钙²⁺Rho激酶通过磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶向苏氨酸-855亚基促进动脉肌源性反应

摘要

阻力动脉因跨壁压力增加而收缩，因压力降低而扩张的能力称为肌源性反应。这种机制是外周血管阻力、血压和包括脑血管在内的几个血管床区域血流控制的重要决定因素(Davis&Hill 1999年). 尽管肌源性反应已经被认识了100多年(贝利斯，1902年)，我们对这一基本生理机制所涉及的基本机制的理解是不完整的。

肌源性反应是阻力动脉血管平滑肌细胞的固有特性，在没有内皮或神经元输入的情况下发生(Davis&Hill，1999年；希尔等。2001). 肌源性收缩部分取决于膜电位水平(E类_米)血管平滑肌细胞，因为收缩钙的主要来源²⁺流入通过电压门控钙发生²⁺信道（VGCC）(Davis&Hill，1999年；希尔等。2001，2006). 目前的一个工作假设认为，肌源性反应来自：（1）压力诱导的去极化E类_米由于非选择性阳离子通道（和/或氯化物和VGCC）的激活，（2）VGCC的电压依赖性激活，（3）胞浆钙的升高²⁺液位（[Ca²⁺]_我)，（4）钙²⁺-肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的依赖性激活，（5）20kDa肌球蛋白轻链亚基（LC）的磷酸化₂₀)，（6）开始跨桥循环，以及（7）产生力(邹等。1995，2000；Davis&Hill，1999年；希尔等。2001，2006).

然而，一些证据表明，除了膜电位和[Ca²⁺]_我也可能有助于肌源性反应中的力产生(达安吉洛等。1997；范·巴维尔等。2001；拉高（Lagaud）等。2002；Osol公司等。2002；戈基纳等。2005). 中的标记更改E类_米和[Ca²⁺]_我伴随脑动脉肌源性收缩的压力<～60 mmHg(Osol公司等。2002). 然而，尽管为了保持直径恒定而增加了作用力，但这两个参数在60至140 mmHg之间都没有明显变化。同样，在较大的压力阶跃下，仓鼠颊囊小动脉的稳态收缩更大，但[Ca²⁺]_我是相似的(达安吉洛等。1997). 在升高的外[K⁺]解决方案，一种夹紧操作E类_米在去极化水平，并排除钙的变化²⁺通过VGCC进入(拉高（Lagaud）等。2002). 通过Y27632或RhoA和ROK的显性阴性突变体抑制PKC活性或抑制ROK来抑制肌源性反应(范·巴维尔等。2001；拉戈等。2002；舒伯特等。2002；Yeon公司等。2002；博尔兹等。2003；中村等。2003；Jarajapu&Knot，2005年；迪布罗卡等。2005，2007；戈基纳等。2005). 例如，Y27632导致高外[K⁺]或在α-毒素渗透后细胞内[Ca无变化²⁺]_我(拉戈等。2002；戈基纳等。2005). 综上所述，这些发现已被解释为表明钙的韩国和/或PKC依赖机制²⁺致敏有助于肌源性反应(舒伯特等。2008)以类似于激动剂引起的平滑肌收缩的方式(索姆利奥和索姆利欧，2003年；斯瓦德等。2003；平野，2007).

钙²⁺敏化是激动剂引起平滑肌收缩的现象，而[Ca几乎没有升高²⁺]_我通过改变MLCK和肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）活性之间的平衡(索姆利奥和索姆利欧，2003年). LC的范围₂₀磷酸化和随后的力生成是由MLCK和MLCP的相对活性决定的。激活G的激动剂_12/13-偶联受体通过小GTPase RhoA激活ROK诱导敏化(索姆利奥和索姆利欧，2003年；斯瓦德等。2003；平野，2007). 韩国在苏氨酸-697（T697）和/或苏氨酸-855（T855）（可能还有CPI-17；平野，2007)以组织依赖的方式导致MLCP活性抑制(冯等。1999；贝拉斯科等。2002；穆兰伊等。2005). 钙²⁺在G_q个-苏氨酸38处的偶联受体占有率和CPI-17随后的磷酸化导致CPI-17对MLCP的抑制作用增加1000倍(林下（Hayashi）等。2001). 两种信号通路引起的MLCP活性降低改变了MLCK–MLCP平衡，有利于MLCK依赖的LC磷酸化₂₀，在给定[Ca时产生更大的力²⁺]_我; 即力向左移动与[加利福尼亚州²⁺]_我关系(索姆利奥和索姆利欧，2003年；瑞士等。2003).

