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氧化还原生物。2016年12月；10: 140–147.
2016年9月30日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.redox.2016.09.016
预防性维修识别码：PMC5065648
PMID：27744119

氧化应激和Rho激酶途径介导脓毒症存活大鼠血管功能受损

普里西拉·德苏扎,一 卡拉·洛伦娜·瓜里多,b条 卡琳·谢肖维奇,b条 路易斯·莫塔·达席尔瓦,一 玛丽亚·费尔南达·沃纳,一 Jamil Assreoy公司,b条和何塞·爱德华多·达席尔瓦·桑托斯b、，⁎
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

我们研究了盲肠结扎和穿孔（CLP）模型诱导的严重脓毒症存活成年大鼠内皮和血管功能的长期变化。为此，雄性Wistar大鼠（200-350克）用14号针头将盲肠穿刺一次（非转移孔）。通过这种方法，在最初的72小时内，死亡率达到30%左右。幸存者和年龄匹配的对照大鼠（未接受CLP治疗）在我们的饲养室中饲养60天（S60组），并对降主动脉进行功能、组织学、生化或分子分析。与对照组血管相比，从败血症存活的S60组获得的内皮完整的主动脉环显示血管紧张素II诱导的收缩增加，同时内源性超氧化物歧化酶活性降低，活性氧生成增加，酪氨酸硝化水平增加。超氧化物清除剂超氧化物歧化酶和天门冬氨酸，以及抗氧化剂apocynin，能够避免S60组主动脉环对血管紧张素II的收缩性增强。此外，S60组的主动脉环对Rho激酶（ROCK）抑制剂Y-27632的敏感性降低。免疫印迹分析显示S60大鼠血管中RhoA和ROCK II增强，肌球蛋白磷酸酶靶亚基1磷酸化水平较高。总之，脓毒症存活大鼠的主动脉环显示出内皮功能障碍，这是由活性氧生成增加介导的，从而降低一氧化氮的生物利用度，增加过氧亚硝酸盐的形成，并增强RhoA-ROCK介导的钙敏感性，导致对血管紧张素II的收缩反应增强。值得注意的是，这是首次证明脓毒症存活大鼠血管系统长期功能障碍的研究，这种功能障碍发生于或持续于急性脓毒症损伤之后。

缩写：AII，血管紧张素II；自动变速箱1R、 血管紧张素Ⅱ1型受体；过氧化氢酶；盲肠结扎和穿孔；CT，控制；二氢乙锭；GSH，还原型谷胱甘肽；GST、谷胱甘肽S公司-转移酶；LOOH，脂质过氧化氢；肌球蛋白轻链磷酸酶亚基1 MYPT-1；Nox、NAD（P）H氧化酶；RNS，活性氮物种；ROCK，Rho激酶；活性氧；60系列，存活60天；SOD、超氧化物歧化酶
关键词：血管张力、钙敏感性、NAD（P）H氧化酶、败血症休克

集锦

  • •
    败血症存活大鼠的血管对血管紧张素II产生增强的收缩反应。
  • •
    超氧化物清除剂超氧化物歧化酶和tempol可以避免这种高反应性。
  • •
    血管紧张素II在这些血管中产生的活性氧增强。
  • •
    脓毒症存活大鼠的血管显示酪氨酸硝化程度增加。
  • •
    败血症存活大鼠主动脉中RhoA-Rho激酶途径的活性增强。

1 介绍

尽管脓毒症具有急性性质，但几项流行病学调查显示，与从未发生过脓毒症的年龄匹配的患者相比，那些在严重脓毒症或脓毒症休克发作后幸存下来的患者的死亡率要高得多[1],[2]例如，Quartin等人（1997年）发表的一项开创性研究表明，在他们的研究中评估的1505名脓毒症幸存者中，80%在8年内死亡[3]虽然这些发现清楚地表明，脓毒症的单次发作预示着几年内死亡风险的增加，但对脓毒症后发生的生理和/或病理事件仍知之甚少。值得注意的是，尽管一些研究已经证实脓毒症幸存者的预期寿命下降[4],[5],[6],[7],[8]，该领域的大多数动物研究仅集中在败血症诱导后的最初几个小时或几天进行，很少有关于长期认知缺陷的研究例外，主要涉及学习和记忆障碍[9],[10],[11].

