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生物化学杂志。2014年2月21日；289(8): 4710–4722.
2014年1月7日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M114.547596型
预防性维修识别码：PMC3931033型
PMID：24398689

脂多糖诱导的肺损伤涉及硝化介导的RhoA活化*

鲁斯兰·拉菲科夫，‡ 克里斯蒂安娜·迪米特罗普洛，‡ 索拉巴·阿加瓦尔，‡ Archana Kangath公司，‡ 克里斯汀·格罗斯，‡ 丹尼尔·帕尔多，‡ 施卢蒂·沙尔玛，‡ 阿格涅斯卡·杰齐尔斯卡·杜特尔，‡ 维杰·帕特尔，§ 康妮·斯奈德，‡ 鲁道夫·卢卡斯，† 亚历山大·弗林，† 大卫·富尔顿，‡ 约翰·D·卡特拉瓦斯，‡和斯蒂芬·M·布莱克‡,1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

背景：RhoA的激活是急性肺损伤（ALI）的关键事件，但硝化在这一过程中的作用尚未解决。

结果：RhoA在Tyr的硝化作用34产生类似全球环境基金的构象变化，通过降低GDP结合来刺激RhoA。

结论：我们已经确定了RhoA激活的一种新机制。

意义：防止RhoA硝化可能有助于ALI的治疗。

关键词：肺损伤，翻译后修饰，蛋白质结构，重组蛋白表达，氧化还原调节，超氧化物离子，酶学

摘要

急性肺损伤（ALI）的特点是内皮细胞通透性增加。蛋白质硝化参与LPS暴露小鼠的内皮屏障功能障碍。然而，这一过程中涉及的硝化蛋白尚未确定。小GTPase RhoA的激活是LPS相关屏障破坏的关键事件。因此，在本研究中，我们评估了RhoA硝化在该过程中的可能作用。质谱鉴定出一个硝化位点，位于Tyr34在RhoA中。提尔34位于靠近核苷酸结合位点的开关I区域内。利用这种结构，我们开发了一种名为NipR1的肽(n个硝化作用我抑制的第页肽R（右）hoA公司1)保护Tyr34防止硝化。TAT融合的NipR1可减弱LPS激发的人肺微血管内皮细胞中RhoA硝化和屏障破坏。此外，NipR1治疗小鼠可减轻ALI小鼠模型中的血管渗漏和炎性细胞浸润，并保持肺功能。分子动力学模拟表明，Tyr34硝化刺激RhoA活性是通过Switch I区域内构象变化引起的与蛋白质结合的GDP减少，模拟RhoA与鸟嘌呤核苷酸交换因子结合时观察到的构象变化。采用停流动力学分析来证实这一预测。因此，我们确定了硝化介导的RhoA活化参与LPS介导的内皮屏障功能障碍的新机制，并显示了“屏蔽”肽在ALI治疗中防止RhoA硝化的潜在用途。

关键词：肺损伤，翻译后修饰，蛋白质结构，重组蛋白表达，氧化还原调节，超氧化物离子，酶学

介绍

急性肺损伤（ALI）2和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）表现出相同的疾病谱，由血管通透性增加的急性肺部炎症定义。ALI/ARDS均以非心源性肺水肿所致低氧性呼吸功能不全为特征。ALI患者出现PaO2/FiO公司2小于300毫米汞柱，而ARDS患者有PaO2/FiO公司2小于200毫米汞柱(1). 尽管进行了大量研究，但ALI/ARDS的治疗进展缓慢且不足。低容量机械通气治疗ALI/ARDS患者是目前唯一经证实的治疗方法(2)死亡率仍然高得令人无法接受。ALI/ARDS的主要原因是革兰氏阴性菌外膜过度释放LPS(三). 随后肺泡-毛细血管屏障的破坏导致肺泡淹水和肺泡腔内液体和蛋白质的积聚，损害气体交换并引发呼吸窘迫。LPS暴露与NO和超氧物的过度生成有关，导致过亚硝酸盐和蛋白质硝化的形成(4，5). 细胞蛋白硝化的全球上调与各种疾病的病理生物学有关(6，–9)我们已经证明，用过氧亚硝酸盐清除剂预处理可以减少小鼠LPS诱导的肺水肿，这表明蛋白质硝化在ALI进展中起着关键作用(5). 过氧亚硝酸盐是一种强大的硝化剂，可以通过在酪氨酸芳香环的间位碳上添加硝基来改变蛋白质的结构和功能(10). 酪氨酸硝化使pK（K）一朝向更电离的状态，在修饰的酪氨酸上引入负电荷。局部蛋白质微环境的这种变化会影响蛋白质的结构-功能关系，进而改变蛋白质的活性。

Rho蛋白家族的小GTPases，RhoA、Rac1和Cdc42，是肌动蛋白细胞骨架的关键调节因子(11). Rac1和RhoA对肺内皮屏障功能有拮抗作用(12，13). Rac1是内皮连接组装和成熟所必需的，而RhoA通过增加细胞膜的等长张力来破坏内皮连接(14)随后增加肌球蛋白驱动的收缩力。RhoA和Rac1信号之间平衡的破坏可能导致包括ALI/ARDS在内的多种人类疾病。已经证明Rho家族蛋白的活性可以通过翻译后修饰（包括脱酰胺）进行调节(15)和谷氨酰胺转胺(16)从而激活Rho蛋白或ADP-核糖基化(17)，葡萄糖基化(17)，腺苷酸化(18)和磷酸化(18)导致失活。然而，关于硝化作用在LPS激发期间对小GTP酶活性的作用，目前还很少有信息。因此，在本研究中，我们研究了蛋白质硝化在LPS诱导RhoA活化中的作用。我们的数据阐明了一种新的机制，即LPS介导的RhoA硝化增加通过核苷酸循环的改变导致GTPase活性增强。此外，我们在RhoA（Tyr34)并表明，基于该序列的屏蔽肽策略可减弱培养物和小鼠肺中LPS介导的血管屏障功能障碍。

材料和方法

人肺微血管内皮细胞的分离

如前所述，分离和培养人肺微血管内皮细胞（HLMVEC）(19).