如果ROK-和/或PKC介导的Ca²⁺敏化有助于肌源性反应，MYPT1和/或CPI-17磷酸化预计会随着磷酸化-LC的增加而增加₂₀力的产生和力的左移与[加利福尼亚州²⁺]_我关系。值得注意的是，目前：（1）没有证据表明跨壁压力升高会导致阻力动脉中MYPT1或CPI-17磷酸化增加，（2）在唯一一项直接测试[Ca]生理范围内敏感性的研究中²⁺]_我使用加压、α-毒素渗透的动脉，力量不变与[加利福尼亚州²⁺]_我在0和80毫米汞柱之间有明显的关系(麦卡伦等。1997). 事实上，以前的研究完全依赖于钙变化的替代性间接标记物²⁺灵敏度(舒伯特等。2008)例如动脉直径和体积之间关系的改变²⁺]_我用Fura-2评估（例如。达安吉洛等。1997). 在缺乏钙的直接证据的情况下²⁺致敏，由于抑制ROK或PKC信号而抑制肌源性收缩的可能性是不可忽视的，这是由于干扰了与肌源性反应有关的其他细胞机制所致。例如，众所周知，韩国和PKC会改变平滑肌L型钙²⁺、非选择性阳离子和K⁺通道活性，修改Ca²⁺处理、调节跨桥循环（通过钙调素或钙调素）和/或影响肌动蛋白细胞骨架重排(Cipolla&Osol，1998年；金等。2000；金子等。2000；Morgan&Gangopadhyay，2001年；吉斯达尔等。2003；Wier&Morgan，2003年；沙比尔等。2004；卢克纳尔等。2004；威尔逊等。2005；Gerthoffer，2005年；维拉尔巴等。2008).

获取钙的生化证据²⁺肌源性反应的致敏性一直存在问题(Davis&Hill，1999年；舒伯特等。2002，2008). MYPT1、CPI-17和LC的常规测量₂₀由于血管较小，阻力动脉中的磷酸化是不可能的。例如，许多压力动脉造影研究中使用的大鼠大脑中动脉段（RCA）通常长0.5–1.0 mm，直径0.1–0.2 mm，壁厚为2–5个平滑肌细胞。这些片段产生的蛋白质少于1μg，且仅微量MYPT1、CPI-17和LC₂₀标准的Western印迹技术无法检测到的。因此，肌源性动脉中磷酸化-MYPT1和磷酸化-CPI-17的准确定量需要开发一种灵敏度更高的方法，如用于测量LC₂₀直径20μm肾传入小动脉的磷酸化(武也等。2008).

在这项研究中，我们检验了Ca²⁺ROK和PKC分别通过MYPT1和CPI-17磷酸化介导的致敏机制有助于RCA的肌源性反应。我们采用三步Western blot方法量化磷酸化MYPT1、磷酸化CPI-17和磷酸化-LC₂₀在不同的椎间压力下。我们的数据提供了第一个直接的生物化学证据，证明压力升高导致T855处MYPT1的ROK依赖性磷酸化，导致LC增加₂₀有助于肌源性反应中产生力量的磷酸化。

方法

结果

高灵敏度检测磷酸化MYPT1的方法

允许量化MYPT1、CPI-17和LC₂₀对加压RCA中的磷酸化、最大化蛋白质提取的修饰以及每个磷酸蛋白的Western blot检测灵敏度进行了鉴定。在样品缓冲液中加入4%的十二烷基硫酸钠（而不是1%），结合过夜的端到端旋转（补充图1，仅在线提供）。该方法也适用于CPI-17和LC₂₀与不固定或用戊二醛固定相比，用0.5%蓬松S–5%乙酸将MYPT1固定在硝化纤维素膜上（5分钟处理）提高了敏感性（补充图2). 当用0.5%I-Block封闭硝化纤维素时，也观察到灵敏度提高与其他常用阻断剂（补充图3). 使用包含生物素-链霉亲和素扩增步骤的三步Western blot方案，可最大程度地提高灵敏度。例如，图1显示了使用5′-三磷酸尿苷（UTP）刺激的稀释系列（10μmol l⁻¹)RCA提取物经过SDS-PAGE，转移到硝酸纤维素和使用磷酸特异性抗体检测磷酸-MYPT1。三步方案将磷酸-T697-和磷酸-T855-MYPT1的检测灵敏度提高了约10倍，稀释范围与0.5–3.0 mm长的加压RCA段相对应。可使用相当于一个0.5 mm加压RCA段的样品，采用三步法，对磷酸MYPT1进行常规定量。重要的是，信号强度在稀释范围内呈线性增加，当归一化为考马斯蓝染色肌动蛋白以校正蛋白质负载水平时，信号强度没有变化(图2). 由于避免了在用pan-MYPT1抗体重切前剥离硝化纤维素膜引入的蛋白质的可变损失，因此选择了对总MYPT1进行标准化的方法。

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图2

磷酸-MYPT1-T697的线性(A–C）和磷酸-MYPT1-T855(D–F型)组织提取物的蛋白质印迹

A类和D类，稀释系列为10μmol l⁻¹UTP刺激的脑动脉提取物进行SDS-PAGE，并通过三步Western blotting检测MYPT1-T697和-T855的磷酸化。B类和E类，信号强度与磷酸-T697-和磷酸-T855-MYPT1蛋白印迹和考马斯蓝染色肌动蛋白的提取物装载量绘制，显示装载的样品量与检测到的信号强度之间的线性关系(n个=3）。C类和如果磷酸化MYPT1到考马斯蓝染色肌动蛋白的信号强度标准化产生了一个线性关系，没有偏离预期值(n个= 3).