众所周知，败血症会抑制心血管系统的功能。这包括血管无法保持张力和出现系统性低血压，这导致一些组织的血液灌注和氧合不足，并在多器官功能障碍中起主要作用[12]有趣的是，如果一方面已有的心血管疾病被证明有助于感染性休克患者心力衰竭的进展和更高的死亡率[13]另一方面，最近的临床数据显示，严重脓毒症幸存者患心血管疾病的风险增加，包括心肌梗死和中风[14]在这方面，我们假设，尽管恢复了正常血压，但严重脓毒症幸存者的血管生物学仍会长期受损。

据我们所知，我们的研究是少数几个评估30天以上脓毒症晚期后果的研究之一，也是首次探索血管系统长期功能障碍的研究。在这里，我们提出了一个长期内皮和血管功能障碍的动物模型，该模型可以被描述为脓毒性损伤的后遗症。研究结果还表明，NAD（P）H氧化酶衍生活性氧（ROS）和活性氮（RNS）以及RhoA/Rho相关蛋白激酶（ROCK）信号通路有助于血管紧张素II（AII）在脓毒症存活大鼠血管系统中诱发超压缩性。

2 材料和方法

2.1. 脓毒症动物及实验模型

实验中使用了巴拉那联邦大学（UFPR，库里蒂巴，PR，巴西）提供的200只雄性Wistar大鼠（3个月）。本研究中描述的所有程序均按照美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》进行[15]UFPR机构动物护理和使用委员会（授权号527）批准。根据Rittirsch及其同事的说法，盲肠结扎和穿刺（CLP）模型中使用的方案得到了遵守[16]，稍作修改。用氯胺酮/甲苯噻嗪（100/20 mg/kg，ip）麻醉大鼠。在腹部进行皮肤中线切口，暴露盲肠并结扎盲肠（占盲肠的75%）。由于该模型中获得的死亡率完全取决于所用针头的大小和在盲肠中进行的穿刺次数（补充结果–图S1)，本研究中使用的动物用14号针头将盲肠刺穿一次（非转移孔）。从穿刺处排出少量粪便，以确保肠道内容物泄漏，切口分层闭合，缝合腹部肌肉和皮肤。最后，所有动物通过注射无菌盐水溶液（3 mL/100 g，皮下注射）进行术后液体复苏，以防止脱水。通过这种方法，在最初72小时内，死亡率达到30%左右（补充结果-图S1，1孔14-量规组）。幸存者(n个=88），以及年龄匹配的对照（CT）大鼠（未进行CLP；n个=90），在控制条件下（12/12小时光暗循环，温度22±2°C），在我们的储藏室中保存30天，可自由进食和饮水（S30组；n个=12）或60天（S60组；n个=76). 在选定的时间点，对动物进行氯胺酮/甲苯噻嗪（100/20 mg/kg，ip）诱导的全身麻醉，并仔细切除降主动脉，清除结缔组织，进行功能、组织学、生化或分子分析。

2.2. 器官浴的功能研究

在这些实验中，主动脉被安装在经典的器官浴中，通过等距传感器测量收缩力的产生。有关组织分离和实验设计的细节，包括添加药理学工具，详见补充方法。

2.3. 免疫印迹分析

AT的蛋白质水平1如前所述，通过Western blot分析评估CT和S60组主动脉中的受体Rho-A、ROCK-I、ROCK-II、总MYPT-1和磷酸化MYPT-1[17]并在补充方法中提出。

2.4. 氧化应激的生化分析

对CT组和S60组的主动脉样本进行处理，以测定脂质过氧化氢（LOOH）水平[18]，还原型谷胱甘肽（GSH）含量[19]，以及用于测量超氧化物歧化酶（SOD）的活性[20],[21]，过氧化氢酶（CAT）[22]和谷胱甘肽S-转移酶（GST）[23]此外，在显微镜载玻片中分配主动脉切片，并装载二氢乙硫酸氢钠（DHE），有或没有暴露于血管紧张素II（40 nM），以评估活性氧生成。将不同的载玻片与硝基酪氨酸的一级抗体孵育，然后与藻红蛋白偶联的二级抗体培养，以检测酪氨酸硝化。补充方法中介绍了每组实验所遵循的步骤。