Western Blot分析

HLMVEC在6000×克，并按照前面的描述收集上清液(20，21). 细胞提取物在4–20%凝胶上分离，电泳转移到PVDF膜（Bio-Rad），然后用5%脱脂奶粉在Tris缓冲盐水中封闭。用RhoA（细胞信号）、eNOS（BD Biosciences）或3-硝基酪氨酸（Calbiochem）抗体探测膜。在柯达440CF图像工作站上使用化学发光（Pierce）显示反应带。使用柯达一维图像处理软件量化波段强度。通过复制小鼠抗β-肌动蛋白使蛋白质负荷正常化。

免疫沉淀分析

HLMVEC在免疫沉淀缓冲液（25 m）中均质米Hepes，pH 7.5，150米米氯化钠，1%Nonide P-40，10 m米氯化镁2，1米米EDTA，2%甘油补充蛋白酶抑制剂）。为了沉淀结合的蛋白质，在4°C下加入10μl蛋白质a/G琼脂糖悬浮液（EMD/Calbiochem）2小时。然后将样品以14000 rpm离心5 min，去除上清液，并用免疫沉淀缓冲液将珠洗三次。加入20μl 2×莱姆利缓冲液，将样品煮沸5分钟，并如上所述进行分析。免疫沉淀效率通过RhoA重复进行标准化。

内皮细胞单层阻力测定

用电阻抗传感器技术测量内皮细胞单层的电阻。在这个系统中，细胞在镀金电极上培养。通过连接到阵列的放大器测量单层电阻的变化。每项研究都是在耐药性达到稳定时进行的。将数据归一化为初始电压，并绘制为归一化电阻。

RhoA活性分析

使用Rhotekin Rho结合域下拉法测量RhoA活性水平。简言之，2×106细胞接种在10厘米的培养皿中，在含有10%FBS和5%抗生素的DMEM中培养过夜。然后用过氧亚硝酸盐清除剂MynTMPyp（25μ米)用LPS（1 EU/ml）处理细胞4h。通过Western blot分析测定该试验降低的活性RhoA水平。

免疫荧光

HLMVEC生长在涂有明胶的盖玻片上，并暴露于存在或不存在NipR1肽的LPS中。将细胞渗透并在25°C的5%BSA封闭缓冲液中封闭1h。添加针对ZO-1的一级抗体（Invitrogen；1:100稀释）。将平板在4°C下培养过夜，然后添加二级抗体（AlexaFluor）2小时。用蔡司免疫荧光显微镜Axio Observer D1检查载玻片。使用蔡司Axio Observer软件计算细胞之间的间隙。

RhoA蛋白纯化

Bl-21菌株大肠杆菌用含有人类RhoA和RhoA Y34F突变序列的polyHis-pET47b质粒转化。异丙基-β-d日-硫代吡喃半乳糖苷（1 m米)添加，并在25°C下培养细胞18–20小时。然后通过离心法收集细菌，并立即在40 m内将颗粒溶解米三氯化氢、5%甘油、1 mg/ml溶菌酶、100 m米氯化钠、蛋白酶抑制剂混合物、核糖核酸酶A（Sigma）和脱氧核糖核酸酶I（Sigma-）。将颗粒轻轻摇晃30分钟，进行超声波处理，然后进行超速离心。使用绑定缓冲液（40 m）将上清液加载到Hisprep FF 16/10色谱柱上米三氯化氢，100 m米氯化钠，5%甘油，30米米咪唑）在0.1毫升/分钟流量下进行。柱用40 m冲洗米三氯化氢，300 m米氯化钠，5%甘油，30米米咪唑的流速为1.5 ml/min。使用洗脱缓冲液（40 m）洗脱组氨酸标记蛋白米三氯化氢，300米米氯化钠，5%甘油，400米米咪唑），流速为1.0 ml/min。使用凝胶过滤缓冲液（60 m）在HiLoad 26/60 Superdex 75色谱柱上装载收集的组分进行尺寸排除凝胶过滤米三氯化氢，100 m米氯化钠、5%甘油），流速为0.2 ml/min。收集组分并通过考马斯蓝染色和Western blot进行分析。所有纯化步骤均在4°C下进行，纯化蛋白储存在−80°C下。

核苷酸与RhoA结合的快速动力学分析

RhoA用真正的过氧亚硝酸盐（500μ米30分钟）诱导酪氨酸在缓冲溶液中硝化。对于动力学分析，2μ米mant-GTP或-GDP与RhoA混合（0.1μ米)在停流仪器中（SX-20；应用生物物理）。然后使用350 nm激发和395 nm截止滤波器0.2~1s测量荧光强度与RhoA结合的mant-nucleotide增加。使用Pro-kinetistit软件平均并拟合三到五个实验获得的动力学曲线，以确定观察到的结合常数。

肽合成

肽2.0公司（弗吉尼亚州尚蒂利）合成了RhoA的氨基酸31–39中含有9个氨基酸的肽，该肽与细胞可渗透TAT序列融合。NipR1含有天然RhoA序列，NpR1F有Y34F突变。NH中含有生物素部分的第二组肽2还合成了末端。