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图1

两步检测灵敏度与磷酸化MYPT1的增强三步Western印迹

将UTP刺激的脑动脉提取物稀释系列（近似于指示数量的200μm×500μm加压大鼠脑动脉段产生的信号强度范围）在T697进行SDS-PAGE和MYPT1磷酸化(A类)和T855(B类)通过2步和3步Western印迹法检测（即同时暴露）。条形图显示了通过2步和3步方法检测到的每个稀释度的磷酸化MYPT1标准化为考马斯蓝染色肌动蛋白的信号强度。在三个实验中也得到了类似的结果。

抑制ROK减轻肌源性收缩

Y27632之前使用浓度为1–10μmol l⁻¹研究韩国在肌源性反应中的作用(范·巴维尔等。2001；拉高（Lagaud）等。2002；舒伯特等。2002；日元等。2002；博尔兹等。2003；中村等。2003；Jarajapu&Knot，2005年；迪布罗卡等。2005，2007；戈基纳等。2005). 然而，在这个浓度范围内，它也抑制PKCδ活性(埃托等。2001；威尔逊等。2005). 因为PKC与Ca有关²⁺致敏与肌源性反应(Davis&Hill，1999年；日元等。2002；舒伯特等。2008)在这里，我们还使用了更有效和选择性更强的韩国抑制剂H1152(K（K）_我0.0016与。9.3μmol升⁻¹用于PKC；沙沙贵等。2002). 为了确定H1152的适当浓度，将RCA加压至100 mmHg，并以累积的方式施加H1152(图3). Y27632用于平行实验，以与H1152数据进行比较。这两种抑制剂均引起浓度依赖性血管扩张，但IC₅₀与0.44±0.04μmol l相比，H1152在0.02±0.01时的值低于Y27632⁻¹(图3). 1.0和10μmol l时的H1152和Y27632⁻¹分别诱导了接近最大的扩张（分别为94.2±0.6%和92.8±1.2%）至零[Ca时观察到的被动直径²⁺]_o（o）溶液（不添加Ca²⁺，1毫摩尔⁻¹EGTA和10μmol l⁻¹尼群地平）。

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图3

ROK抑制扩张肌源性收缩

Y27632-的代表性痕量和浓度-响应关系(A类和B类；n个=5）和H1152(C类和D类；n个=5）100 mmHg下的膨胀。数据表示为平均值±s.e.m（标准电气）.

图4表明Y27632和H1152抑制RCA的肌源性反应。每个血管段在20至120 mmHg的压力范围内经历三个连续的20 mmHg升压系列：（1）对照溶液，（2）Y27632（1μmol l l⁻¹；n个=5个血管）或H1152（0.3μmol l⁻¹；n个=5条血管）（即实现约80%的肌源性收缩抑制；图3)和（3）零[Ca²⁺]_o（o）解决方案。代表性记录和平均数据图4结果表明，当压力超过40 mmHg时，对照溶液的直径保持不变或减小，而在Y27632或H1152中观察到膨胀。零[Ca中被动膨胀之间的差异²⁺]_o（o）控制或存在ROK抑制剂时的直径是每个压力下主动肌源性收缩的程度(图4C类和如果). 与对照组相比，Y27632和H1152的主动收缩减弱表明韩国参与了该病。

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图4

通过抑制ROK抑制肌源性反应

Y27632的影响(A类–C类；n个=5）和H1152(D类–如果；n个=5）关于RCA肌源性反应。压力引起的动脉直径的典型变化(A类和D类)和平均直径（±s.e.m.公司。)–压力关系(B类和E类)对于10–120 mmHg的克雷布斯生理盐水（对照），1μmol l⁻¹Y27632或0.3μmol l⁻¹H1152和零[Ca²⁺]_o（o）解，以及平均主动收缩-压力关系±Y27632(C类)或±H1152(如果). *显著不同(P（P）<0.05）。

MYPT1和LC₂₀加压动脉中的磷酸蛋白水平升高

压力和韩国抑制对MYPT1和LC水平的影响₂₀通过Western blot分析研究磷酸化。我们采用了直径稳定的血管段（约10分钟后），步骤为从10 mmHg到10、60或100 mmHg±H1152（0.3μmol l）⁻¹)在闪蒸冻结之前，使用中所示的压力协议图5选择这些压力是因为10 mmHg是完全放松状态，60和100 mmHg刚好高于肌源性收缩阈值，接近RCA的生理压力上限体内(海斯塔德，2001). CPI-17磷酸化分析采用了类似的压力方案，但根据激动剂（例如。季莫普洛斯等。2007).