2.5. 统计分析

结果表示为平均值±平均值标准误差（S.E.M.）。使用双向方差分析（ANOVA），然后使用Bonferroni的后验或Student的t吨-测试（如适用）。A类第页值小于0.05被认为具有统计学意义。使用适用于Mac的GraphPad Prism版本6绘制图表并进行统计分析（GraphPad-Software，La Jolla，CA，USA）。

三。 结果

3.1. 标准对照组和实验组

初步数据显示，在盲肠结扎和穿孔（CLP）手术后6小时，动物发生脓毒症(n个=12）出现毛发长出、卟啉分泌（眼睛和鼻子）和嗜睡，以及白细胞减少、血小板减少和粒细胞增多、血硝酸盐和亚硝酸盐水平高（表明一氧化氮生成加剧）、低血压，体内外对血管收缩剂均无效，证实CLP模型诱导严重脓毒症常见几个方面的能力。这些体征均未在假手术或年龄匹配的对照动物中记录（CT组；数据未显示）。重要的是，所有存活至CLP的动物在5天后完全恢复，并且在60天的随访中与CT动物保持一致，包括体重、水和食物消耗等参数（补充结果-表S1).

3.2. AII诱导脓毒症存活大鼠血管收缩增加

为了探讨我们的假设，即脓毒症存活大鼠存在血管反应性的长期变化，我们在器官浴中测试了胸主动脉，以了解血管生物学研究中常用的血管活性剂所诱导的收缩力的发展。与CT大鼠的血管相比，S60组获得的主动脉环对乙酰胆碱、硝普钠、KCl、苯肾上腺素和血管紧张素I的反应性没有任何差异（补充结果-图S2). 然而，S60组内皮完整的主动脉环中AII累积浓度诱导的收缩效应显著增加(图1A） ●●●●。例如，当最后添加3μM浓度时，AII诱导的血管张力最大增加在CT组和S60组分别为0.65±0.08至1.26±0.16 g。同样，非累积添加3μM AII使CT组和S60组的主动脉环收缩力分别增加0.58±0.14和1.22±0.09 g，表明AII累积浓度诱导的最大效应并未因速发型反应而降低。

图1。

增强AII诱导的败血症存活大鼠主动脉血管收缩和AT的参与1受体。在CLP后60天，从对照动物（CT；年龄匹配的幼年大鼠）或败血症存活大鼠（S60）获得血管，如各面板所示。AII诱导A）内皮完整的大鼠主动脉环收缩，B）内皮剥脱的大鼠动脉环收缩，C）之前用我-NAME（100μM），D）和E）内皮完整的大鼠主动脉环，之前与溶媒或AT孵育1R拮抗剂氯沙坦。F） AT水平的代表性图像和密度分析（以任意单位A.U.表示）1CT组和S60组主动脉中的R蛋白。结果显示，每组6至8只动物（A至E组）或每组4只不同动物（F组）的样品的平均±SEM。通过双向方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后进行Bonferroni的后验（面板A-E）或未配对学生t吨-测试（面板F）。*指示第页与各CT组相比<0.05。

我们的实验没有发现S30组和其各自CT组的主动脉环之间的血管反应性有任何差异（补充结果-图S3). 为此，本研究的下一步仅针对S60组的动物进行。

3.3. 缺乏内皮清除的影响以及一氧化氮合酶（NOS）抑制对脓毒症存活大鼠AII诱导的主动脉环收缩的影响

仅在内皮完整的主动脉环中发现对AII的反应性增加(图1A） 由于内皮层的机械损伤对S60组AII诱导的血管收缩完全没有影响(图1B） ●●●●。另一方面，与NOS抑制剂孵育我-NAME提高了CT组和S60组主动脉环对AII的收缩反应(图1C） ●●●●。