NipR1肽与RhoA的结合

为了评估与RhoA的肽结合，我们使用了生物素化NipR1和NipR1F。将纯化的RhoA（1μg）与每种肽的浓度增加的肽在中性亲和素-海藻糖珠（Pearce）存在下混合1 h。然后用PBS洗涤样品三次，用2×Laemmli缓冲液洗脱结合的Rho，然后煮沸5 min。然后在4–20%梯度凝胶上分离样品，使用Western blot分析和抗RhoA抗体测定RhoA水平。在另一组研究中，进行了类似的下拉试验，其中NipR1与RhoA蛋白或重组GFP蛋白混合，以确定肽结合的选择性。离解常数，K（K）d日，然后通过拟合三个独立的RhoA结合动力学数据计算NipR1。

NipR1的RhoA屏蔽性能

纯化的RhoA（1μg）或GFP（1μg）蛋白与过氧亚硝酸盐供体SIN-1（250μg）孵育米)存在或不存在NipR1肽（5μ米)，样品在37°C下培养1小时。然后在4–20%梯度凝胶上分离样品，并使用蛋白质印迹法和抗3-硝基酪氨酸抗体监测蛋白质硝化水平。使用考马斯蓝重复印迹法对蛋白质负荷进行标准化。

NipR1的过亚硝酸根清除能力

这是使用过氧亚硝酸盐依赖的DHR123荧光测定的。NipR1（5μ米)与SIN-1（250μ米)在37°C下保持1小时。然后通过在Fluoroskan-Ascent微孔板荧光计中使用485nm的激发和545nm的发射测量罗丹明123的荧光来监测过氧亚硝酸盐的产生。

MALDI-TOF-TOF质谱

所有光谱均在ABSciex 5800 MALDI-TOF-TOF质谱仪上以正反射模式（10 kV）和α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质进行采集。按照已知肽标准校准质量。在C18 ZipTip（Millipore）上清洁5μl等分的RhoA糜蛋白酶/胰蛋白酶消化物。将结合肽脱盐，然后用2.5μl酸性乙腈（75%CH）洗脱三CN，0.1%TFA）。将洗脱液与2.5μl新制备的CHCA储备溶液（20 mg/ml CHCA）混合，并将1.5μl部分该混合物点在MALDI样品板上进行空气干燥。RhoA序列的肽覆盖率达到93%，在1700.5的MS.MS/MS中仅发现与氨基酸180–193相对应的COOH末端肽米/z（z）在没有碰撞诱导离解的情况下，也在正反射模式下进行了峰值分析。使用Protein Pilot 3.0、Mascot Distiller和PEAKS软件包分析MS和MS/MS光谱。为了评估NipR1肽硝化作用，我们将NipR1-肽（50μg）与纯化的RhoA（5μg）混合在10×PBS缓冲液中。然后将样品暴露于或不暴露于真正的过氧亚硝酸盐（500μ米)30分钟。然后使用C-18 ZipTip柱对每个样品进行脱盐，然后与CHCA基质混合。然后将样品直接置于MALDI板上，以进行进一步的MS分析。

实验小鼠协议

佐治亚州摄政大学动物研究委员会批准了所有动物协议和程序。的储备溶液大肠杆菌LPS（0111:B4）在生理盐水中制备。雄性C57Bl/6小鼠（10周龄；哈伦实验室）在气管内安装LPS（6.75×104内毒素单位/g体重）。LPS治疗24小时后对小鼠进行检查。治疗结束时，用3ml冰镇PBS（5ml）冲洗肺部米EDTA），切除，浸在盐水中，并吸干。一部分肺在液氮中被迅速冷冻，在预冷砂浆中粉碎成粉末，并储存在−80°C下。剩余的肺组织储存在−80°C。

支气管肺泡灌洗液（BALF）的分离

BALF通过气管插管滴注和抽出1ml PBS获得。部分溶液用于测定BALF中的蛋白质水平。此外，细胞以2500×克持续10分钟，再悬浮在水中15秒，以溶解红细胞。将白细胞重新悬浮在1ml PBS中，并使用血细胞仪测定总细胞计数。

肺功能分析

用戊巴比妥（90 mg/kg，腹腔内）麻醉小鼠，用1.2 mm（内径）金属套管进行气管造口，并连接到Flexi Vent（Scireq Inc）呼吸机。以10ml/kg的潮气量和150/min的速率开始通气。进行TLC操作，然后在15s后进行正弦1Hz振荡。随后，施加8 s强迫振荡信号（0.5–19.6 Hz），计算呼吸系统的机械输入阻抗，并将包含恒定相位组织室的模型拟合到输入阻抗，以评估组织弹性。通过逐步将气道压力增加到30 cm H来执行动态压力-容积操作2O，然后颠倒过程。

小鼠肺的免疫组织化学分析

肺在15厘米高下用10%福尔马林充气2在组织加工成石蜡包埋块之前，O压力并浸入相同的溶液中，然后用苏木精和伊红对4μm切片进行切割染色。两名研究人员对治疗组进行了组织病理学评估。苏木精和伊红染色切片对肺泡腔中存在中性粒细胞、间质中存在中性白细胞、存在透明膜、蛋白质碎片充满空腔以及肺泡间隔增厚进行评分，如前所述(22).

MPO染色

从石蜡块上切下切片（5μm）并安装在处理过的载玻片上（Superfrost+）。将载玻片风干过夜，置于60°C的烘箱中30分钟，在二甲苯中脱蜡，并通过分级酒精流至蒸馏水。用0.3%H淬火内源过氧化物酶2O（运行）25分钟，然后用蒸馏水冲洗两次。用Target pH6（Dako）对载玻片进行预处理，在蒸馏水中冲洗，在Power Block（Biogenex）中培养，在蒸馏水中冲洗，在PBS中放置5分钟，并在25°C下用初级抗髓过氧化物酶（Cappel，1:2000稀释）培养30分钟。在PBS中冲洗两次后，将载玻片与与山羊抗兔次级IgG（Envision+，Dako）结合的过氧化物酶标记聚合物孵育30分钟，然后在PBS内冲洗。用DAB+底物试剂盒（Dako，）检测结合抗体。苏木精用作副染色。髓过氧化物酶（MPO）染色的载玻片通过评分（0-4）评估肺泡壁内是否存在中性粒细胞。

支气管肺泡灌洗液中细胞因子和趋化因子的检测

如前所述，使用MCYTOMAG-70K分析法（EMD Millipore）评估分析物（pg/ml）(23).