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图5

用于MYPT1和LC分析的动脉压力方案和代表性直径记录₂₀磷酸化

在不存在（对照）或存在0.3μmol l l的情况下，对常用步长为10至80 mmHg的双级压力方案（顶部）进行代表性直径测量，然后再测量到10、60或100 mmHg⁻¹H1152闪蒸前。比例尺表示10分钟。开口和实心圆圈/正方形分别表示控制段和H1152段的直径测量时间；圆圈代表80毫米汞柱，正方形代表10毫米汞柱、60毫米汞柱或100毫米汞柱。CPI-17分析使用了类似的方案，但在10、60或100 mmHg下3分钟后，组织会瞬间冻结。箭头表示添加H1152的时间。

限制检测到的MYPT1、CPI-17和LC的变化₂₀磷酸化，有必要确保分析中所用血管的肌生成性具有可比性。零度被动膨胀量[Ca²⁺]_o（o）因此，由于闪冻，无法评估主动收缩的程度。因此，在初始压力阶跃至80 mmHg时，没有表现出强烈肌源性反应的血管被丢弃（参见图5). 通过比较步骤中各组的平均直径为80 mmHg和后续步骤中的平均直径10、60或100 mmHg与肌源性反应评估中获得的值，验证血管质量(图4). ROK抑制分析中使用的各组在80 mmHg下的直径相似，如图6A类（每组21–23条血管），与肌源性反应评估中观察到的血管无差异（阴影条；数据来自图4E类). 此外，10、60和100 mmHg±H1152 in时的直径图6B类与在相同条件下进行的肌源性反应实验（阴影条；数据来自图4E类). 评估CPI-17磷酸化的实验也获得了类似的结果（数据未显示）。因此，我们确信，这些实验中使用的血管的肌源性反应是可比较的。

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图6

用于生化分析的血管平均动脉直径

A类，平均直径±s.e.m.公司。对于10、60和100毫米汞柱的最终压力组，在对照（开放条形）和含H1152（黑色条形）溶液中初始步骤至80毫米汞柱（在图5分别通过开放圆圈和填充圆圈）。阴影条是在80 mmHg的控制条件下的平均直径（数据来自图4).B类，平均直径±s.e.m.公司。在闪蒸冻结之前图5分别在10、60和100 mmHg下，通过控制（开条）和H1152处理（黑条）动脉的开口和填充方块。阴影条是指对照溶液和含H1152溶液在10、60和100 mmHg时的直径（数据来自图4)*显著不同(P（P）<0.05）。

先前在MYPT1上发现了两个韩国磷酸化位点T697和T855(冯等。1999；河曲等。1999；贝拉斯科等。2002；史蒂文森等。2004；穆兰伊等。2005；平野，2007). 在这里，我们使用了两种仅在T697或T855磷酸化时识别MYPT1的磷酸特异性多克隆抗体(威尔逊等。2005).图7显示了磷酸化MYPT1-T697和-MYPT1-T855的代表性Western blot，以及每个样品（6个血管/通道）的相应考马斯蓝染色肌动蛋白含量，以及平均值±s.e.m.公司。标准化磷酸蛋白作为压力的函数±H1152(n个=3个斑点；来自16条血管的蛋白质）。在10 mmHg时，RCA在T697和T855都显示出MYPT1磷酸化的基础水平(图7A类–D类). 与10 mmHg相比，T855的磷酸化程度在60和100 mmHg时显著增加(图7C类和D类)，但T697的磷酸化不受压力影响(图7A类和B类). 此外，H1152显著降低了MYPT1-T855磷酸化的基础（10mmHg）和压力诱导的增加(图7C类和D类). 在存在ROK抑制剂的情况下，未观察到磷酸化MYPT-T697的变化(图7A类和B类).