3.4. 血管紧张素II 1型受体（AT1R） AII对脓毒症存活大鼠主动脉的增强作用

在CT组和S60组中，氯沙坦将AII诱导的收缩降低到类似水平(图1D和E）。然而，CT组和S60组主动脉的Western blot分析并未显示AT蛋白水平的任何差异1R（右）(图1F） ●●●●。

3.5。脓毒症存活大鼠主动脉无组织学改变

如补充图S5CT组和S60组的组织学切片均无形态学改变、炎症细胞迁移、水肿、肥大或胶原沉积的信号。

3.6. 脓毒症存活大鼠血管内源性抗氧化机制的损伤

尽管过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽的活性没有差异S公司-S60组主动脉匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）活性降低45%。此外，与CT组相比，谷胱甘肽（GSH）和脂质过氧化氢（LOOH）水平分别增加了98%和24%(表1)表明S60组血管内源性抗氧化机制受损。

表1

败血症存活大鼠主动脉中抗氧化系统受损。

对照组60系列
脂质过氧化氢（µmol/mg蛋白质）11.2±0.513.9±1*
还原型谷胱甘肽（微克/克组织）277.2±54.6548.9±107.5*
超氧化物歧化酶（U/mg蛋白质）28.8±315.8±0.8*
过氧化氢酶（µmol/min/mg蛋白质）5.6±0.44.7±0.6
谷胱甘肽S公司-转移酶（nmol/min/mg蛋白质）429.3±63.6432.6±79.8

数值显示平均值±S。每组6–8个样本的E.M.，取自不同的动物。使用Student’st吨-测试。S60组，CLP后60天败血症存活的大鼠。

*指示第页与相应的对照组（年龄匹配的幼稚动物）相比，<0.05。

3.7. 超氧化物清除剂避免AII诱导的脓毒症存活大鼠主动脉环收缩

为了确定内源性抗氧化剂和ROS生成之间的失衡是否有助于增加AII的收缩效应，我们在外源性超氧物清除剂和抗氧化剂的存在下进行了功能性实验。用SOD或tempol（一种SOD模拟物）孵育主动脉环并没有改变CT动物血管中AII的收缩作用，但消除了S60组制剂中AII高反应性(图2A–D）。类似地，常用的NAD（P）H氧化酶抑制剂apocynin可以防止S60组主动脉对AII的反应加剧，而不会改变AII诱导的CT血管收缩(图2E和F）。

图2。

罗布青素、SOD和天普醇对脓毒症存活大鼠主动脉环AII增强收缩作用的抑制作用。从对照组（CT组；左侧面板）或败血症存活大鼠（S60组；右侧面板）获得的主动脉环在与超氧化物歧化酶（SOD；A和B）、tempol（C和D）或apocynin（E和F）孵育后评估其对AII的反应性。为了进行比较，在先前与载体孵育的CT组和S60组的主动脉环中测量AII的收缩效应（闭合圈）。结果显示，每组4至6只动物获得的制剂的平均±SEM。通过双向方差分析（ANOVA）和Bonferroni的后验进行统计分析。*指示第页与相应的车辆治疗组相比，<0.05。

3.8. 脓毒症存活大鼠主动脉氧化和亚硝化应激增强

使用荧光探针氢乙锭（DHE）的实验表明，尽管基础水平不变，但与CT组相比，S60组在AII刺激下的血管ROS生成增加（高达30%）(图3A和B），强化了败血症存活大鼠血管中氧化剂状态增加的假设。由于超氧阴离子可能很容易与NO相互作用形成强RNS过氧亚硝酸盐，我们评估了S60组主动脉中存在的硝基酪氨酸的数量，作为接触过氧亚硝基的指标。值得注意的是，与CT动物样品相比，S60组的主动脉酪氨酸硝化程度增加了3倍以上，表明脓毒症存活大鼠血管中过氧亚硝酸盐的生成加剧(图3C和D）。