统计分析

使用GraphPad Prism 4.01版（GraphPat）进行统计分析。计算所有样本的平均值±S.D.或S.E.，显著性由未配对的t吨测试（两组）和方差分析（至少三组）。方差分析采用Newman-Keuls事后检验。值为第页<0.05被认为是显著的。

结果

内皮型一氧化氮合酶参与脂多糖介导的HLMVEC屏障功能障碍

为了研究过氧亚硝酸盐对蛋白质的硝化作用是否是LPS导致内皮屏障破坏的一个促成因素，我们测量了在存在或不存在过氧亚硝基清除剂MnTmPyp的情况下，HLMVEC的跨内皮阻力（TER）。我们发现MnTmPyp预处理显著减弱了与LPS处理相关的屏障破坏(图1A类). 为了评估一氧化氮合酶在屏障功能障碍中的作用，我们将HLMVEC暴露于存在或不存在乙基硫脲（ETU）（非特异性一氧化氮合酶抑制剂）或1400 W（抑制诱导型一氧化氮合酶）的LPS中。ETU（而非1400 W）显著减弱了LPS介导的HLMVEC屏障破坏(图1B类). 然后使用siRNA方法确认eNOS的重要作用。当受到LPS攻击时，降低eNOS蛋白水平可改善HLMVEC屏障功能(图1C类).

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LPS通过增强Tyr的硝化作用刺激RhoA活化34.在存在或不存在过氧亚硝酸盐清除剂MnTMPyP（25μ米).A类，归一化的TER随着LPS而降低，并且在MnTMPyP的存在下会减弱。在存在或不存在NOS抑制剂ETU（200μg/ml）的情况下，用LPS（1 EU/ml）攻击HLMVEC米)，或诱导型NOS特异性抑制剂，1400 W（100μ米).B类在LPS的作用下，正常化的TER降低，在ETU的存在下，这一作用减弱，但没有1400 W。用抗eNOS的siRNA或干扰的对照siRNA瞬时转染HLMVEC。48小时后，经Western blotting检测，eNOS蛋白水平显著降低（50%）。显示了具有代表性的图像(C类，顶部面板).C类，eNOS蛋白的降低减弱了LPS介导的TER的降低。D类和E类，RhoA被激活(D类)并硝化(E类)LPS治疗后（1 EU/ml，4 h），这些事件在MnTMPyP的存在下得以预防。数据为平均值±S.E。；n个= 3–4. 在所有面板中，*，第页< 0.05与未经处理；†，第页< 0.05与仅LPS。知识产权免疫沉淀；IB公司，免疫印迹。

LPS通过Tyr硝化增加RhoA活性34

LPS暴露期间产生的过氧亚硝酸盐可通过酪氨酸残基的硝化作用影响不同的蛋白质。酪氨酸硝化会影响蛋白质的结构和功能。小GTPAse RhoA是LPS导致内皮屏障破坏的关键调节因子之一。因此，我们接下来检查了RhoA活性是否受到硝化作用的调节。我们的数据表明，LPS显著增加了HLMVEC中RhoA的活性，而过亚硝酸根清除剂MnTMPyp可以减弱这种活性(图1D类). 此外，我们发现LPS诱导RhoA硝化(图1E类)MnTMPyp对此进行了衰减。MS用于识别从LPS激发的HLMVEC中获得的RhoA肽片段中与预测质量相差+45 Da（等于硝基加成）的峰。仅鉴定出一种硝化肽：SKDQFPEVY（Y）（否2)VPTVF位于氨基酸区域26–39(图2A类). 还进行了MS/MS以确认肽序列和硝基作为Tyr的位置34(图2B类).

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Tyr的鉴定34作为RhoA上的硝化点。HLMVEC是否接触LPS（1 EU/ml，4 h）。然后免疫沉淀RhoA蛋白，在4–20%梯度凝胶上运行，并用考马斯蓝染色。然后对RhoA带进行凝胶内糜蛋白酶/胰蛋白酶消化，并对所得肽片段进行MALDI-TOF MS分析（四次运行）。肽覆盖率为93%。A类，一个序列为SKDQFPEV的单一硝化肽Y（Y）*在LPS处理的细胞中鉴定出VPTVF，对应于1700.5肽米/z（z）(绿线). 未经处理的细胞中未发现这种硝化肽(黑线). 1700.5的进一步MS/MS分析米/z（z）肽是在正反射模式下获得的（三次运行）。所得光谱与肽序列拟合（SKDQFPEVY（NO2)VPTVF）来自于Tyr改良的人类RhoA34通过硝基。B类，实线表示MS/MS光谱中发现的计算质量，质量误差小于0.3 ppm，以及虚线表示MS/MS中未发现的预测质量。