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图7

MYPT1磷酸化随压力和ROK抑制的变化

磷酸化T697-MYPT1的代表性三步Western blot(A类)和磷酸-T855-MYPT1(C类)以及在10、60或100 mmHg±H1152（0.3μmol l⁻¹).B类和D类表示平均水平±S.E.M.公司。(n个=3）分别将磷酸-T697-和磷酸-T855-MYPT1归一化为考马斯蓝肌动蛋白，每个印迹在10 mmHg时的对照值设置为1*显著差异(P（P）<0.05）从各压力下的控制值**显著差异(P（P）<0.05）从10 mmHg的控制值#显著差异(P（P）<0.05）与60mmHg时的值相比。

磷酸-MYPT1-T855的压力依赖性增加如图7预计会抑制MLCP活性，同时引起对H1152敏感的LC增加₂₀60和100 mmHg时的磷酸化。图8A类（6艘船/航道）显示LC的典型Western印迹₂₀使用Phos-tag SDS-PAGE分离磷酸化和非磷酸化蛋白质获得(武也等。2008). LC的单磷酸化（1-P）₂₀很明显，但未检测到二磷酸化。图8B类显示平均水平±s.e.m.公司。磷酸化LC₂₀占总信用证的百分比₂₀10、60和100 mmHg±H1152的蛋白质(n个=8个斑点；每个压力下总共21–23个容器）。磷酸化LC₂₀从10 mmHg时的24.3±2.6%增加到60和100 mmHg分别为39.3±2.8%和50.6±3.3%(图8B类). LC中的压力依赖性增加₂₀用H1152处理后，60和100 mmHg时的磷酸化显著降低。

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图8

信用证变更₂₀加压磷酸化和ROK抑制

代表性Western印迹(A类)和平均水平±s.e.m.公司。(B类)磷酸化LC₂₀占总信用证的百分比₂₀在10、60和100 mmHg±H1152（0.3μmol l⁻¹)带有未磷酸化（0-P）和单磷酸化（1-P）LC₂₀用Phos-tag SDS-PAGE分离(n个= 8). *显著差异(P（P）<0.05）从各压力下的控制值**显著差异(P（P）<0.05）从10 mmHg的控制值#显著差异(P（P）<0.05）。

抑制PKC减轻肌源性收缩

图9表明GF109203X对PKC的抑制作用（3μmol l⁻¹)和Gö6976（10μmol l⁻¹)抑制肌源性反应。所使用的浓度是根据其阻断激动剂诱导的收缩来选择的(季莫普洛斯等。2007). 容器在20至120 mmHg之间经历了三系列连续压力步骤：（1）对照溶液，（2）GF109203X(n个=6艘船）或Gö6976(n个=6个容器）和（3）零[Ca²⁺]_o（o）解决方案。图9结果表明，这两种PKC抑制剂均能阻断压力诱导的动脉直径维持，并减少主动性肌源性收缩。

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图9

PKC抑制对肌源性反应的抑制作用

GF109203X的影响(A类–C类；n个=6）和Gö6976(D类–如果；n个=6）关于RCA肌源性反应。压力引起的动脉直径的典型变化(A类和D类)和平均直径（±s.e.m.公司。)–压力关系(B类和E类)对于10–100 mmHg的克雷布斯生理盐水（对照），3μmol l⁻¹GF109203X或10μmol l⁻¹Gö6976和零[Ca²⁺]_o（o）溶液，以及平均有效收缩-压力关系±GF109203X(C类)或±Gö6976(如果). *显著不同(P（P）<0.05）。

压力不会诱导CPI-17磷酸化，PKC抑制不会影响MYPT1和LC₂₀磷酸化

图10A类显示CPI-17的代表性免疫印迹和平均值±s.e.m.公司。用佛波醇12,13-二丁酸酯（PdBu；2μmol l⁻¹)以及在10、60和100 mmHg的压力容器中。通过Phos-tag SDS-PAGE分离未磷酸化和单磷酸化CPI-17(武也等。2008). PdBu治疗显著增加了磷酸化CPI-17的水平（以CPI-17总量的百分比表示）。然而，与加压动脉中的10 mmHg相比，在60和100 mmHg时未观察到磷酸化CPI-17的变化(图10A类). 我们也在步进至100 mmHg后0.5分钟的额外时间点评估了磷酸化CPI-17，以确保我们没有错过CPI-17磷酸化的快速变化(季莫普洛斯等。2007). 在这个时间点，也检测到磷酸化-CPI-17类似缺乏变化（数据未显示）。我们考虑了PKC抑制剂治疗影响ROK激活导致MYPT1和LC改变的可能性₂₀磷酸化。在没有或存在GF109203X（3μmol l⁻¹)用于测定磷蛋白水平。虽然PKC抑制剂诱导扩张，但LC水平没有变化₂₀(n个=5对），MYPT1-T697(n个=3对）或MYPT1-T855(n个=3对）与对照血管相比的磷酸化(图10B类–E类).