图3。

败血症存活大鼠主动脉中ROS和RNS水平升高。A） 在CLP（S60）受载体或血管紧张素II刺激后60天，对照组（CT）和败血症存活大鼠主动脉切片中用荧光染料氢乙锭（DHE）获得的相对荧光强度的代表性图像和B）分析，如面板内所示。C） CLP（S60）后60天，对照组（CT）和败血症存活大鼠主动脉切片中硝基酪氨酸荧光抗体检测到的酪氨酸硝化相对荧光强度的代表性图像和D）分析。右图中的蓝色代表用霍斯切斯特蓝染色的细胞核。使用x40的放大倍数获取图像。结果显示，每组4只不同动物的样品平均±SEM。统计分析由未配对学生的t吨-测试。纳秒表示不重要；#指示第页与仅接触车辆的S60组相比，<0.05；*指示第页与各CT组相比<0.05。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本。）

3.9. ROCK抑制剂Y-27632降低AII诱导的脓毒症存活大鼠主动脉收缩作用

为了探讨AII诱导脓毒症存活大鼠血管超缩的可能机制，我们在功能实验中使用选择性ROCK抑制剂Y-27632。对Y-27632在S60动物的苯肾上腺素收缩性主动脉环中诱导的舒张作用的分析显示，该药物的累积浓度-反应曲线平行向右移动，相应地增加了一半最大有效浓度（EC）50)CT组和S60组分别从0.43（0.33–0.55）µM松弛到1.03（0.76–1.40）µM(图4A） ●●●●。此外，CT动物的主动脉环在与0.3µM Y-27632孵育后对AII的反应性降低了60%(图4B） ，但相同浓度的ROCK抑制剂在S60组的血管中没有起到同样的作用(图4C） ●●●●。重要的是，1µM Y-27632预防了CT组和S60组AII诱导的收缩（数据未显示）。

图4。

败血症存活大鼠主动脉环对ROCK抑制剂Y-27632的敏感性降低，RhoA/Rho激酶途径成分水平增加。在CLP后60天，从对照动物（CT；年龄匹配的幼年大鼠）或败血症存活大鼠（S60）获得血管，如各面板所示。A） Y-27632在内皮完整的主动脉环中诱导的舒张作用。B） 和C）血管紧张素II分别诱导CT组和S60组内皮完整的主动脉环收缩，之前用载体或ROCK抑制剂Y-27631孵育。结果显示，每组4至6只动物获得的制剂的平均±SEM。通过双向方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后使用Bonferroni的post吨-测试。*指示第页与各车辆治疗组相比<0.05；#指示第页与CT相比<0.05。CT和S60组主动脉中D）RhoA，E）ROCK I，F）ROCK-酶分析方法II，G）MYPT-1，H）pMYPT-1（Thr697）和I）pMYPT-1（Thr855）的代表性图像和密度分析。结果表明，每组4-6个样品或制剂的平均±SEM来自不同的动物。通过双向方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后进行Bonferroni的后验（面板A-C）或未配对的Student’st吨-测试（面板D–I）。*指示第页与相应的对照组相比，<0.05。

3.10. 脓毒症存活大鼠主动脉中Rho-A、ROCK II和磷酸化MYPT-1的表达增加

免疫印迹数据显示S60组主动脉中RhoA的表达显著增加(图4D） ●●●●。此外，与CT组相比，S60组主动脉ROCK II水平增加(图4F） ，ROCK I没有任何变化(图4E） ，或MYPT-1总计(图4G） ●●●●。RhoA/ROCK系统因其通过肌球蛋白磷酸酶靶亚基1（MYPT-1）磷酸化抑制肌球蛋白磷酸酯酶活性而被称为钙致敏途径[24]特别地，我们的结果揭示了MYPT-1在Thr-855处的过度磷酸化(图4一） ，但不是在Thr-697(图4H） 在S60组获得的主动脉匀浆中。

4 讨论

我们研究中的第一个重要发现是，尽管脓毒症引起的血管功能障碍得到了恢复，CLP手术后30天没有可检测的异常，但脓毒症存活大鼠的主动脉环在脓毒症损伤后60天对AII的收缩反应增强。虽然这些数据不能用来说明脓毒症存活大鼠的整个血管系统对AII诱导的收缩更敏感，但主要针对阻力血管的其他研究仍有待开展，在S60组获得的内皮完整的颈动脉环中，AII诱发的收缩反应也增强（补充结果-图S4)表明这种对AII的高反应性不仅发生在主动脉中，也发生在其他传导血管中。