NipR1肽对RhoA硝化、RhoA活性和HLMVEC屏障功能的保护作用

接下来，我们研究了是否可以针对RhoA并阻止其在Tyr硝化34为了实现这一点，我们使用了一种屏蔽肽策略。对接实验导致识别一种名为NipR1的肽(n个硝化作用我抑制的第页肽R（右）hoA公司1). 对接实验表明该肽会与皮瓣区域结合(图3A类). 一种肽，其中Tyr34还合成了苯丙氨酸残基（NipR1F）作为对照。为了确认结合，我们使用生物素化的NipR1和NipR1F肽进行了下拉分析，并能够证明RhoA和这两种肽之间的强烈相互作用(图3B类). 为了计算肽的结合常数，我们使用了不同浓度的生物素化NipR1和重组RhoA（参见图6C类)在下拉分析中。我们发现非常低K（K）d日= 2.35 μ米对于NipR1，它反映了与RhoA的强烈亲和力(图3C类). 为了进一步证实NipR1结合的特异性，我们使用了一种类似的下拉试验，结合与RhoA分子大小相似的重组GFP蛋白。我们的数据表明，GFP以非特异性的方式与NipR1结合，并且仅在比RhoA结合发生的浓度高得多的浓度下结合(图3C类). 此外，我们评估了NipR1特异性防止RhoA硝化的能力。为此，我们使用低浓度的NipR1（5μ米)这足以绑定RhoA，但不足以绑定GFP。然后，我们将RhoA-NipR1或GFP-Nip R1混合物暴露于SIN-1（250μ米). 我们的数据表明，在这些条件下，NipR1减弱RhoA硝化，但不阻止GFP硝化(图3D类). 为了证实这种影响不是由于直接清除过氧亚硝酸盐所致，我们还监测了使用和不使用NipR1的过氧亚硝基介导的DHR123氧化。我们的数据表明，NipR1并未显著降低SIN-1介导的DHR123荧光增强(图3E类). 为了证实当屏蔽RhoA时，NipR1肽被硝化，重组RhoA与NipR1-的混合物暴露于或不暴露于真正的过氧亚硝酸盐并经受MS。我们的MS数据表明，在过氧亚硝基化合物存在的情况下，NipR1被硝化，如存在预测质量增加+45 Da（等于硝基加成；图3如果). 有趣的是，我们还观察到肽中添加了一个和两个氧原子，表明酪氨酸也发生了氧化(图3如果). 接下来，我们研究了NipR1肽是否可以保护RhoA免受LPS暴露的HLMVEC中的硝化作用。为此，将NipR1和NipR1F肽与HIV TAT序列融合，以增加肽的通透性。此外，为了评估保护RhoA的潜力，而不是清除过氧亚硝酸盐，我们使用了低浓度的肽（300 n）米). 为了证实这一点，我们初步评估了LPS对HLMVEC中总蛋白硝化增加的影响。我们的数据表明，这一增加不受任何一种肽的影响(图3G公司). 然而，LPS介导的RhoA硝化作用增加(图3小时)和激活(图3我)被NipR1减弱，但没有被NipRF1减弱。此外，NipR1（而非NipRF1）减弱了LPS介导的HLMVEC屏障的破坏，这是通过保存TER来确定的(图3J型)以及细胞间间隙的减少(图3K（K）).

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RhoA硝化屏蔽肽的研制34硝化作用。 A类，一种以Tyr为中心的生物素化肽34合成了含有QFPEVYVPTVF序列的序列，并与HIV TAT序列偶联。该肽被命名为NipR1（硝化抑制肽1），设计用于与RhoA中Switch I结构域的皮瓣区域相互作用(左侧面板). 还合成了苯丙氨酸取代肽（NipR1F）作为对照(右侧面板). 将每种肽（100 ng/ml）与重组人RhoA（0.1 mg）混合，并进行生物素下拉分析，以评估每种肽与RhoA结合的能力。B类，从三个独立的实验中显示了一个具有代表性的图像，并证明每个肽都与RhoA具有高亲和力。C类增加生物素化NipR1的浓度（0.3、1、1.5、5和30μ米)与纯化的RhoA和GFP蛋白混合以计算各自的结合常数。NipR1与RhoA结合显示出特征亲和力曲线K（K）d日2.35±0.84，而NipR1以非特异性方式与GFP结合。RhoA和GFP蛋白在NipR1（5μ米)并暴露于过氧亚硝酸盐供体SIN-1（250μ米)持续1小时。D类蛋白质硝化的Western blot分析表明，在NipR1存在下，RhoA硝化减少，而Nip R1没有减少GFP硝化。E类，SIN-1产生过氧亚硝酸盐（250μ米)在NipR1（5μ米).如果质谱分析表明，NipR1（50μg）肽（2655.4Da，上部面板)至过氧亚硝酸盐（500μ米)产生+45 Da质量位移（27007 Da，下部面板)与NO有关2酪氨酸的基团加成。我们还观察到酪氨酸氧化。G公司将HLMVEC暴露于非生物素化NipR1和NipR1F肽（100 ng/ml，30 min），然后用LPS（1 EU/ml）处理细胞。两种肽都不能减弱LPS诱导的总硝化蛋白的增加。小时和我，NipR1，而不是NipR1F降低了LPS介导的两种RhoA硝化的增加(小时)和RhoA激活(我).J型和K（K）NipR1暴露细胞中RhoA活性的降低也减弱了LPS介导的TER降低(J型)并减少了细胞之间的间隙形成(K（K）). 数据为平均值±S.E。；n个=3.*时，第页< 0.05与未经处理；†，第页< 0.05与仅LPS。IB公司免疫印迹；知识产权免疫沉淀；3-北卡罗来纳州，3-硝基酪氨酸。