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图10

CPI-17磷酸化与压力或磷酸化-MYPT1和LC缺乏变化₂₀PKC抑制

A类，代表性Western blots和平均水平±s.e.m.公司。用PdBu（2μmol l）治疗的动脉中磷酸化CPI-17占总CPI-17的百分比⁻¹)以及在10、60和100mmHg下用Phos标签SDS-PAGE分离的未磷酸化和磷酸化CPI-17的动脉(n个= 3).B类，压力±GF109203X（3μmol l）下直径的代表性轨迹⁻¹; GF）用于分析CPI-17、MYPT1和LC的组织₂₀磷酸蛋白水平。C类100 mmHg±GF109203X（3μmol l⁻¹; GF）和平均水平±s.e.m.公司。GF109203X处理血管中磷酸化-T697-MYPT1(n个=3）作为控制条件下水平的百分比(n个= 3).D类100 mmHg±GF109203X（3μmol l⁻¹; GF）和平均水平±s.e.m.公司。GF109203X处理血管中磷酸化T855-MYPT1(n个=3）作为控制条件下水平的百分比(n个= 3).E类，配对血管的代表性3步Western blot和平均水平±s.e.m.公司。磷酸化LC₂₀占总信用证的百分比₂₀100 mmHg±GF109203X（3μmol l⁻¹; GF）与未磷酸化（0-P）和单磷酸化（1-P）LC₂₀用Phos-tag SDS-PAGE分离(n个=每组5对动脉）。

讨论

这是第一项量化加压真阻力动脉中MYPT1和CPI-17磷酸化的研究。我们首次提供了MYPT1和LC磷酸化依赖ROK同时发生变化的直接生化证据₂₀在肌源性反应中增加跨壁压力。我们的研究结果得益于一种新的、高度敏感的方法的开发，该方法用于检测和定量来自加压RCA（～1μg蛋白质）的非常小的蛋白质样品中的MYPT1和CPI-17磷酸化，类似于以前用于定量磷酸-LC的方法₂₀肾传入小动脉(武也等。2008). 我们发现：（1）H1152以浓度依赖的方式抑制肌源性收缩；（2） 肌源性收缩压力升高与MYPT1和LC同时增加相关₂₀被H1152阻断的磷酸化；（3） 肌源性反应过程中的MYPT1磷酸化发生在T855，但不发生在T697；（4） PKC抑制剂减少了肌源性收缩，但随着压力的增加和压力诱导的MYPT1和LC，CPI-17没有变化₂₀磷酸化不受PKC抑制剂处理的影响。这些新发现对健康和疾病中通过跨壁压力控制动脉直径具有重要意义。

同时量化MYPT1、CPI-17和LC的能力₂₀在来自单一加压阻力动脉的小于1μg的蛋白质样品中进行磷酸化是一项重大的技术进步。信用证₂₀在10 mmHg的基础条件下和先前报道的大鼠前臂小动脉RCA的肌源性反应期间，磷酸化为类似的化学计量比(邹等。1995，2000). 之前显示拉伸可以增加LC₂₀基底动脉磷酸化的韩国依赖性(奥巴拉等。2006)，但未确定磷酸化MYPT1的参与程度。这里，增加了MYPT1-T855和LC₂₀磷酸化被证明与肌源性收缩有关，并被H1152对ROK的抑制所阻断。本研究的一个局限性是，韩国和MLCP活动没有直接测量。然而，基于以下发现，我们确信这两种酶都是被压力激活的。（1） 虽然Y27632抑制PKC(埃托等。2001；威尔逊等。2005)，我们发现H1152降低了肌源性收缩，其效力是Y27632的10倍。这一结果以及磷酸化MYPT1-T855随压力升高而增加与ROK的发病相一致。之前也发现RhoA易位到质膜，用于肠系膜动脉的肌源性收缩(迪布罗卡等。2007). （2） 我们并没有将H1152对肌源性反应的抑制归因于[Ca的下降²⁺]_我.戈基纳等。(2005)发现Y27632对ROK的抑制提高了[Ca²⁺]_我>60 mmHg。（3） MYPT1和LC的完全抑制₂₀H1152的磷酸化表明肌动蛋白细胞骨架动力学的改变(Cipolla&Osol，1998年；奇波拉等。2002；Gerthoffer，2005年；Corteling公司等。2007)不需要解释韩国抑制对压力诱导力产生的影响。细胞骨架确实可能改变，但H1152诱导LC减少₂₀60和100毫米汞柱下的磷酸化达到10毫米汞柱的基础水平可以完全解释肌源性收缩的丧失。（4） 磷酸化MYPT1、LC的同时变化₂₀在60毫米汞柱和100毫米汞柱下检测到由于压力增加导致的磷酸化和直径，以及随后的H1152处理。这与压力诱导的MLCP抑制作用一致。信用证₂₀尽管磷酸化-MYPT1-T855水平降低，但在10mmHg时磷酸化不受H1152的影响。这意味着H1152导致的MLCP活性增加不足以抵消LC的基础磷酸化₂₀通过MLCK、拉链相互作用蛋白激酶、p21活化激酶和/或整合素连接激酶(平野，2007年). 综上所述，这些数据与以下观点一致：跨壁压力增加引起ROK介导的MLCP抑制，改变MLCK-MLCP活性的平衡，并允许LC的净磷酸化₂₀并增加了部队生成。