α选择性激动剂苯肾上腺素的作用缺乏变化1安培-肾上腺素受体，提示血管对AII反应性的损害可能与AT的调节变化有关1或AT2血管系统中的受体。事实上，AT的表达增加1R在动物和人类的几种心血管疾病中都有描述[25]、和AT2受体因其对抗AT激活的反调节作用而广为人知1受体[26]在我们的实验中发现的选择性拮抗剂氯沙坦的抑制作用清楚地表明，S60组主动脉对AII的反应性增强完全依赖于AT的激活1R.值得注意的是，我们没有发现AT水平的差异1与CT组的样本相比，S60组主动脉中R的数据表明，增强AII诱导的S60组血管收缩与这些受体的增强表达无关，而是完全依赖AII诱发的细胞内信号。

生理上，血管的张力是通过调节血管扩张或收缩的激素和旁分泌因子之间的严格平衡来维持的。在这些因素中，主要由内皮细胞通过内皮型一氧化氮合酶（eNOS）产生的一氧化氮被认为是血管张力的主要调节因子[27]我们的数据显示，去除内皮细胞完全无法改变S60组主动脉环对AII的血管反应性，尽管这种方法在对照制剂中能够增加血管对收缩剂的反应性（如我们的CT组所示），提示S60组主动脉内皮功能受损。有趣的是，通过我-NAME提高了CT组和S60组主动脉环的血管反应性，表明NO的产生和在血管张力控制中的作用至少部分维持在S60组的血管中，这一发现可能解释了为什么乙酰胆碱诱导的舒张在这些血管中没有受损（补充结果-图S2A). 重要的是，许多临床研究已将内皮功能障碍和NO生物利用度的降低描述为心血管风险的重要预测因子[28],[29].

几种机制可能导致血管系统中NO的生物利用度降低，包括eNOS的表达减少、二聚化或激活[30]以及氧化应激增强的分解作用[31]然而，值得注意的是，S60组血管内皮功能受损完全依赖于血管紧张素II的刺激。现在已经确定AT1受体主要位于内皮细胞中，可能与膜相关的NAD（P）H氧化酶（Nox）酶偶联，刺激血管中超氧物的产生。值得一提的是，之前的几项研究将AII诱导的内皮功能障碍和高血压与血管系统中的超氧化物生成联系起来[32]考虑到超氧物与NO相互作用并使NO失活，主要是在内皮细胞中，与SOD或SOD模拟tempol或apocynin孵育后，S60组AII诱导的主动脉环血管收缩正常化，以及AII刺激的主动脉中荧光染料DHE增加的氧化应激的证据，我们研究的第二个最重要的发现是败血症存活大鼠的主动脉环出现内皮功能障碍，其特征是超氧阴离子生成增加，以及AII刺激时NO生物利用度的推定降低。虽然我们的结果不允许我们清楚地说明这一过程中涉及的分子机制，但S60组主动脉匀浆中SOD活性（或可用性）的降低可能是主动脉中超氧物积累的部分原因。

SOD是内源性抗氧化系统的主要参与者。这种酶催化超氧化物阴离子歧化为过氧化氢，而过氧化氢又与许多酶反应，包括过氧化氢酶、过氧化物酶类、谷胱甘肽和过氧化物酶，以及在细胞功能氧化还原控制中起主要作用的细胞含硫化合物[33]任何ROS的产生受损和/或氧化还原稳态的破坏都会导致氧化应激，促进或放大炎症过程[34]，血小板聚集[35]基质金属蛋白酶活性[36]血管平滑肌的增殖[37]等等。虽然我们没有探索任何这些可能性，但在脓毒症存活大鼠主动脉中发现的氧化应激的一个后果是脂质过氧化增强，这可以诱导膜脂的氧化降解[38]LOOH水平的增加证明了这一点。在我们的实验中，我们没有探索谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘蛋白还原酶等酶的活性，也没有探索氧化谷胱甘苷（GSSH）的水平，但S60组主动脉中测得的较高数量的还原性谷胱甘素（GSH）与GST活性的变化无关，证实了受损的氧化还原状态，并可能与一种代偿机制有关，以保护这些血管免受氧化损伤。例如，许多研究表明，负责谷胱甘肽合成的谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达对氧化应激敏感[39],[40],[41]尽管脓毒症创伤后早期（即脓毒症30天后）血管对血管紧张素II的反应性没有变化；补充结果-图S3F)脓毒症幸存者血管氧化应激标志物的变化值得研究，因为氧化还原状态的早期变化可能在脓毒症后60天发现的血管功能障碍的发展中起关键作用。