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硝化介导RhoA活化的机制。 A类，RhoA的x射线晶体结构分析表明，Tyr34位于Switch I结构域的一个柔性区域（瓣）中，负责核苷酸结合。B类，RhoA皮瓣区域的100-ns分子动力学模拟(蓝色)RhoA在Tyr硝化34(绿色)已执行(左侧面板); 皮瓣区的运动(绿色)也叠加在与GEF蛋白结合的x射线晶体结构RhoA上(粉红色，右侧面板). His-tagged RhoA结构在大肠杆菌BL21菌株。首先，细菌裂解物由His纯化6镍-硝基三乙酸柱上的标记亲和力。其次，用大小排阻色谱分离亲和纯化洗脱组分中的蛋白质。C类考马斯染色鉴定出两条带，并用Western blot分析确认为RhoA。MS进一步证实了这两条带都是RhoA，表明第二条带可能含有翻译后修饰。过亚硝酸根降低了GDP与纯化RhoA的结合。人类重组RhoA暴露于真正的过氧亚硝酸盐（100μ米，30分钟）。D类和E类结合荧光标记GDP的动力学(D类)或GTP(E类)然后使用停流分析进行RhoA。对三个测量值进行平均，并用双分子反应方程进行拟合。硝化作用将GDP与RhoA的结合常数从19.79+1.66降低到4.03+2.87米−1秒−1但不影响GTP结合（仅RhoA=38.66+8.6米−1秒−1 与RhoA+ONOO=36.19+12.7米−1秒−1).如果，GTP与Y34FRhoA突变体结合的动力学也通过mant-GTP的停流分析测定。没有观察到GTP的结合，这表明该突变体不能结合GTP，因此具有催化活性。G公司，Y34FRhoA突变蛋白在HLMVEC中过度表达。48小时后，RhoA蛋白显著增加。小时，Y34FRhoA突变蛋白过表达不会改变LPS处理的细胞中的基础RhoA活性或调节RhoA活性的增加。我Y34FRhoA突变蛋白的过度表达也不能调节LPS引起的正常化TER的降低。J型，RhoA催化循环的示意图。GDP释放是RhoA激活中的一个速率限制步骤。Tyr协助增加GDP释放34硝化导致更快的GTP重新加载并增加RhoA活性。数据为平均值±S.E。；n个= 3. *,第页< 0.05与pDEST40（空向量）无LPS。

NipR1肽减轻LPS处理小鼠肺部RhoA硝化和活化

为了探讨NipR1的治疗潜力，我们使用了由气管内蒸馏LPS诱导的ALI小鼠模型。在LPS暴露前6 h，给小鼠注射0.1 mg/kg NipR1或NipR1F肽。为了评估保护RhoA的潜力，而不是清除过氧亚硝酸盐，我们使用了浓度为4μ米，这接近于K（K）d日对于RhoA（2.35μ米；图3C类)以降低NipR1作为非特异性过氧亚硝酸盐清除剂的可能性。在气管内LPS治疗后的20小时内，我们发现，与HLMVEC一样，LPS在小鼠肺部诱导RhoA激活(图4A类). 在NipR1预处理的小鼠中，RhoA活性的增加被阻止，但NipRF1未被阻止(图4A类). NipR1也能减弱LPS诱导的小鼠肺部RhoA硝化作用，但NipRF1不能(图4B类). RhoA总蛋白水平(图4C类)和基本RhoA硝化水平(图4D类)保持不变。

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ALI小鼠模型中RhoA硝化和活化。小鼠在气管内滴注溶媒或LPS（2 mg/kg）前6 h接受溶媒、NipR1或NipR1F（腹腔注射，0.1 mg/kg）。24小时后，处死小鼠，取肺组织测定RhoA活性和RhoA硝化作用。A类小鼠肺中LPS介导的RhoA活性增加被NipR1减弱，但NipR1F没有减弱。B类RhoA的免疫沉淀表明NipR1，而不是NipR1F，可以减弱LPS介导的RhoA硝化反应的增加。C类和D类测定RhoA总蛋白水平和基本RhoA硝化作用。肽和LPS治疗都不会改变RhoA蛋白水平(C类)并且仅这些肽不会改变硝化RhoA的基础水平(D类). 数据为平均值±S.E。；n个= 4–6. *,第页< 0.05与控制；†，第页< 0.05与仅LPS。IB公司，免疫印迹；知识产权，免疫沉淀。

NipR1肽对LPS治疗小鼠肺功能的保护作用

使用小鼠进行额外的生理、生化和形态学研究，以评估NipR1肽在减轻ALI症状方面的功效。LPS处理的动物BALF中的细胞浸润显著增加(图5A类). NipR1，但不是NipRF1，减少了这一增长(图5A类). 当我们测量BALF中的蛋白质浓度时，观察到类似的保护作用(图5B类). 此外，NipR1（而非NipRF1）能够防止与LPS暴露相关的体重减轻（推测为脱水）(图5C类). 我们还评估了肺部的组织病理学变化。脂多糖导致严重的肺泡损伤，包括肺泡和间质中大量中性粒细胞和红细胞的存在、透明膜的形成、间隔增厚和肺泡内碎屑堆积(图5D类). 同样，NipR1，而不是NipRF1，减少了这些病理变化(图5，D类和E类). NipR1（而非NipRF1）也减弱了LPS诱导的肺泡腔MPO染色增加(图5，如果和G公司)肺匀浆中MPO活性减弱(图5小时). NipR1也能阻止LPS引起的肺弹性降低，但NipRF1不能阻止(图5我)，表明肺力学保持不变。最后，我们的数据表明NipR1减弱了LPS介导的多种促炎细胞因子和趋化因子的诱导(表1).