Ca的观点²⁺ROK介导的MYPT1磷酸化导致的致敏作用有助于肌源性反应，这与戈基纳等。(2005)，但不是麦卡伦等。(1997).戈基纳等。(2005)观察到100时对Y27632的敏感性降低与α-毒素渗透RCA中的60 mmHg。相反，麦卡伦等。(1997)未检测到钙的变化²⁺在[Ca范围内压力增加时的灵敏度²⁺]_我0.001至60μmol l之间⁻¹然而，GTP不包括在麦卡伦等。(1997)，阻止此处描述的ROK和磷酸化MYPT1依赖机制的激活。GTP是G蛋白偶联受体信号传递和RhoA激活的必要辅因子，通过渗透制剂的α-毒素孔从胞浆中丢失(北泽等。1989). G公司_{2011年第2季度}-耦合受体最近被认为是大脑动脉肌源性反应中的机械传感器(Mederos y Schnitzler公司等。2008). 如果是这种情况，则在导致肌源性收缩的信号级联的多个步骤中可能需要GTP。

我们的研究结果表明，ROK介导的钙²⁺RCA中T855处的MYPT1磷酸化专门介导对压力的敏感性。T697的磷酸化抑制MLCP活性(冯等。1999)T855的磷酸化干扰MYPT1与肌球蛋白的结合(贝拉斯科等。2002)并抑制MLCP活动(穆兰伊等。2005). T855的参与与以前关于激动剂诱导的、ROK介导的钙的研究一致²⁺据报道，韩国的磷酸化作用仅在T855发生(北泽等。2003；史蒂文森等。2004；威尔逊等。2005). T697的磷酸化没有随压力升高而改变，H1152也没有改变。这表明T697不是ROK介导的RCA压力诱导血管收缩调节的重要位点。已知T697的磷酸化反应是对激动剂刺激的反应(北泽等。2000；小腿等。2002；穆尔西等。2003；奈罗等。2003；赫尔希等。2004；Neppl公司等。2009)但并非在所有制剂中或在T855磷酸化增加的所有情况下(北泽等。2003；史蒂文森等。2004；威尔逊等。2005). RCA中负责T697基础磷酸化的激酶尚待确定；潜在的候选者包括拉链相互作用激酶和整合素连接激酶(麦当劳等。2001；穆兰伊等。2002).

我们的数据表明，钙的PKC依赖机制²⁺涉及CPI-17和MYPT1的致敏作用不会促进RCA的肌源性反应。以前使用RCA和其他血管的研究将PKC抑制剂抑制肌源性反应归因于钙的调节²⁺敏化（例如。卡里贝等。1997；韦塞尔曼等。2001；拉高（Lagaud）等。2002；Jarajapu&Knot，2005年). 然而，这种观点是基于敏化的替代标记；未测定压力和PKC抑制对CPI-17和MYPT1磷酸化的影响。PKC介导的CPI-17磷酸化导致钙²⁺激动剂对几种血管和非血管平滑肌的致敏作用(埃托等。2001；季莫普洛斯等。2007；平野，2007). 例如，在股动脉暴露于苯肾上腺素后，观察到GF109203X敏感性CPI-17磷酸化在10秒内达到峰值，并在5分钟内缓慢下降～25%(季莫普洛斯等。2007). 在这里，尽管PKC抑制剂治疗降低了肌源性反应，但在压力升高后0.5分钟（100 mmHg）和3分钟（60和100 mmHg），我们无法检测到磷酸化CPI-17的变化。我们不会将此阴性结果归因于缺乏检测灵敏度或未能在压力升高后的适当时间测量磷-CPI-17。我们在Phos-tag SDS-PAGE分离未磷酸化和磷酸化CPI-17后进行三步免疫印迹的方法具有足够的灵敏度，可以解决PdBu治疗后磷酸化CPI-17增加30%的问题。此外，在与[Ca初始上升期一致的时间对动脉进行取样²⁺]_我，信用证₂₀压力导致的磷酸化和收缩(邹等。1995；达安吉洛等。1997；Osol公司等。2002)以及在激动剂治疗后磷酸化CPI-17升高期间(季莫普洛斯等。2007). PKC抑制剂可能阻断Ca²⁺通过干扰RhoA/ROK激活而致敏(坎达巴希等。2003). 例如，PKC可能磷酸化RhoGDI，导致GDI分离，Rho-GEF激活RhoA(梅塔等. 2001). 我们也未能确定GF109203X对MYPT1或LC的影响₂₀100 mmHg时的磷酸化。这些结果直接证明PKC依赖性钙²⁺通过MYPT1致敏不会促进肌源性反应。此外，LC缺乏变化₂₀PKC抑制剂存在下的磷酸化意味着PKC诱导的细丝调节或细胞骨架重组的阻滞可能参与，而不是离子通道活性的改变，[Ca]²⁺]_我和MLCK活动(麦卡伦等。1997；Cipolla&Osol，1998年；金等。2000；金子等。2000；摩根和冈帕迪亚2001；吉斯达尔等。2003；Wier&Morgan，2003年；沙比尔等。2004；卢克纳尔等。2004；威尔逊等。2005；Gerthoffer，2005年；维拉尔巴等。2008).