超氧物的积累解除了其与NO的扩散控制反应，降低了NO的生物利用度，并增加了过氧亚硝酸盐（一种高活性氧化和硝化剂）的生成。血管中过氧亚硝酸盐水平的长期升高被认为是多种心血管疾病发展的重要机制，包括中风、心肌梗死、慢性心力衰竭和循环性休克[42]因此，随着我们实验中发现的酪氨酸硝化作用的增加，可以合理地得出结论，S60组的主动脉产生的超氧物增加，导致内皮源性NO的过度抑制和过氧亚硝酸盐的积累。过氧亚硝酸盐以前与糖尿病大鼠冠状动脉RhoA活性的显著增加有关[43]此外，LPS刺激后，过氧亚硝酸盐介导RhoA中Tyr-34的硝化作用导致人肺微血管内皮细胞中RhoA活性增加2倍[44]RhoA是一种在多种细胞中表达的小G蛋白。重要的是，RhoA及其下游效应器ROCK介导AII的几种效应[45]在RhoA刺激后，ROCK磷酸化肌球蛋白轻链磷酸酶（MYPT-1）的调节亚单位1，抑制该酶[46]为此，RhoA/ROCK途径通常被描述为钙敏感系统，是健康和疾病中血管张力的重要调节器[24]我们研究中揭示的第三个要点是，RhoA/ROCK途径在S60组的血管中更为活跃，正如我们在器官浴中的功能实验中发现的对ROCK抑制剂Y-27632的敏感性降低、RhoA和ROCK II的蛋白质水平增加以及磷酸化MYPT-1的增强所表明的那样，正如Western-blot分析检测到的那样。有趣的是，在S60组中发现，大鼠Thr-855处MYPT-1的磷酸化与激动剂刺激后RhoA/ROCK途径介导的肌源性反应相关，与Thr-697处的磷酸化无关[47]RhoA/ROCK通路的异常激活以前与细胞骨架重组、局部粘附和血管平滑肌细胞在几种心血管疾病发生过程中的迁移有关。我们没有发现S60组败血症存活大鼠主动脉环存在组织学、形态学或炎症相关损伤的任何证据。然而，考虑到RhoA/ROCK途径的活性增强、对AII的反应性增强、本研究中描述的ROS和RNS相关的内皮功能障碍，以及这些因素与几种心血管疾病之间的假定关系，脓毒症后后期或特定血管床中组织学变化的发展，包括但不限于血管重塑，值得进一步考虑。

总之，这是首次研究表明脓毒症存活大鼠存在血管系统的长期损伤，包括内皮功能障碍，其特征是超氧化物生成增加和过氧亚硝酸盐生成增加。这种氧化和亚硝化环境可能有助于RhoA/ROCK途径活性的增强，而RhoA/ROCK通路在增强对AII的反应性方面起着主要作用，还有其他潜在的有害影响有待研究。重要的是，脓毒症侮辱期间发生的急性事件以及导致血管功能晚期变化的原因仍有待确定。此外，还必须使用体外和体内方法进行额外的研究，包括更长的时间，以研究脓毒症侮辱后心血管系统的行为。

基金

这项工作得到了圣卡塔里纳保护基金会（FAPESC，SC，巴西；TR2012000367和TR201200078）的资助。Priscila de Souza获得了Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior（巴西CAPES）的博士学位。

利益冲突

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

脚注

附录A与本文相关的补充数据可以在在线版本中找到，网址为doi:10.1016/j.redox.2016.09.016.

附录A。 补充材料

补充材料

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文章来自氧化还原生物学由以下人员提供爱思维尔