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NipR1可减轻LPS暴露小鼠的肺损伤。小鼠在气管内滴注溶媒或LPS（2 mg/kg）前6 h接受溶媒、NipR1或NipR1F（腹腔注射，0.1 mg/kg）。24小时后，将小鼠麻醉，并收集BALF。还进行了肺力学测量。A类和B类LPS暴露后，BALF中的白细胞总数和蛋白质浓度显著增加，NipR1可减弱这些增加，但NipR1F不能。C类，LPS介导的体重下降也被NipR1减弱，但不是NipR1F。苏木精和伊红染色后检查肺部切片是否有炎症迹象。D类，显示了具有代表性的显微照片。E类NipR1降低了LPS诱导的炎症反应，但NipR1F没有降低。F–H（飞行高度）MPO染色增加(如果和G公司)和MPO活动(小时)NipR1可减少LPS诱导的细胞凋亡，但NipR1F不能。对小鼠肺部动态压力-体积关系的分析也表明，NipR1（而非NipR1F）可以阻止LPS介导的肺气道力学破坏。我，数据表示四组的压力-体积循环，有两条曲线：一条用于吸入，另一条用于呼气。数据为平均值±S.E。；n个= 4–48. *,第页对照组<0.05；†，第页仅LPS的结果<0.05；，第页NipR1F小于0.05。

表1

BALF细胞因子浓度（pg/ml）表示为各组（对照组、，n个= 13; LPS，n个= 13; NipR1、，n个= 5; 以及LPS+NipR1，n个= 7).

阴影行表明LPS未处理组和LPS加NipR1处理组之间没有显著变化。使用MCYTOMAG-70K分析法评估分析物。（IP-10，IFN-γ诱导蛋白10；KC，角朊细胞衍生趋化因子；LIF，白血病抑制因子；LIX，LPS诱导CXC趋化因子，MCP-1，单核细胞趋化蛋白1；MIG，IFN-α诱导的单核细胞因子；RANTES，激活调节，正常T细胞表达和分泌）。

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a） 与对照组显著不同，b）与LPS组显著不同。(*,第页< 0.05, **,第页< 0.01, ***,第页< 0.001).

硝化介导RhoA活化机理的解释

比较不同催化阶段相关的不同晶体结构中的RhoA GTPase，发现RhoA的Switch I区域在催化循环期间发生了重大构象变化。我们将开关I的这个亚区命名为“瓣”（氨基酸28-40），它在催化循环过程中改变构象变化。襟翼具有非结构化、柔性的特点(图6A类). 提尔34位于皮瓣中间，分子动力学模拟预测Tyr硝化34将导致皮瓣打开，类似于RhoA-GEF复合晶体结构(图6B类). 据预测，这将通过降低RhoA对GDP的亲和力来增加核苷酸循环，从而加快GDP释放，从而增加RhoA活性。为了测试分子动力学数据的有效性，我们进行了动力学研究。从His转化的细菌表达系统中纯化的人重组RhoA6-标记的RhoA(图6C类)使用荧光标记的鸟嘌呤核苷酸进行快速流动动力学评估GDP和GTP结合。RhoA暴露于过氧亚硝酸盐显著降低了GDP结合常数(图6D类). 然而，RhoA硝化对GTP结合常数没有影响(图6E类). 当我们表达并纯化一种RhoA突变蛋白（未显示），其中酪氨酸残基被苯丙氨酸取代时，我们发现它不能结合GTP，并且催化活性不高(图6如果). 此外，当在HLMVEC中表达时，Y34F-RhoA突变体既没有调节RhoA活性的增加(图6，G公司和小时)或与LPS暴露相关的屏障破坏(图6我).

讨论

众所周知，内皮屏障由小GTPases控制的细胞骨架重组调节：RhoA、Rac1和Cdc42(11). RhoA激活在内皮屏障的调节中至关重要(24，25). 我们的数据通过阐明通过硝化单个酪氨酸残基（Tyr34). 这是令人惊讶的，因为大多数被报道经历酪氨酸硝化的蛋白质都被抑制了(26，27). 我们的数据很重要，因为它们为阐明RhoA信号与细胞氧化还原状态之间的相互作用的越来越多的文献增添了新的内容。研究表明，超氧化物和二氧化氮通过影响GXXXX年GK（S/T）C图案(28). 从这些数据可以得出结论，半胱氨酸18和苯丙氨酸28（RhoA序列）介导小GTPase的氧化还原敏感性。然而，由于分子间二硫键的形成，RhoA也被氧化还原剂灭活(29). 除了这些研究之外，我们的数据还阐明了RhoA蛋白硝化在内皮屏障破坏中的作用。然而，重要的是要认识到，除了过氧亚硝酸盐外，还有其他活性氧或活性氮物种，如超氧化物、H2O（运行）2或NO，是在ALI的发展过程中产生的。因此，这些其他ROS和RNS也可能参与RhoA的激活和/或抑制(30). 在我们的研究中，我们没有评估它们的潜在作用。然而，应该注意的是，纯化的重组RhoA暴露于真正的过氧亚硝酸盐足以刺激核苷酸循环，而Y34F突变体则不具有催化活性。因此，尽管可能涉及其他物种，我们认为Tyr34是氧化还原修饰的主要目标。

