基础，即激素调节差异性地控制乳腺内的激活，进而控制卵巢激素的增殖反应。通过证明雌激素和孕酮治疗去卵巢小鼠可诱导异质性激活和增殖表型，进一步支持了这一假设。将免疫定位与TGF-β1缺失表型相结合，从而为TGF-α1在乳腺生物学和癌症中的作用提供了细胞机制方面的见解。
TGF-β1相对免疫染色与成人增殖表型的关系示意图Tgfβ1+/−乳腺上皮作为发情周期的功能如图6所示在间期，静止上皮与青春期乳腺的远端导管相似，在野生型小鼠中显示出相对均匀的TGF-β1染色，并且在Tgfβ1+/−小鼠。在动情前期观察到的TGF-β1免疫反应性下降也与此模型一致，因为随着雌激素水平的升高，上皮细胞准备增殖。然而，该模型既不能预测发情期和其他增殖期（即青春期和妊娠期）乳腺上皮细胞亚群表现出强烈的TGF-β1免疫活性，也不能预测Tgfβ1+/−处于这些阶段的小鼠。生长抑制物在增殖期发挥作用的明显矛盾导致我们假设TGF-β1的限制性细胞激活抑制特定细胞对增殖刺激的反应。似乎TGF-β1的激活可能受到触发乳腺增生的相同事件的调节。这表明TGF-β1活性与卵巢激素信号转导之间存在关系。
发情周期中与卵巢激素相关的乳腺上皮TGF-β1免疫反应和增殖模式示意图。答：乳腺上皮中活性转化生长因子-β的特征模式表现为阴影条代表上皮TGF-β1的相对强度作为乳腺发育的功能。这种模式在增殖期是异质的，在静止期是相对均匀的。B类：在发情周期中，发情时高度异质的TGF-β1免疫反应与增殖增加和凋亡减少（未显示）的表型相关转铁蛋白β1+/−小鼠。雌激素的相对水平(虚线)和黄体酮(实线)绘制血清浓度和增殖指数转铁蛋白β1+/+和+/-乳腺上皮总结在下面的条形图中。TGF-β作为生长抑制物的作用与卵巢激素调节乳腺增生之间的功能联系得到了卵巢切除术的显著增殖反应的支持转铁蛋白β1+/−小鼠雌激素和孕酮。
这些数据导致了几个新的结论。首先，在发情周期中TGF-β1激活的高度限制模式表明，特定细胞在特定激素条件下激活TGF-α1。乳腺上皮在增殖、分化和激素反应性的众多标记物的表达方面是异质的。卵巢激素，雌激素和孕酮，通过位于某些细胞细胞核中的同源受体发出信号。53雌激素和孕酮水平的增加刺激了增殖高峰期。最近的研究表明，在小鼠和人类乳腺中，增殖细胞通常与表达雌激素或孕激素受体的细胞相邻，而不是相互协调。54事实上，这些作者假设生长抑制剂能够有效抑制激素受体阳性细胞对激素刺激产生的增殖信号作出反应。55我们的初步数据表明，在发情期表现出TGF-β1激活的细胞很少像人们预期的那样与增殖共存，但经常与类固醇激素核受体共存，支持TGF-β1激活和激素刺激之间的功能关系（K Ewan、G Shyamala和MH Barcellos-Hoff，手稿正在编写中）。
第二Tgfβ1+/−成年小鼠在发情期和妊娠期表现最为突出，表明TGF-β1活性限制了对激素刺激的增殖反应。卵巢切除术的显著反应支持了这一结论Tgfβ1+/−雌激素和孕酮给药。
第三，尽管TGF-β1总量在Tgfβ1隐性和活性TGF-β1免疫反应性的相对分布与野生型对照相似。这表明外部事件而非TGF-β1本身控制着TGF-α1的激活。我们认为TGF-β1激活的时空调控是乳腺生物反应的关键决定因素，这一观点也得到了表达组成活性TGF-转化生长因子-β第223页至第225页.56产生的表型转化生长因子-β第223页至第225页使用小鼠乳腺肿瘤病毒启动子的表达是一种暂时性发育不全的导管形态发生，25而由乳清酸蛋白驱动的肺泡发育则受到很大影响。51因促销员驱动的时间或本地化而产生的差异转化生长因子-β223–225乳腺中与内源性TGF-β1激活相关的表达因此导致不同的生物学效应。