我们的研究结果表明，ROK介导的MLCP抑制对肌源性收缩至关重要，并表明调节压力诱导的ROK激活可能是调节肌源性反应的重要部位。在H1152处理导致MYPT1磷酸化缺失的情况下，MLCP活性足以完全抑制压力诱导的LC₂₀60和100 mmHg时的磷酸化和作用力生成。这意味着压力诱导的肌源性去极化导致VGCC激活，Ca²⁺流入量和增加的MLCK活动不足以改变MLCK–MLCP平衡以支持LC₂₀磷酸化和肌源性收缩。ROK对压力诱导的MLCP抑制似乎是RCA发生肌源性反应所必需的。鉴于MLCP抑制的这一重要作用，ROK信号通路和/或ROK的MYPT1磷酸化被内皮源性一氧化氮抑制，并被血管收缩剂激动剂激活，这一点非常重要(Davis&Hill，1999年；邹等。2000；埃托等。2001；索姆利奥和索姆利欧，2003年；斯瓦德等。2003；洛兰德等。2006；平野，2007；Neppl公司等。2009). 这些因素可能改变MLCP抑制水平，改变磷酸-LC₂₀–[钙²⁺]_我增强或抑制肌源性反应而不需要改变E类_米，加利福尼亚州²⁺流入或MLCK激活。Osol公司等。(2002)提示肌源性反应可分为三个不同的阶段：肌源性张力发展、肌源性活性和强迫扩张。40至60 mmHg之间肌源性张力的发展特点是大量去极化E类_米，标高[Ca²⁺]_我和因钙引起的收缩²⁺–钙调蛋白介导的MLCK激活(奥索尔等。2002). 然而，在E类_米或[Ca²⁺]_我与60至140 mmHg之间的肌源性反应期相关(Osol公司等。2002). 这意味着Ca²⁺-MLCK活性的依赖性增加对椎间压力生理范围内力产生的增加贡献不大。我们发现MYPT1和LC中对H1152敏感的增加₂₀磷酸化在60到100 mmHg之间表明ROK介导的钙²⁺敏化可能在肌源性反应反应阶段的力产生调节中起主要作用。小阻力容器永久暴露在透壁压力下体内并且处于肌源性激活的永久状态。钙的参与²⁺敏化作用提供了一种机制，可以通过最小和/或瞬时增加[Ca来增加力的产生²⁺]_我.这可以避免与其他Ca的干扰²⁺-依赖过程，最小化钙的能量消耗²⁺体内平衡和排除长期暴露于高[Ca的毒性效应²⁺]_我.最近的研究结果表明，压力升高引起Ca²⁺肌浆网（SR）以非同步波的形式在单个血管平滑肌细胞内释放（M.A.Hill未发表的关于托马斯特小动脉的观察结果，D.G.Welsh未发表的有关RCA的观察结果），如之前所示的激动剂诱导的[Ca升高²⁺]_我（例如。西永等。2009). 据推测，这些波与MLCK激活中的异步瞬态升高有关。MLCP抑制在这种情况下可能很重要，因为它可以降低LC的发生率₂₀去磷酸化。减缓LC₂₀由于钙的存在，去磷酸化可能会增加单个心肌细胞异步音调发育的重叠²⁺波和瞬时MLCK激活导致动脉壁内产生更大的平均力。

肌源性反应是心血管生理学中的一个关键机制，肌源性收缩异常是导致心血管疾病死亡率和发病率的重要因素。大量证据表明，在与增强肌源性反应性相关的心血管疾病中，如高血压，ROK活性升高(斯瓦德等。2003；Jarajapu&Knot，2005年；洛兰德等。2006). 目前的研究结果表明，这可能至少部分是由于MYPT1-T855磷酸化的改变和Ca²⁺灵敏度。这里描述的3步Western blot方法的未来应用将提供有关调节MYPT1和LC的压力依赖性信号通路的见解₂₀磷酸化，以及允许对生理和病理生理条件下抵抗动脉功能重要的其他蛋白质/磷酸蛋白进行定量。

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