提尔34位于交换机I域内RhoA的灵活区域(31)我们命名为皮瓣区。该结构域对于核苷酸和镁在催化腔中的结合非常重要。研究表明，在催化循环过程中，皮瓣结构域的分子构象发生了变化(32，–34). RhoA的催化循环包括三个主要步骤(图6J型)1）GTP与RhoA结合，RhoA代表酶的活性构象，皮瓣处于闭合构象；2） GTP磷酸键断裂后，RhoA回复到与GDP结合的非活性构象，且瓣部分打开；和3）RhoA通常通过全球环境基金（GEF）的蛋白质援助，从非活性构象中释放GDP，并用一个完全打开的瓣等待与新的GTP分子结合。我们的分子动力学模拟和快速流动动力学研究表明，在Tyr作用后，RhoA-GDP复合体瓣区的构象发生了变化34硝化作用模拟GEF-RhoA复合体皮瓣中观察到的构象变化，而GTP结合不受影响。因此，我们建议Tyr硝化34在GDP结合状态下，导致皮瓣区域出现“GEF样”运动。这将导致更快的GDP释放和GTP重新加载，导致RhoA活动增加。因为Tyr上引入了硝基34引入一个轻微的负电荷，我们推测它可能也是RhoA通过磷酸化进行生理调节的位点。然而，这种情况是否发生，如果发生，则需要进一步研究所涉及的激酶的鉴定。提尔34受到氨酰化作用(35). Tyr的改性34一磷酸腺苷导致RhoA抑制，可能是因为核苷酸结合位点的空间位阻。此外，很可能Tyr的硝化作用34会抑制RhoA的磷酸化和/或AMP化。因此，这些对RhoA一个非常重要的位点的不同修饰之间的竞争可能具有生理和病理意义。

保护RhoA蛋白免受Tyr硝化34，我们利用了围绕Tyr的序列34构建一种新型屏蔽肽：NipR1。该序列是根据RhoA、Rac1和CDC42中出现的多聚体结构的观察而开发的(36，37). 因为我们证明NipR1和RhoA之间有很强的亲和力，我们推测皮瓣区域可能位于RhoA的多聚体界面。NipR1肽的结合通过保护蛋白质免受过氧亚硝酸盐攻击来阻止RhoA硝化。我们推测，这种保护机制是NipR1提供了一种替代酪氨酸残基与过氧亚硝酸盐反应，而不是简单地以空间位阻方式抑制过氧亚硝基对蛋白质的访问。这种可能性得到了我们的数据的支持，这些数据表明，尽管NipR1F肽能够与RhoA结合，但它并不能阻止硝化介导的RhoA活化。有趣的是，NipR1肽减少了LPS介导的RhoA硝化，而不影响其他蛋白质硝化事件，这表明它是针对RhoA的特异性靶点，而不是作为一个普通过氧亚硝酸盐库。此外，由于NipR1似乎不影响HLMVEC或小鼠的基本RhoA活性，我们认为它在ALI中具有潜在的临床应用价值，因为即使肽能够进入肺以外的组织，也不应改变生理RhoA信号。这一点很重要，因为RhoA还参与维持内皮细胞骨架的构象，以维持紧密的屏障(38). NipR1也能有效预防小鼠ALI。除了防止RhoA硝化和活化外，NipR1在疾病进展的多个层面上发挥了积极的作用。NipR1保留了内皮屏障功能，并降低了BALF中炎性细胞因子和趋化因子的水平。这与巨噬细胞减少和中性粒细胞渗入肺部有关。众所周知，血管细胞（内皮细胞和平滑肌）产生趋化因子和细胞因子，从而吸引中性粒细胞和巨噬细胞(39，40). 研究表明，平滑肌细胞中细胞因子的产生与RhoA的激活有关。因此，我们推测NipR1介导的RhoA信号传导抑制也可能干扰血管细胞中细胞因子的产生，并减弱中性粒细胞和巨噬细胞的招募，从而维持免疫细胞激活的恶性循环。NipR1处理小鼠的肺泡结构也得到了保护，而形态学变化也反映在肺功能的保护上。从这些数据中，我们得出结论，我们的屏蔽肽方法是一种新的、有希望的治疗ALI/ARDS的方法。然而，值得讨论使用NipR1治疗与ALI相关的内皮损伤的障碍。尽管对ALI进行了数十年的研究，但除了低潮气量机械通气外，几乎没有其他治疗选择(41). 此外，在许多情况下，ALI动物模型（尤其是小鼠）的积极结果未能转化为对人类的临床益处。例如，最近研究表明，β-肾上腺素能受体激动剂对小鼠急性肺损伤有积极的治疗效果(42，–44). 然而，使用沙丁胺醇的随机临床试验表明，ALI患者的临床结果没有改善(45). 因此，尽管我们提供了关于NipR1减弱内皮屏障破坏和ALI对LPS反应的发展的能力的高度肯定的数据，但在进一步推断时应谨慎。事实上，还需要更多的研究来确定NipR1是否能在LPS暴露后恢复内皮屏障，以及它在其他ALI模型（如VILI）中是否也有保护作用，或对活的细菌感染作出反应，后者与ALI/ARDS患者更为相似。

总之，尽管先前的研究表明小GTPase可以通过细胞氧化还原状态进行调节(5，28，–30)，我们是第一个阐明硝化胁迫下发生这种反应的分子机制的人。我们证明了单一酪氨酸残基Tyr的硝化作用34，足以增加RhoA的活性。这涉及在Switch I的皮瓣区域诱导GEF-like构象变化。此外，我们首次利用保护肽方法来防止单个靶蛋白受到过亚硝酸根的翻译后修饰。最后，我们证明了保护性RhoA肽NipR1可以防止RhoA硝化，并在多个水平上保护小鼠肺免受LPS的有害影响。我们推测基于NipR1的肽可能在ALI/ARDS的治疗中具有临床用途。

*这项工作得到了国家卫生研究院P01HL0101902的全部或部分支持。

2使用的缩写如下：

阿里
急性肺损伤
ARDS公司
急性呼吸窘迫综合征
全球环境基金
鸟嘌呤核苷酸交换因子
HLMVEC公司
人肺微血管内皮细胞
网络操作系统
一氧化氮合酶
电子NOS
内皮一氧化氮合酶
欧盟
酶单位
BALF公司
支气管肺泡灌洗液
TER公司
跨内皮细胞耐药性
CHCA公司
α-氰基-4-羟基肉桂酸
多功能操作
髓过氧化物酶
电子交易单元
乙基硫脲。

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会