第四，尽管在Tgfβ1杂合子小鼠，形态发生没有异常，表明增殖虽然增加，但没有错位。然后，该模型提供了一种分离TGF-β1在新细胞生成中的作用的方法与组织特异性重塑和组织。由于当TGF-β1严重缺乏时，形态发生没有受到明显影响，这表明TGF-与图案形成。为了测试TGF-β1的哪种细胞来源导致了Tgfβ1杂合子，我们通过相互移植Tgfβ1杂合子上皮转化为野生型基质和反之亦然.寄主是野生型还是转基因，Tgfβ1+/−上皮细胞形成的突起明显比野生型上皮移植更发达Tgfβ1杂合子基质和宿主。这些实验证明Tgfβ1杂合子乳腺增生表型独立于基质或系统因子，增殖的调节主要是由于上皮TGF-β。约瑟夫和同事48研究表明，使用金属硫蛋白启动子来驱动显性阴性TGF-βII型受体，减弱基质中对TGF-MMTV-LTR电视-启动子导致肺泡增生和过早的功能分化。47由于所有TGF-β信号都依赖于II型受体，显性-阴性模型抑制所有三种TGF-α1亚型，而我们的数据涉及TGF-γ1激活的位置和时间。总之，我们的数据表明TGF-β1激活和增殖反应的实质调节高度受限且离散。
最后，尽管TGF-β1在激素依赖性组织（如前列腺）中介导细胞凋亡方面发挥着重要作用57和子宫，58并被假定在乳腺中具有类似的功能，38、58我们的研究表明，在组织内环境稳定中发挥着有限而复杂的作用。一种转基因模型，其中组成型活性蛋白由乳清酸蛋白启动子驱动，导致发情期和妊娠期细胞凋亡增加。38此外，妊娠晚期和哺乳期TGF-β3的表达通过β-乳球蛋白启动子导致这些阶段的乳腺细胞凋亡。59在研究中使用Tgfβ1+/−小鼠从青春期到妊娠晚期，我们发现Tgfβ1+/−小鼠仅在发情期减少。最近有报道称，在远交系小鼠中，终芽的凋亡率为2%至3%，46这被认为是管腔形成所必需的。我们的数据表明，管腔的形成不需要TGF-β1，因为杂合子和野生型同卵双胞胎的终芽凋亡频率相似。相反，细胞凋亡在Tgfβ1+/−发情前和妊娠早期的上皮细胞，表明存在稳态代偿机制，或TGF-β1作为乳腺上皮细胞生存因子的直接或间接作用。38,60因此，我们的数据与TGF-β1作为促凋亡剂的作用是一致的，但方式有限，即仅在发情期，并增加了其作为重要生存因子的可能性。
TGF-β1广泛地与乳腺癌有关。11,18,61-63最近的证据表明转化生长因子β1增加血清TGF-β水平以降低女性乳腺癌发病率的多态性。64此外，各种报告将TGF-β1的激活与培养的乳腺癌细胞中的雌激素和孕激素治疗联系起来，65以及抗雌激素三苯氧胺的作用。66我们和其他人认为，在乳腺癌进展过程中，从TGF-β1生长敏感性到TGF-α1耐药性的转变是建立恶性行为的关键时刻。7,21当TGF-β1活性升高时，如在受伤或辐射暴露后，基因组多样性人群中的阳性选择可能会产生对TGF-α1耐药的肿瘤细胞。这一假设的前提是，虽然潜在的TGF-β1丰富，但TGF-α1的活性通常受到其激活的严格调控，从而限制了抗性的选择压力。目前的研究首次显示这种限制性激活，并将这些事件与卵巢激素功能联系起来就地未来研究的重点将是确定在特定的细胞和生理环境下，哪些行为占主导地位。我们正在进行的研究探讨了正常乳腺中潜在TGF-β1激活的机制，并进一步探讨了TGF-α1活性的失调如何导致乳腺癌的发生。
致谢
我们感谢Mina J.Bissell博士、Carlos Ortiz De Solorzano和Joel Chassis博士的有益讨论，感谢Kevin Benson先生的技术支持。
脚注
向M.H.Barcellos-Hoff，Life Sciences Division，Bldg.74-174，1 Cyclotron Rd.，Lawrence Berkeley National Laboratory，Berkeley，CA 94720发送转载请求。电子邮件：.vog.lbl@ffoh-sollecrabhm
由加州乳腺癌研究计划（拨款4BP-0136）、NIH CA66541（发给G.S.）和美国能源部健康影响研究司健康与环境研究办公室（合同编号DE-AC-03-76SF00098）支持。
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